誘導(dǎo)多能性干細胞重編程方法及應(yīng)用研究進展

盧電 謝英俊 孫筱放

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科研究所實驗部，廣東省產(chǎn)科重大疾病重點實驗室，廣東省普通高校生殖與遺傳重點實驗室（廣州510150）

誘導(dǎo)多能性干細胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）是通過在已分化的體細胞中表達特定的基因或特定基因產(chǎn)物等方式，以誘導(dǎo)體細胞的重編程而獲得可不斷自我更新且具有多向分化潛能的細胞。自2006年日本科學(xué)家YAMANAKA［1］報道通過外源表達4 個轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4 和c-Myc（稱為OSKM 因子）能夠?qū)Ⅲw細胞重編程為類似于胚胎干細胞的iPSC 以來，該技術(shù)成為了再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的又一研究熱點。近年來，隨著該領(lǐng)域研究的持續(xù)深入，研究方法的日益更新，人類iPSC 研究得到了蓬勃的發(fā)展。

目前國內(nèi)外對iPSC 研究的熱點一直集中在技術(shù)上如何實現(xiàn)對分化成熟的終末細胞高效安全地向iPSC 的成功轉(zhuǎn)化，如國內(nèi)中科院裴端卿團隊突破性利用尿液脫落細胞誘導(dǎo)成iPSC，其隨后更發(fā)現(xiàn)維生素C 可提高多能性干細胞的誘導(dǎo)效率達100 倍之多［2］。另外近年來，學(xué)術(shù)界對iPSC的話題則聚焦在對其臨床應(yīng)用（如疾病模型，干細胞療法和組織器官再生）的安全性及有效性的探討；我國《十三五國家戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃》（2016-2020）明確要求“構(gòu)建基于干細胞與再生技術(shù)的臨床醫(yī)學(xué)新模式，持續(xù)深化干細胞與再生技術(shù)臨床應(yīng)用”。基于此，本文主要在回顧iPSC 研究歷程的基礎(chǔ)上，對近年iPSC 重編程方法的革新及其臨床應(yīng)用進行綜述。

1 重編程載體的選擇

自從2006年鼠iPSC 和2007年人iPSC 成功獲得以來［1，3］，研究人員一直在努力優(yōu)化重編程因子在細胞中的傳遞方法。在早期的實驗中，基因組整合病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒是最常見的載體，由于一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞依賴于細胞分裂狀態(tài)，因此相對而言，對分裂和非分裂細胞均有感染作用的慢病毒用于重編程的細胞范圍更加廣泛［1，3］。雖然基因組整合病毒載體的方法為iPSC 的生成提供了最初的技術(shù)，但其隨機整合現(xiàn)象可能導(dǎo)致插入突變，干擾內(nèi)源基因的表達調(diào)控或在終末分化的細胞中被異常再激活。因此，研究者陸續(xù)開發(fā)了幾種非基因整合型的重編程方法。經(jīng)典的非整合型載體仙臺病毒和腺病毒可介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子基因在宿主細胞中瞬時表達，誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生多潛能性，獲得無病毒整合的iPSC［4-5］。此外，人類體細胞來源的iPSC 克隆亦可通過質(zhì)粒、piggyBac 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)、微環(huán)載體等［6-8］載體對體細胞進行重編程獲得，然而，使用這些載體的重編程效率比較低。近年來，非核酸類載體重編程方法研究也有了重大進展。經(jīng)修飾的mRNA、microRNA［9］和純化的重組蛋白已成功地將小鼠和人的成纖維細胞培養(yǎng)成iPSC。GUO 等［10］嘗試利用重組細胞穿透蛋白OCT4/KLF4/SOX2（PTD-OKS）和小分子混合物（VCFZ）進行非遺傳載體類重編程，成功地將人脂肪源性干細胞誘導(dǎo)為iPSC。非核酸類載體重編程方法不涉及外源性基因的強制表達，其誘導(dǎo)細胞的特征之一是低致瘤性，但是否真的低于轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)化的細胞尚未清楚。這需要將化學(xué)誘導(dǎo)的細胞移植到動物模型中，進一步在體內(nèi)評估其致瘤性。

目前，重新編程技術(shù)的最新進展集中于開發(fā)一種新方法，即不需要重編程因子進入細胞就可實現(xiàn)iPSC 的成功轉(zhuǎn)化。例如BLANCHARD 等［11］發(fā)現(xiàn)了一些能夠刺激細胞內(nèi)通路的抗體，這些通路最終會同重編程因子一樣激活靶基因。用這些對細胞表面起作用的抗體取代重編程中使用的轉(zhuǎn)錄因子，避免了c-Myc 等具有潛在致癌風險的基因進入細胞，并且消除了外來遺傳物質(zhì)隨意整合到基因組而破壞功能基因或激活致癌基因的可能性。盡管重編程技術(shù)目前面臨諸多技術(shù)難題，但隨著分子生物學(xué)與細胞生物學(xué)的迅猛發(fā)展，這些問題將有望得到破解。

2 重編程效率的提高和多能性的維持

雖然非整合病毒載體和質(zhì)粒等直接轉(zhuǎn)染均可重編程體細胞，但這些非整合型途徑所介導(dǎo)的重編程效率比整合型載體介導(dǎo)的重編程效率低幾個數(shù)量級。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多可以提高重編程效率的小分子，有些小分子甚至可以替代重要的重編程因子［12］。大量證據(jù)表明，包括培養(yǎng)基質(zhì)和鄰近細胞在內(nèi)的不溶性微環(huán)境直接調(diào)控核心多能基因的表達和染色質(zhì)的表觀遺傳修飾，從而影響重編程動力學(xué)。

2.1 小分子提高重編程效率 科學(xué)家研究了由Oct4、Sox2、Klf4 和c-Myc 控制的多潛能相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和相關(guān)生物過程。這些研究揭示了先天免疫、自由基生成活性氧反應(yīng)、缺氧、氧化DNA 損傷、p53 活化、衰老、凋亡、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和表觀遺傳修飾等與iPSC 的生成效率和多能性的維持緊密相關(guān)。通過調(diào)節(jié)上述生物代謝過程、信號通路和表觀遺傳修飾相關(guān)的可溶性和非免疫原性小分子可以優(yōu)化重編程過程［13］。用Rho 相關(guān)激酶（ROCK）抑制劑Y-27632 預(yù)處理植入前的人誘導(dǎo)多能干細胞來源的心肌細胞，能提高急性心肌梗死小鼠模型中心肌細胞的存活和移植［14］。LI 等［15］的研究表明，一種包含了cyclic pifithrin-a（p53 抑制劑）的分子復(fù)合物可以顯著提高人尿路來源細胞的重編程效率（170 倍以上）。

2.2 細胞外環(huán)境的優(yōu)化 除了上述的可溶性分子外，不溶性微環(huán)境，包括培養(yǎng)基物理化性質(zhì)和鄰近細胞的相互影響，對細胞的功能和命運也起著決定性的作用。

培養(yǎng)基質(zhì)的表面形貌直接影響細胞黏著斑的形成和細胞骨架的結(jié)構(gòu)和收縮性，進而觸發(fā)胞內(nèi)信號級聯(lián)事件，影響下游基因表達、細胞形態(tài)、貼壁、增殖、遷移和分化等一系列表型。KO 等［16］發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)皿上涂布規(guī)則納米顆粒有助于維持iPSC 的多能性，并在無飼養(yǎng)層細胞共培養(yǎng)的條件下促進iPSC 的增殖。WORTHINGTON 等［17］采用雙光子聚合技術(shù)打印不同特征尺寸的拓撲圖形，研究培養(yǎng)皿表面形態(tài)其對iPSC 分化的影響。他們發(fā)現(xiàn)與表面平滑的培養(yǎng)皿相比，小拓撲特征尺寸（1.6 μm）的培養(yǎng)表面促進iPSC 向外胚層分化，而大拓撲特征尺寸（8 μm）的培養(yǎng)表面抑制細胞自我更新。這些結(jié)果表明，微形態(tài)學(xué)介導(dǎo)的表觀基因組重構(gòu)可能有助于克服體細胞重編程目前的難題。

小鼠和人類干細胞的多能性受基質(zhì)硬度的調(diào)節(jié)。穩(wěn)定誘導(dǎo)多能性干細胞在無外源條件下的培養(yǎng)對產(chǎn)生臨床級治療細胞至關(guān)重要。CHEN 等［18］的研究結(jié)果表明，水凝膠的設(shè)計和細胞結(jié)合域的表面密度對于促進人類胚胎干細胞和iPSC 的增殖以及在長期無外源培養(yǎng)條件下維持這些細胞的多能性具有重要意義。據(jù)報道，將OSKM因子轉(zhuǎn)導(dǎo)后的鼠胚胎成纖維細胞培養(yǎng)在較軟的水凝膠（100 Pa）上，與更硬的水凝膠（≥1 kPa）相比，重編效率提高了兩倍。軟基質(zhì)通過激活上皮細胞-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化和增強多能性標記物的表達促進細胞重編程［19］。同樣，將鼠胚胎成纖維細胞嵌入到不同力學(xué)性能的三維水凝膠中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)硬度較小的水凝膠具有較高的重編程效率［20］。

細胞間相互黏附對于多能性干細胞生存和多能性維持有著舉足輕重的作用。在iPSC 傳代過程中，通常利用溫和的蛋白質(zhì)水解酶或者是機械力將細胞分散成小團以保護細胞間黏附。不同的細胞間相互作用驅(qū)動多種干細胞反應(yīng)，包括促進增殖和自我更新以及誘導(dǎo)分化等［21］。Rho 相關(guān)激酶抑制劑Y-27632 通過減弱肌動蛋白-肌球蛋白之間的收縮，避免肌動蛋白-肌球蛋白的過度收縮引起的細胞凋亡，從而提高急性心肌梗死小鼠模型中心肌細胞的存活和移植［12］。然而針對iPSC 重編程效率的提高和多能性維持的研究仍有賴于多學(xué)科領(lǐng)域的專家進行通力合作，以有望在不久的將來得到解決。

3 iPSC 在疾病模型中的應(yīng)用

iPSC 的臨床應(yīng)用現(xiàn)在處于再生醫(yī)學(xué)研究的最前沿并且可以分為3 類：疾病模型（用于疾病機制的研究和罕見病藥物篩查的研究），干細胞療法和組織器官再生。

在疾病建模應(yīng)用中，iPSC 為理解人類疾病的遺傳基礎(chǔ)提供了一種非常寶貴的模型系統(tǒng)。利用誘導(dǎo)多能干細胞建立疾病模型的優(yōu)勢在于：其攜帶與病人完全相同的遺傳物質(zhì)，具有與胚胎干細胞類似的克隆形成能力、自我更新和多能分化潛能，而且克服了臨床上特定細胞取材在倫理和技術(shù)方面的限制。目前，最常使用的動物模型不但涉及倫理問題且與人類存在遺傳背景、生理及藥物代謝等方面的差異，因此難以用來充分闡明人類疾病背后的詳細分子機制。iPSC 技術(shù)代表了一種新方法，它們可以擴增到非常大的數(shù)量并直接分化生成各種疾病的患者特異性組織模型，并且可針對不同患者建立特異性iPSC 疾病模型，篩選出具有針對性的藥物，真正實現(xiàn)個體化治療。目前，神經(jīng)系統(tǒng)疾病［22-23］、心血管疾?。?4-25］、呼吸系統(tǒng)疾?。?6-27］、血液系統(tǒng)［28］、泌尿系統(tǒng)疾?。?9］、肝?。?0］和眼科疾?。?1］等許多疾病特異性的iPSC 細胞系已被成功建立，這些細胞可用于臨床疾病治療，藥物開發(fā)和基礎(chǔ)研究。LANG 等［22］對攜帶帕金森疾病風險變異的iPSC 誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元進行高分辨率單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，重建了由基因表達改變導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)軸，并發(fā)現(xiàn)去乙?；? 是帕金森疾病進展的上游調(diào)節(jié)因子。人iPSC 分化的心肌細胞與目前的原代心肌細胞模型相比，心肌細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和收縮力沒有顯著差異，并對大多數(shù)作用于心臟的藥物有類似反應(yīng)［25］。SUGIMURA 等［28］首次利用7 個轉(zhuǎn)錄因子，將成體細胞來源的iPSC 轉(zhuǎn)化為造血干細胞，其與天然造血干細胞具有十分相似的特性。這種造血干細胞在模擬人類遺傳性血液病，以及評估基因治療載體或藥物恢復(fù)造血功能的療效方面具有廣闊的前景。為了了解乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的感染機制并開發(fā)有效的抗HBV藥物，SAKURAI 等［30］建立一個iPSC 誘導(dǎo)來源的肝細胞樣細胞（iPSC cell-derived hepatocyte-like cells，iPS-HLCs）模型。在接種HBV 后，iPS-HLCs 中HBV 蛋白和病毒RNA 表達顯著升高，抗HBV 藥物恩替卡韋等能顯著抑制iPS-HLCs 中HBV 的感染，這說明iPS-HLCs 可以模擬體外HBV 感染狀態(tài)。SA 等［27］將誘導(dǎo)多能干細胞分化的內(nèi)皮細胞、特發(fā)性肺動脈高壓患者的肺動脈內(nèi)皮細胞與正常對照組進行比較，其粘附、遷移、存活和管形成能力均有相似程度的降低，BMPR2 和下游信號通路及膠原蛋白IV 表達均降低，且兩者對彈性蛋白酶抑制劑ElafinElafin 和免疫抑制劑FK506 的反應(yīng)類似，這些研究表明誘導(dǎo)多能干細胞來源的內(nèi)皮細胞為特發(fā)性或遺傳性肺動脈高壓病后續(xù)治療藥物篩查提供了一種良好的供體。

4 iPSC 的干細胞療法

在干細胞治療應(yīng)用中，分離的iPSC 中的遺傳缺陷可首先通過基因靶向治療，然后誘導(dǎo)細胞分化為目標祖細胞或功能細胞，這些自體細胞可以通過不同的方法傳遞到患者的損傷部位，以加速組織修復(fù)。老年性黃斑變性和相關(guān)的黃斑營養(yǎng)不良是導(dǎo)致視力喪失的主要原因。2014年，REARDON 等［32］進行了第一次基于iPSC 療法的人體試驗，他們將病人iPSC 來源的視網(wǎng)膜色素上皮層植入70 歲患有老年性黃斑變性的女性患者的右眼。該療法阻止了患者的黃斑變性并改善了視力。但是，隨后的臨床試驗因第2 例患者來源的iPSC 發(fā)生了兩個基因突變而被推遲［33］。2017年3月，MANDAI 等［34］將誘導(dǎo)多能性干細胞來源的視網(wǎng)膜色素上皮細胞片成功移植于患者黃斑下，并在術(shù)后1年證實了移植的有效性和安全性，盡管囊性黃斑水腫仍然存在，但患者最佳矯正視力已穩(wěn)定，這表明iPSC 細胞療法至少延緩了該疾病的退行性影響。最近的一項臨床前試驗表明，人類iPSC 細胞來源的中腦多巴胺能祖細胞在神經(jīng)毒素MPTP 處理的靈長類帕金森疾?。╬arkinson′s disease，PD）模型中存活下來并發(fā)揮作用，經(jīng)過2年的觀察，組織學(xué)研究表明與健康個體一樣，成熟的多巴胺能神經(jīng)元將致密的神經(jīng)突延伸至宿主紋狀體，根據(jù)分數(shù)分析和錄像記錄，移植后猴子的自發(fā)運動增加，而且移植物沒有引起明顯的免疫反應(yīng)，也沒有在大腦中形成腫瘤。這項使用靈長類動物模型的臨床前研究表明，人類iPSC 細胞來源的多巴胺能祖細胞有望在臨床上用于PD患者的治療［35］。雖然iPSC 在臨床治療上具有極大的前景，但真正在臨床上實現(xiàn)該療法還存在許多障礙需要跨越，如培養(yǎng)方案、移植方法、腫瘤原性和免疫原性的安全性保證等。

5 iPSC 在組織或器官再生中的應(yīng)用

組織或器官再生應(yīng)用探索了iPSC 的多譜系分化潛能，通過在合適的細胞外微環(huán)境中加入特定生物物理和生物化學(xué)誘導(dǎo)因子，使細胞誘導(dǎo)分化為有功能的三維組織或器官。與二維單層細胞模型不同，三維類組織器官經(jīng)歷了多譜系分化，形成異質(zhì)細胞群，自我組織形成復(fù)雜的組織樣結(jié)構(gòu)，從而建立一個與二維培養(yǎng)相比在生理學(xué)上更接近疾病原型的微環(huán)境［36］。此外，由于從iPSC 獲得的三維類器官可在體外培養(yǎng)，并且可以操縱其小環(huán)境成分，如信號通路、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控因子等，因此比動物模型在模擬人類疾病方面更具優(yōu)勢。在心血管方面，有文獻報道了一種生物三維打印血管化組織模型，為藥物管理和毒性分析提供了相比于二維培養(yǎng)細胞更精準的模型［37］。HALE 等［36］建立了誘導(dǎo)多能干細胞來源的可以體外模擬人足細胞病和篩選足細胞毒性藥物的三維人體腎小球類器官。AMIRI 等［38］證明了iPSC 來源的類器官可以在分子水平上模擬胎兒5 到16 周大腦皮層的發(fā)育狀況。當然，因為目前幾乎無法人為控制細胞如何自組織成類器官，所以這些研究產(chǎn)生的類器官不能保證外形尺寸、細胞組成、表型和分子特征的精確復(fù)制，因此難以進行治療質(zhì)量和安全性控制［39］。雖然最近在更好地控制類器官來源和標準化方面取得了進展［40］，但要實現(xiàn)嚴格的規(guī)范制造還需要更多的努力。

綜上，iPSC 不僅具有類似于胚胎干細胞的無限增殖和分化多能性特征，而且突破了胚胎干細胞的免疫排斥和倫理問題等應(yīng)用限制，為人類醫(yī)療手段突破現(xiàn)有的瓶頸提供了解決方案。目前，雖然iPSC 技術(shù)發(fā)展迅猛，但是該領(lǐng)域的臨床研究才起步不久，iPSC 的臨床應(yīng)用仍受到以下幾個方面的限制：（1）如何高效獲得安全的、高純度的iPSC；（2）如何定向誘導(dǎo)多能干細胞向某一特定類型的細胞分化并能在新的組織環(huán)境中承擔成熟細胞的功能；（3）iPSC 在臨床治療上的有效性和安全性還需繼續(xù)觀察；（4）如何進一步制定臨床應(yīng)用上的標準和規(guī)范以及臨床毒理和藥理的分析方法和指標等。iPSC 技術(shù)仍然在不斷發(fā)展，iPSC 的出現(xiàn)為“疾病特異性”和“病人特異性”的療法帶來了希望，期盼未來的研究能突破這一領(lǐng)域的臨床瓶頸，早日迎來iPSC 的個性化醫(yī)療時代。