不同濃度葛根素對G6PD缺乏癥患者紅細胞的溶血率及H2O2耐受力影響

陳旖鹛，黃思聰，蔡志濤，李萬根，嘉紅云

(1廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院,廣州510260；2東莞康華醫(yī)院)

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏癥作為全球常見的遺傳性人類酶缺乏病，是引起溶血性疾病的重要原因。當G6PD缺乏癥者服用具有氧化作用的藥物或食物時，可引起紅細胞內(nèi)的谷胱甘肽(GSH)嚴重降低，導致胞膜蛋白氧化損傷而誘發(fā)溶血，嚴重者可發(fā)生昏迷甚至休克[1]。葛根素注射液由于具有擴張冠狀動脈、改善缺血心肌的代謝[2]、降血糖血脂[3]等眾多藥理作用，是目前心血管疾病、2型糖尿病等慢性病患者常用的中成藥注射用制劑[4]。Wang等[5]曾報道多個由葛根素注射劑誘發(fā)的急性溶血案例，但現(xiàn)階段暫時沒有絕對證據(jù)證明葛根素誘發(fā)G6PD缺乏癥溶血的報道，我們在臨床中觀察到兩例糖尿病合并G6PD缺乏者使用含葛根的中藥方劑治療糖尿病時出現(xiàn)嚴重溶血現(xiàn)象[6,7]，同時有報道[8]稱高濃度的葛根素會通過改變鼠紅細胞跨膜蛋白而導致溶血的發(fā)生。鑒于此，本研究中我們首先觀察了不同濃度葛根素對G6PD缺乏癥患者紅細胞溶血率的影響 ，然后用不同濃度H2O2溶液模擬氧化損傷因素誘發(fā)G6PD缺乏癥患者紅細胞溶血，探討葛根素對G6PD缺乏癥患者紅細胞溶血率的影響及不同濃度葛根素對紅細胞H2O2耐受力的影響

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院門診2018年2～10月G6PD缺乏癥患者15例(觀察組)，均符合《第4版臨床檢驗操作規(guī)程》中的診斷標準，男6例、女9例，年齡24～48歲，G6PD活性(0.26±0.08)U/L，血清鐵及總膽紅素正常，總膽固醇2.7～5.0 mmol/L，甘油三酯<143 mg/dL；6例男性血紅蛋白(Hb) 110～156 g/L、MCV 82～96 fL，9例女性Hb 98～124 g/L、MCV 85～92 fL。排除白血病、腫瘤、慢性腎病、SLE、急慢性血管內(nèi)溶血疾病等。另隨機選取10例G6PD酶活性正常的健康體檢者為對照組，男6例、女4例，年齡23～49歲，G6PD活性(3.95±0.89 )U/L,血清鐵、總膽紅素、膽固醇、甘油三酯、Hb水平均正常。兩組性別、年齡比較，P均>0.05。

1.2 加入不同濃度葛根素注射液后兩組紅細胞溶血率的檢測 空腹抽取患者肘靜脈血，用0.9%氯化鈉注射液洗滌后，配制成5%的紅細胞懸液。以加入0.9%氯化鈉注射液的紅細胞懸液為陰性對照管，以加入蒸餾水的紅細胞懸液為陽性對照組。在觀察組和對照組紅細胞懸液中，分別加入濃度為1.15、1.35、1.55、1.75、1.95、2.15、2.35、2.55、2.75、2.95、3.15、3.35 mg/mL的葛根素注射液(新鄉(xiāng)東升制藥有限公司，批號1611/5111)，37 ℃孵育1 h后，1 500 r/min離心10 min，分光光度計在545 nm處測定各管上清液的吸光度(A)值，計算溶血率，溶血率=(A藥物-A陰性對照)/(A陽性對照-A陰性對照)×100%；觀察兩組開始溶血的濃度，開始溶血標準為溶血率大于5%。

1.3 不同濃度葛根素注射液對G6PD缺乏癥患者紅細胞H2O2耐受力的檢測 取觀察組紅細胞懸液分別加入加入終濃度為1.15 mg/mL的葛根素注射液(葛根素組)，0.9%氯化鈉注射液(NS組)。兩組分別加入濃度為8.1、9.0、9.9、10.8、11.7、12.6、13.5 mg/mL的H2O2溶液，37 ℃孵育1 h后，1 500 r/min離心10 min，測定溶血率。另取潔凈試管，以8.1 mg/mL的H2O2與觀察組紅細胞混合誘發(fā)溶血，同時分別加入濃度為0.6、0.75、0.90、1.05、1.20、1.35、1.50 mg/mL的葛根素注射液，37 ℃孵育1 h后，1 500 r/min離心10 min，測定溶血率。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度葛根素注射液加入后兩組紅細胞溶血率比較 觀察組加入葛根素注射液后，開始溶血時葛根素注射液濃度為(1.48±0.18)mg/mL，低于對照組的(1.69±0.21)mg/mL(t=2.622，P=0.015)。加入1.15、1.35、1.55、1.75、1.95、2.15、2.35、2.55、2.75、2.95、3.15、3.35 mg/mL的葛根素注射液，觀察組的溶血率分別為2.89%、4.74%、7.51%、13.62%、29.67%、49.66%、73.47%、85.70%、89.92%、95.11%、96.40%、96.88%，對照組分別為1.32%、2.12%、5.17%、5.92%、15.97%、21.25%、27.75%、38.70%、57.75%、71.32%、81.97%、88.98%，從加入的葛根素注射液濃度為1.75 mg/mL開始，隨著葛根素的增高，同一葛根素注射液濃度下觀察組溶血率高于對照組(P均<0.05)。

2.2 不同濃度葛根素注射液對G6PD缺乏癥患者紅細胞H2O2耐受力的影響 葛根素組加入濃度依次為8.1、9.0、9.9、10.8、11.7、12.6、13.5 mg/mL的H2O2溶液后溶血率分別為9.89%、12.49%、17.36%、25.03%、31.62%、42.08%、47.48%，NS組分別為10.43%、12.52%、20.73%、31.70%、44.76%、53.12%、65.33%。從H2O2濃度為9.9 mg/mL開始，隨著H2O2濃度遞增，葛根素組及NS組的溶血率均上升；在同一H2O2濃度下，葛根素組的溶血率均低于NS組(P均<0.05)。H2O2與觀察組紅細胞混合誘發(fā)溶血，同時加入濃度依次為0.6、0.75、0.90、1.05、1.20、1.35、1.50 mg/mL的葛根素注射液后溶血率分別為6.11%、5.95%、7.28%、11.81%、18.91%、29.48%、40.59%。觀察組中，葛根素注射液濃度在0.6～0.9 mg/mL之間的溶血率比較，P均>0.05，而從葛根素注射液濃度為1.05 mg/mL開始，G6PD缺乏癥的紅細胞溶血率反而隨葛根素注射液濃度的增高而增高(P均<0.05)。

3 討論

G6PD缺乏癥為X連鎖不完全顯性遺傳病，據(jù)估計目前世界上罹患G6PD缺陷者達4億多人。G6PD缺陷的基因在我國主要分布于黃河流域以南各省，發(fā)病率為4%～20%。紅細胞對氧化損傷的耐受能力很大程度上依賴于NAPDH的還原能力，其水平主要由G6PD決定，G6PD酶產(chǎn)生還原代謝物NADPH，具有抗氧化作用。同理，G6PD缺乏癥患者意味著其紅細胞容易受到氧化損傷的打擊而造成嚴重溶血。葛根素廣泛應用于缺血性心腦血管病、糖尿病的治療[4]，目前主要以注射劑的形式使用。由于葛根素的短消除半衰期和口服生物利用度差，經(jīng)常需要頻繁注射，隨著臨床的廣泛應用，發(fā)現(xiàn)該藥有溶血、過敏和肝、腎損害等嚴重不良反應，其中最嚴重的不良反應報告以急性血管內(nèi)溶血為主。雖然近年有學者發(fā)現(xiàn)聚乙二醇二氧化硅納米顆粒作為一種緩釋給藥系統(tǒng)，可延長葛根素半衰期和提高藥物生物利用度，改善血液相容性低溶血，減少由葛根素引起的溶血不良作用，但距離實際臨床應用尚有一段距離。由于目前學界內(nèi)還沒有常規(guī)針對葛根素血藥濃度的檢測方法，因此，對葛根素注射液在臨床上的安全應用濃度目前還沒有共識。G6PD缺乏癥患者紅細胞穩(wěn)定性不如正常細胞，前文提及臨床上我們觀察到2例G6PD缺乏者在使用含葛根素的方劑治療2型糖尿病時出現(xiàn)了嚴重的血管內(nèi)溶血[6,7]，由此引發(fā)我們探討葛根素注射液對G6PD缺乏者紅細胞溶血的影響。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G6PD缺乏癥患者紅細胞對遞增濃度的葛根素注射液抵抗力要低于正常紅細胞，且溶血度更高。葛根素注射液除了葛根素之外，主要輔料為丙二醇，根據(jù)既往文獻顯示，丙二醇的溶血危險來自高滲引發(fā)的紅細胞骨架破壞，而5%～10%的丙二醇溶液并不能引發(fā)細胞溶血，一般臨床使用的葛根素注射液，其輔料丙二醇的濃度遠達不到高滲溶血的程度，因此我們認為葛根素注射液對紅細胞的溶血作用還是主要由葛根素引發(fā)。G6PD缺乏患者紅細胞膜蛋白本身的穩(wěn)定程度由于GSH含量下降而遠低于正常紅細胞，同時研究[8]顯示葛根素對正常紅細胞的溶血作用主要是一種非氧化性紅細胞毒性反應，通過消耗細胞質(zhì)ATP直接或間接誘導血液毒性，引起溶血發(fā)生前紅細胞膜蛋白的降解;而G6PD缺乏的紅細胞由于膜蛋白的不穩(wěn)定性，相對正常紅細胞來說，對葛根素的耐受程度更低，因此高濃度的葛根素引起G6PD患者急性溶血的風險會相對更高，提示臨床對G6PD缺乏的患者使用葛根素注射液時要更為謹慎。

G6PD的缺乏無法提供大當量的還原力NADPH，且無法快速轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原態(tài)，影響紅細胞對氧化性物質(zhì)的抵抗能力，而且G6PD缺乏可導致血液中GSH含量下降。GSH作為多種抗氧化酶的還原當量的提供者，其濃度下降會影響紅細胞對外源氧化性物質(zhì)刺激的反應。因此氧化刺激是導致G6PD缺乏者溶血的重要原因。葛根素屬于黃酮類化合物，具有的多酚結(jié)構(gòu)提供的活潑質(zhì)子與自由基結(jié)合成較穩(wěn)定的產(chǎn)物，因而有較強的抗氧化作用。本實驗我們用H2O2溶液模擬氧化損傷因素誘發(fā)G6PD缺乏癥患者紅細胞溶血時，發(fā)現(xiàn)低濃度葛根素注射液的加入有助于提高紅細胞對氧化損傷的抵抗作用，使紅細胞溶血程度降低，結(jié)果與既往文獻[9,10]符合。朱慶磊等[9]使用豚鼠紅細胞研究葛根素的抗氧化性損傷作用時發(fā)現(xiàn)，在0.48～1.60 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，葛根素對H2O2誘發(fā)的紅細胞溶血有抑制作用，且具濃度依賴性。本研究結(jié)果顯示，在0.6～0.9 mg/mL濃度范圍內(nèi)，葛根素對H2O2誘發(fā)的溶血并無顯著影響，在1.05～1.50 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，G6PD缺乏癥患者紅細胞的溶血率反而與葛根素注射液濃度正相關(guān)，因此認為,低濃度葛根素注射液能提高G6PD缺乏癥患者紅細胞對H2O2的耐受能力，但葛根素注射液濃度1.05～1.50 mg/mL時，G6PD缺乏癥患者紅細胞溶血加重,可能由于G6PD缺乏癥患者的紅細胞對葛根素的耐受力弱于正常的紅細胞，因此在相近的濃度范圍內(nèi)，葛根素已經(jīng)促使患者的紅細胞發(fā)生溶血。

綜上所述，與健康體檢者的紅細胞相比，1.75～3.35 mg/mL的葛根素注射液增加G6PD缺乏癥患者紅細胞溶血率，即G6PD缺乏癥患者紅細胞對1.75～3.35 mg/mL的葛根素注射液的耐受力減低。H2O2濃度為9.9～13.5 mg/mL時，隨著H2O2濃度遞增，1.15 mg/mL葛根素可使G6PD缺乏癥患者紅細胞溶血率降低。低濃度(0.60～0.90 mg/mL)葛根素注射液能提高G6PD缺乏癥患者紅細胞對8.1 mg/mL H2O2的耐受能力，但葛根素注射液濃度為1.05～1.50 mg/mL時，G6PD缺乏癥患者紅細胞對8.1 mg/mL H2O2的耐受能力降低。低濃度的葛根素注射液雖然能提高G6PD缺乏癥患者紅細胞的抗氧化作用，但由于G6PD缺乏癥患者紅細胞膜蛋白的不穩(wěn)定因素，因此其安全用藥濃度要遠低于正常人，臨床針對G6PD缺乏癥患者使用葛根素注射液時要尤為注意預防急性溶血的發(fā)生。