常用血清學(xué)診斷方法之凝集反應(yīng)

畢長紅

（吉林省德惠市動物疫病預(yù)防控制中心，吉林 德惠 130300）

習(xí)慣上把體內(nèi)的抗原抗體反應(yīng)稱為免疫反應(yīng)，體外的抗原抗體反應(yīng)因為主要依靠于存在于血清中的抗體來進行，所以稱為血清學(xué)反應(yīng)。

1 血清學(xué)反應(yīng)的特點

抗原抗體反應(yīng)具有比較嚴格的特異性。例如布氏桿菌的抗原只能與布氏桿菌的抗體發(fā)生反應(yīng)；破傷風(fēng)毒素只能與破傷風(fēng)抗毒素反應(yīng)等。

合適的比例。一定量的抗原只能與一定量的抗體結(jié)合才出現(xiàn)可見反應(yīng)。一般認為抗原分子是多價的，可以結(jié)合多個抗體分子（一般可結(jié)合3～6 個抗體分子），而抗體分子是雙價的，可與兩個抗原分子結(jié)合，只有兩者比例合適，才能構(gòu)成較大的集團，發(fā)生可見的凝集或沉淀反應(yīng)。

可逆性?？乖贵w結(jié)合是表面分子的結(jié)合，具有相對穩(wěn)定性。在某種情況下，能出現(xiàn)可逆反應(yīng)。例如毒素和抗毒素結(jié)合后仍可將其完整的分離開，并不影響毒素的毒性。

2 實驗方法

2.1 直接凝集反應(yīng)（細菌凝集反應(yīng)）

有玻片法和試管法兩種。玻片法是將已知的免疫血清（或待檢血清）與未知的抗原（或已知的抗原）各1 滴，在玻片上混合，晃動玻片1～2 min，出現(xiàn)可見的凝集現(xiàn)象者為陽性反應(yīng)。在獸醫(yī)實踐工作中，常用于傳染病的診斷，如布氏桿菌病及雞白痢等。此外，還可用于各型沙門氏桿菌的定性。試管法通常用已知抗原檢查待檢血清中相應(yīng)抗體的有無及其含量（凝集價）。在一系列試管中，將被檢血清用生理鹽水作倍比稀釋，各加入等量已知抗原，以最高稀釋度仍有明顯凝集現(xiàn)象者為該被檢血清的效價。本法也常用于布氏桿菌及馬副傷寒等病的診斷。

2.2 間接凝集反應(yīng)

可溶性抗原與其相應(yīng)的抗體不能發(fā)生肉眼可見的凝集反應(yīng)，若將其吸附在顆粒性物體表面（稱為致敏）再與相應(yīng)抗體結(jié)合，便可出現(xiàn)可見的凝集現(xiàn)象，稱為間接凝集反應(yīng)。若用紅細胞作為載體，便稱為間接血細胞凝集試驗（簡稱間接血凝）。本法敏感性極高，能測出極微量的抗體，獸醫(yī)工作中常用來檢查炭疽桿菌病、鉤端螺旋體病等多種畜禽傳染病的診斷和鑒定菌型的工作中。

2.2.1 紅細胞懸浮液的準(zhǔn)備

無菌采取綿羊脫纖維血，用pH 7.2磷酸鹽緩沖液洗滌3次，制成3%紅細胞懸浮液。為了提高紅細胞同抗原的結(jié)合能力，在敏化前先經(jīng)鞣酸處理或在致敏時加入重偶氮聯(lián)苯胺。為了延長致敏紅細胞的保存時間，可在敏化之前或之后做醛化處理。

醛化處理：紅細胞懸浮液100 mL，加甲醛溶液40 mL，置37 ℃水浴中90 min～2 h，取出用生理鹽水洗滌3～4 次，最后制成3%紅細胞懸浮液，。

鞣酸化處理：紅細胞懸浮液加等量的鞣酸生理鹽水溶液（1：30 000），置37 ℃水浴中15 min，取出用生理鹽水洗滌2～3次，最后制成3%紅細胞懸浮液。

2.2.2 紅細胞敏化

取抗原與3%紅細胞懸浮液（經(jīng)醛化和鞣化處理）等量混合，置37 ℃水浴中15 min，取出用磷酸緩沖液（加有1%兔血清，pH 7.2）洗滌3次，最后制成3%紅細胞懸浮液，即為致敏紅細胞液。

2.2.3 被檢血清

以常法獲得血清，以生理鹽水做1：5 稀釋，在56 ℃水浴中滅活30 min。

2.2.4 操作方法

取有凹孔的塑料板一塊（亦可用小試管）按規(guī)定將不同稀釋度的被檢血清加入各凹孔中，每孔加入已致敏的紅細胞懸浮液一滴，混勻，置37 ℃溫箱中1～2 h后觀察結(jié)果。

2.2.5 判定結(jié)果

紅細胞在孔底形成不規(guī)則的網(wǎng)狀凝集物為陽性反應(yīng)。紅細胞沉降于孔底呈圓點狀，無凝集現(xiàn)象為陰性反應(yīng)。

2.3 病毒的血細胞凝集和血細胞凝集抑制實驗

有些病毒（如流感病毒、雞新城疫病毒）與動物紅細胞混懸液混合后能使紅細胞發(fā)生凝集，但這種凝集作用可為相應(yīng)的抗體所抑制。因此，可以用已知的免疫血清（抗體）鑒定未知的病毒（抗原）。亦可以用已知的病毒（抗原）來檢查病畜血清中的抗體和抗體的抑制價。前者稱為血細胞凝集試驗，后者稱為血細胞凝集抑制實驗。獸醫(yī)工作中常用于診斷雞新城疫等病。

3 影響凝集反應(yīng)的因素

電解質(zhì)：凝集反應(yīng)必須有適量電解質(zhì)參加。實驗中常用生理鹽水來稀釋血液或細菌懸液，但過多的鹽分能產(chǎn)生“鹽凝集”（氰化鈉增到一定濃度時，即使血液沒有抗體，亦能使細菌懸液發(fā)生凝集）。

酸堿度：凝集反應(yīng)以在pH 6～8 的環(huán)境中進行最合適，若偏酸性，達到了細菌蛋白的等電點（pH 4.3）時，即或在無相應(yīng)抗體存在的情況下，細菌亦能發(fā)生凝集現(xiàn)象，稱為“酸凝集”。

溫度：不同的凝集反應(yīng)對溫度的要求亦不相同，有的在4 ℃，有的在室溫，有的在37 ℃下進行反應(yīng)。一般情況下，溫度從0～30 ℃凝集反應(yīng)的速度隨溫度的升高而迅速增加，增高溫度可促進抗原顆粒的分子運動，使抗原抗體的分子互相撞擊粘著的機會增多，因而加速凝集塊的形成。

振蕩：混合物的振蕩可增加抗原抗體分子間的撞擊，加快反應(yīng)速度。

抗原和抗體的比例：在凝集反應(yīng)中，抗原抗體的比例最適當(dāng)時，反應(yīng)出現(xiàn)最好?？贵w濃度過高時反而不出現(xiàn)凝集，這種現(xiàn)象稱為前帶現(xiàn)象。