原發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞差異表達(dá)circRNA、miRNA篩選和生物學(xué)功能及其相互作用分析

王瑩，郭雄，王民，楊益民，任志偉，尹思

(1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，西安710061；2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院)

原發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎(OA)是一種以軟骨退變和繼發(fā)性軟骨下骨增厚、骨贅形成和滑膜炎為特征的關(guān)節(jié)疾病，是全球范圍普遍存在的肌肉骨骼系統(tǒng)疾病，其病因復(fù)雜,涉及到遺傳生物學(xué)和生物力學(xué)，發(fā)病機(jī)制至今尚不明確。公認(rèn)的危險(xiǎn)因素包括既往關(guān)節(jié)損傷、年齡、性別、遺傳易感因素和機(jī)械應(yīng)力因素[1]。越來越多的研究證實(shí)，miRNA作用于OA軟骨細(xì)胞的靶基因，調(diào)節(jié)其表達(dá)過程，對(duì)軟骨細(xì)胞代謝、增殖、分化的信號(hào)通路及細(xì)胞外基質(zhì)合成與代謝產(chǎn)生影響。目前公開發(fā)表的與OA相關(guān)circRNA主要在ECM降解、軟骨細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和炎癥中發(fā)揮潛在作用，2018年Li等[2]探討了環(huán)狀RNA在骨關(guān)節(jié)炎中的潛在作用，指出 circRNAs-miRNAs-mRNAs軸在OA的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。2018年9月～2019年3月，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法篩選OA膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞差異表達(dá)的circRNA、miRNA，并進(jìn)行功能及代謝通路分析，同時(shí)應(yīng)用incromap軟件對(duì)差異表達(dá)的circRNA、miRNA進(jìn)行了相互作用分析，為探索OA的發(fā)病機(jī)制提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科住院OA患者5例，符合Western Ontario大學(xué)和McMaster大學(xué)用OA指數(shù)(WOMAC)進(jìn)行OA診斷的診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除任何有其他骨骼或關(guān)節(jié)疾病史的患者。患者均接受膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，術(shù)中取OA患者膝關(guān)節(jié)股骨髁軟骨。另選5例肢體毀損無法保肢而接受截肢的患者作為對(duì)照，術(shù)中取膝關(guān)節(jié)股骨髁軟骨。取材組織離體后立即用生理鹽水沖洗，修成直徑3～5 mm顆粒狀，標(biāo)記好每個(gè)組織標(biāo)本類型及編號(hào)后置于無菌生理鹽水或PBS中，12 h內(nèi)做細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2 OA膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞差異表達(dá)circRNA篩選 根據(jù)制造商產(chǎn)品使用說明用TRIzol法(Invitrogen, Gaithersburg, MD, 美國(guó))提取5例OA及正常對(duì)照膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的總RNA，采用 NucleoSpin RNA clean-up 試劑盒(MACHEREY-NAGEL,德國(guó))對(duì)總RNA進(jìn)行純化；使用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)進(jìn)行總RNA定量，用甲醛變性膠電泳檢測(cè)其完整性；RNA總量≥1 μg；所有軟骨組織樣品總RNA的A260/A280值均在1.82～2.05，樣品總RNA可見清晰的28 s和18 s條帶，且A260/280≥1.80；經(jīng)甲醛變性膠電泳檢測(cè)，RNA樣品電泳條帶清晰，28 s∶18 s rRNA條帶亮度≥2∶1，提示樣品總量、純度及完整性符合芯片表達(dá)譜實(shí)驗(yàn)要求。使用Nucleospin Extract Ⅱ(MN 公司，Cat. No. 740609.250)試劑盒，按照生產(chǎn)商操作指導(dǎo)步驟對(duì)每個(gè)樣本的總RNA采用隨機(jī)引物擴(kuò)增、然后反轉(zhuǎn)錄為熒光標(biāo)記的cRNA；標(biāo)記后的樣品按照CapitalBio表達(dá)譜芯片配套提供的雜交標(biāo)準(zhǔn)流程和配套試劑盒組裝好雜交倉，放在Agilent公司雜交爐中過夜雜交(16 h，20 r/min)，然后用洗脫試劑盒洗片；最后進(jìn)行芯片掃描：circRNA 芯片(CapitalBio Technology Human CircRNA Array v2, CapitalBio Corporation, 北京)包括170 340 個(gè)人類circRNA探針，圖像采集、數(shù)據(jù)分析等由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司完成。CapitalBio Technology Human CircRNA Array v2雜交掃描后的 tiff 格式圖片數(shù)據(jù)應(yīng)用Feature Extraction(v10.7) 軟件進(jìn)行預(yù)處理分析，將原始數(shù)據(jù)文件(.txt)導(dǎo)入Agilent GegeSpring軟件，進(jìn)行每個(gè)樣品的數(shù)據(jù)歸一化和質(zhì)量控制分析。用Cluster3.0軟件進(jìn)行Cluster分析及圖形化展示，進(jìn)行不同組間的差異比較。以差異倍數(shù)和P值為篩選條件，篩選不同組間差異表達(dá)的circRNA，差異倍數(shù)>2及P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 OA膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞差異表達(dá)miRNA篩選 將OA和正常對(duì)照膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的miRNA原始數(shù)據(jù)(下載自ArrayExpress，獲取號(hào)為：E-MTAB-3514)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后使用Quantile方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用經(jīng)驗(yàn)貝葉斯模型(eBayes),以P<0.05，差異倍數(shù)≥2或≤0.5為篩選條件，進(jìn)行OA和正常對(duì)照的miRNA差異分析。應(yīng)用miRror工具進(jìn)行差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測(cè)，使用KOBAS軟件對(duì)靶基因進(jìn)行GO及KEGG富集分析。

1.4 OA膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞差異表達(dá)circRNA及miRNA相互作用分析 應(yīng)用miRanda 軟件對(duì)差異表達(dá)的miRNA 進(jìn)行miRNA-circRNA相互作用預(yù)測(cè)分析。按照P<0.05和差異倍數(shù)≥2，挑選差異倍數(shù)從大到小排列的前10個(gè)circRNA和miRNA進(jìn)行相互作用分析，得到circRNA-miRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 OA和正常對(duì)照膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞差異表達(dá)的circRNA及功能、代謝通路 共篩選出1 380個(gè)表達(dá)差異的circRNA，與正常對(duì)照膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞比較，OA膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞上調(diào)表達(dá)的circRNA 215個(gè)，其中差異倍數(shù)5倍以上的有18個(gè)；下調(diào)表達(dá)CircRNA 1 165個(gè)，其中差異倍數(shù)5倍以上的有45個(gè)；大于60個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)的circRNA共有383個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)10個(gè)，下調(diào)表達(dá)373個(gè)。符合上述條件的上調(diào)及下調(diào)表達(dá)的前10位circRNA見表1。分子功能層面，差異表達(dá)的circRNA主要影響GTP酶激活劑活性(GO:0005096)、腺苷核糖核苷酸結(jié)合(GO:0032559)、鈣通道調(diào)節(jié)劑活性(GO:0005246)；細(xì)胞組成層面，主要與細(xì)胞外基質(zhì)成分(GO:0044420)、帶狀膠原纖維(GO:0098643)、纖維狀膠原蛋白三聚體(GO:0005583)；生物學(xué)過程層面，主要影響細(xì)胞成分形態(tài)發(fā)生(GO:0032989)、軟骨細(xì)胞發(fā)育(GO:0002063)和肢體發(fā)育(GO:0060173)。差異表達(dá)的circRNA經(jīng)KEGG 通路分析，共得出1 127條通路，按富集程度最有意義的通路與糖原生物合成(來自Biocyc數(shù)據(jù)庫)、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)(來自KEGG路徑數(shù)據(jù)庫)、PDGF信號(hào)途徑(來自Panther數(shù)據(jù)庫)、膠原纖維組裝和其他多聚體結(jié)構(gòu)(來自Reactome數(shù)據(jù)庫)有關(guān)。

表1 符合納入條件的上調(diào)及下調(diào)表達(dá)的前10位circRNA

2.2 OA和正常對(duì)照膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞差異表達(dá)的miRNA及功能、代謝通路 篩選出差異表達(dá)miRNA 24個(gè)，與正常對(duì)照比較，OA膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞上調(diào)表達(dá)及下調(diào)表達(dá)的miRNA各12個(gè)。生物學(xué)過程層面，OA膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞差異表達(dá)的miRNA主要影響含核堿基的化合物生物合成過程(GO:0034654)、細(xì)胞質(zhì)翻譯終止(GO:0002184)、神經(jīng)生長(zhǎng)(GO:0022008)和細(xì)胞發(fā)育(GO:0048468)；細(xì)胞組成層面，差異表達(dá)的miRNA主要與細(xì)胞內(nèi)部分(GO:0044424)、翻譯釋放因子復(fù)合體(GO:0018444)、膜結(jié)合的細(xì)胞器(GO:0043227)、核轉(zhuǎn)錄抑制因子復(fù)合物(GO:0090568)相關(guān)；在生物學(xué)過程層面，差異表達(dá)的miRNA主要影響有機(jī)環(huán)狀化合物結(jié)合(GO:0097159)、核酸結(jié)合(GO:0003676)和雜環(huán)化合物結(jié)合(GO:1901363)。差異表達(dá)的miRNA經(jīng)KEGG通路分析，共得出470條通路，按富集程度最有意義的通路與蛋白質(zhì)泛素化(來自Biocyc數(shù)據(jù)庫)、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移(來自KEGG路徑數(shù)據(jù)庫)、泛素蛋白酶體途徑(來自Panther數(shù)據(jù)庫)、基因表達(dá)和蛋白質(zhì)代謝(來自Reactome數(shù)據(jù)庫)有關(guān)。

2.3 OA膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞差異表達(dá)miRNA和circRNA的相互作用 與has-miR-762相關(guān)的circRNA有71個(gè)、has-miR-18a-3p相關(guān)的circRNA有25個(gè)、has-miR-136-5p相關(guān)的circRNA有5個(gè)、has-miR-3131相關(guān)的circRNA有17個(gè)、has-miR-3189-3p相關(guān)的circRNA有29個(gè)。

3 討論

2013年國(guó)際權(quán)威期刊Nature發(fā)表了兩篇有關(guān)circRNA生物學(xué)功能的論文，揭開了circRNA的神秘面紗，引起國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。circRNA最早于20世紀(jì)70年代在RNA病毒中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)被認(rèn)為是一類由外顯子轉(zhuǎn)錄本發(fā)生錯(cuò)誤剪接而形成的低豐度RNA分子，有學(xué)者稱之為暗黑RNA。與線性RNA分子相比，circRNA呈現(xiàn)共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，缺乏5’端腺苷帽和3’端多聚腺苷酸尾[3]，不被核酸外切酶RNase降解，所以比線性RNA更穩(wěn)定，具有高度保守性。circRNA分子富含miRNA應(yīng)答元件，可作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA與miRNA結(jié)合，起到miRNA海綿作用，還可以同時(shí)抑制數(shù)個(gè)不同的miRNA，發(fā)揮網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用，可以通過改變miRNA應(yīng)答元件的種類、數(shù)量和比例使circRNA達(dá)到不同的調(diào)節(jié)效果[4]。Zhou等[5]建立了IL-1β誘導(dǎo)的小鼠OA模型，應(yīng)用下一代測(cè)序法篩選小鼠關(guān)節(jié)軟骨環(huán)狀RNA譜，并進(jìn)行GO及KEGG分析預(yù)測(cè)circRNA的功能，結(jié)果表明circRNA在OA的始動(dòng)和進(jìn)展中起重要作用。本研究結(jié)果證實(shí)，OA與正常對(duì)照膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞circRNA表達(dá)譜存在差異，差異表達(dá)基因1 380個(gè)，表明circRNA參與OA發(fā)生發(fā)展。我們針對(duì)差異表達(dá)circRNA進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果提示OA膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞差異表達(dá)的circRNA主要集中在GTP酶激活劑活性、鈣通道調(diào)節(jié)劑活性、細(xì)胞外基質(zhì)成分、軟骨細(xì)胞發(fā)育和肢體發(fā)育。KEGG通路分析得出1 127條通路，按富集程度最有意義的途徑與糖原生物合成、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、PDGF信號(hào)途徑、膠原纖維組裝和其他多聚體結(jié)構(gòu)有關(guān)。

越來越多的研究證實(shí)，miRNA作用于OA軟骨細(xì)胞的靶基因，參與OA的發(fā)生發(fā)展，調(diào)節(jié)其表達(dá)過程，對(duì)軟骨細(xì)胞代謝、增殖、分化的信號(hào)通路及細(xì)胞外基質(zhì)合成與代謝產(chǎn)生影響。miRNA是一類與同源mRNA相互作用的長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA[6]，成熟的miRNA來自具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的pre-miRNA，由Dicer 酶進(jìn)行剪切。miRNA單鏈與AGO蛋白結(jié)合成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體并特異性地結(jié)合靶基因mRNA 的3’UTR區(qū)，通過增強(qiáng)降解、抑制翻譯或通過其他機(jī)制來改變基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，從而下調(diào)miRNA的靶基因表達(dá)[7]。有前期發(fā)表的文獻(xiàn)[7]指出，miRNA是數(shù)百個(gè)基因的調(diào)節(jié)器，這些基因與軟骨發(fā)育、動(dòng)態(tài)平衡和OA病理學(xué)過程有關(guān);由于其調(diào)節(jié)凋亡和活性氧的能力，在OA軟骨細(xì)胞異常自噬反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[8]。Wu等[8]對(duì)許多研究結(jié)果進(jìn)行綜述，發(fā)現(xiàn)超過25個(gè)miRNA與軟骨發(fā)育和OA有關(guān)，特別是與調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞肥大和蛋白水解酶合成相關(guān)。另外，部分OA軟骨信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也受miRNA調(diào)節(jié)，例如TGF-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、誘導(dǎo)型硝酸合酶(iNOS)IL-1和TNF-α通路[9]。Cong等[10]在回顧已發(fā)表的文獻(xiàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)許多miRNA在OA中有差異表達(dá)，其中上調(diào)的miRNA主要針對(duì)發(fā)生在細(xì)胞核的生物過程，而下調(diào)的miRNA主要針對(duì)轉(zhuǎn)錄過程，表明miRNA在OA的始動(dòng)及發(fā)展中起重要作用。具體來講，miR-9、miR-27、miR-34a、miR-140、miR-146a、miR-558和miR-602在OA中異常表達(dá)，在其病理過程中起重要作用。2009年，Jones等比較了接受膝關(guān)節(jié)置換的關(guān)節(jié)軟骨和先前沒有關(guān)節(jié)痛病史的供體死亡后捐獻(xiàn)的軟骨，用人類miRNA表達(dá)譜分析鑒定出OA患者軟骨中有17個(gè)miRNA和骨骼中的30個(gè)miRNA，與正常組織相比差異倍數(shù)大于4倍。與正常對(duì)照組織比較，miR-9和miR-98在OA軟骨組織中均表達(dá)上調(diào)，后期的功能研究證實(shí)miR-9和miR-98都通過抑制IL-1β介導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生而參與炎癥途徑，而miR-9的過表達(dá)也減少了IL-1β誘導(dǎo)的MMP-13蛋白釋放[11]。Miyaki等[12]構(gòu)建miR-140基因缺失小鼠誘導(dǎo)出OA的蛋白多糖丟失及關(guān)節(jié)軟骨纖維化特征樣變，證實(shí)miR-140通過靶向ADAMTS-5的基因從而抑制其表達(dá)，而ADAMTS-5是被公認(rèn)重要的導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解的重要水解酶；而過表達(dá)miR-140則表現(xiàn)出抵抗抗原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的特征。本研究應(yīng)用OA和正常對(duì)照軟骨的miRNA原始數(shù)據(jù)進(jìn)行miRNA表達(dá)譜分析，得到差異表達(dá)基因24個(gè)，表明miRNA與OA的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本研究中，差異表達(dá)的miRNA的GO富集分析主要集中在含核堿基的化合物生物合成過程、神經(jīng)生長(zhǎng)和細(xì)胞發(fā)育。差異表達(dá)的miRNA經(jīng)KEGG通路分析得出470條通路，按富集程度最有意義的途徑與蛋白質(zhì)泛素化、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、泛素蛋白酶體途徑、基因表達(dá)和蛋白質(zhì)代謝有關(guān)。

circRNA作為miRNA海綿是比較成熟的理論，通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA從而調(diào)控下游靶基因的翻譯，二者密切相關(guān)。本研究對(duì)OA軟骨進(jìn)行miRNA及circRNA高通量分析，二者富集到的共同通路有Cell adhesion molecules pathway和Circadian entrainment pathway。Dudek等[13]總結(jié)了Circadian entrainment pathway在肌肉、骨骼及軟骨中的作用，特別關(guān)注組織生理學(xué)中晝夜節(jié)律的證據(jù),該領(lǐng)域的研究具有很大的潛力，可以幫助我們理解晝夜節(jié)律如何控制肌肉骨骼組織的正常及病理狀態(tài)，對(duì)與年齡相關(guān)疾病具有重要意義，并且對(duì)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)有潛移默化的影響。Schett等[14]在前瞻性Bruneck隊(duì)列研究中評(píng)估嚴(yán)重髖或膝關(guān)節(jié)OA的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征、生活方式以及可溶性血管細(xì)胞黏附分子1(VCAM-1)的水平，得出VCAM-1可以作為嚴(yán)重OA具有髖膝關(guān)節(jié)置換風(fēng)險(xiǎn)強(qiáng)有力且獨(dú)立的預(yù)測(cè)因子之結(jié)論。在一項(xiàng)基于手OA的患病率和嚴(yán)重程度相關(guān)人群的橫斷面研究[15]中，發(fā)現(xiàn)可溶性VCAM-1的血清水平與手OA的受累關(guān)節(jié)數(shù)量正相關(guān)。Karatay等[16]在關(guān)于OA治療的臨床報(bào)道中指出，關(guān)節(jié)腔注射透明質(zhì)酸(HA)后ICAM-1和VCAM-1水平降低可以解釋HA治療膝關(guān)節(jié)OA的抗炎作用。

我們進(jìn)而對(duì)人類OA膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞circRNA及miRNA表達(dá)譜進(jìn)行了整合分析，應(yīng)用miRanda軟件進(jìn)行circRNA和miRNA相互作用分析，得到circRNA-miRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)。其中,has-miR-762、has-miR-18a-3p、has-miR-136-5p與 circRNA關(guān)系最為密切，結(jié)合的circRNA也最多。張申華等[17]通過qPCR分析40位卵巢癌患者癌組織中miR-762和menin蛋白的表達(dá)情況，并通過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-762對(duì)menin蛋白及Wnt通路中增殖相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用，證實(shí)miR-762在人卵巢癌組織中呈高表達(dá)，并可能通過抑制menin蛋白及激活Wnt通路從而促進(jìn)卵巢癌的進(jìn)展。體外實(shí)驗(yàn)研究表明，miR-136-5p的過表達(dá)促進(jìn)了脊髓損傷大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-α、IKKβ和NF-κB的生成，抑制了A20蛋白的表達(dá)，炎性細(xì)胞向大鼠脊髓的浸潤(rùn)增加，導(dǎo)致脊髓損傷明顯加重,沉默miR-136-5p可顯著改善炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和脊髓損傷。因此，miR-136-5p可能成為治療脊髓損傷的新靶點(diǎn)。目前尚無對(duì)miR-18a-3p的報(bào)道。

差異表達(dá)的miRNA與軟骨細(xì)胞自噬功能障礙、氧化應(yīng)激和信號(hào)通路有關(guān)，這與OA的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。circRNA是否也參與OA的病理生理過程被提上研究日程，circRNAs-miRNAs-mRNAs軸在OA的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[2]，circRNA翻譯而來的蛋白質(zhì)在生理?xiàng)l件下可能相對(duì)無功能，但是細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外應(yīng)激可能促進(jìn)激活非依賴性翻譯模式，因此circRNA編碼的蛋白可能在病理?xiàng)l件下起關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。目前將miRNA或者circRNA作為OA 治療靶點(diǎn)的研究還局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ碗A段，應(yīng)用于臨床治療尚未取得突破性進(jìn)展，真正將這類小分子應(yīng)用于OA的臨床治療依然任重而道遠(yuǎn)。

綜上所述，OA膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中差異表達(dá)的circRNA有1 380個(gè)，其中215個(gè)上調(diào)表達(dá)，1 165個(gè)下調(diào)表達(dá)，差異表達(dá)的circRNA主要影響GTP酶激活劑活性、腺苷核糖核苷酸結(jié)合、鈣通道調(diào)節(jié)劑活性等分子功能，細(xì)胞外基質(zhì)成分、帶狀膠原纖維、纖維狀膠原蛋白三聚體等細(xì)胞組成，細(xì)胞成分形態(tài)發(fā)生、軟骨細(xì)胞發(fā)育和肢體發(fā)育等生物學(xué)過程，主要與糖原生物合成、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、PDGF信號(hào)途徑、膠原纖維組裝和其他多聚體結(jié)構(gòu)等相關(guān)代謝通路有關(guān)。與正常軟骨細(xì)胞比較，OA膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中共篩選出差異表達(dá)miRNA 24個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)及下調(diào)表達(dá)的miRNA各12個(gè)，差異表達(dá)的miRNA主要參與含核堿基的化合物生物合成過程、細(xì)胞質(zhì)翻譯終止、神經(jīng)生長(zhǎng)和細(xì)胞發(fā)育，影響細(xì)胞內(nèi)部分、翻譯釋放因子復(fù)合體、膜結(jié)合的細(xì)胞器、核轉(zhuǎn)錄抑制因子復(fù)合物，有機(jī)環(huán)狀化合物結(jié)合、核酸結(jié)合和雜環(huán)化合物結(jié)合，與蛋白質(zhì)泛素化、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、泛素蛋白酶體途徑、基因表達(dá)和蛋白質(zhì)代謝有關(guān)。circRNA和miRNA共同通路有Cell adhesion molecules pathway和Circadian entrainment pathway；circRNA-miRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)中，has-miR-762、has-miR-18a-3p、has-miR-136-5p與circRNA關(guān)系最為密切。本研究中我們應(yīng)用的CapitalBio Technology Human CircRNA Array v2在每張芯片上設(shè)計(jì)了四個(gè)陣列，每個(gè)陣列包含約170 340個(gè)人類circRNA探針。即使是如此龐大的探針數(shù)量，因?yàn)樾酒姹静粩喔?，不除外新的circRNA此次未被檢測(cè)出來。進(jìn)一步研究將觀察內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制影響miRNA下游靶基因的表達(dá)變化與信號(hào)通路的調(diào)控，明確miRNA,circRNA和mRNA之間的關(guān)系，探索OA中circRNA的miRNA海綿作用機(jī)制；擴(kuò)大樣本進(jìn)行臨床驗(yàn)證，應(yīng)用OA患者的外周血驗(yàn)證篩選出的目標(biāo)circRNA，進(jìn)行診斷OA微創(chuàng)、快速、易得的生物標(biāo)志物的探索，為進(jìn)一步闡明OA的發(fā)病機(jī)制及疾病的干預(yù)靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。