常用實(shí)驗(yàn)大小鼠采血方法及其對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利的影響

楊健莉，劉 佳，鄭志紅

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，沈陽(yáng) 110122)

實(shí)驗(yàn)大小鼠的使用在哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中約為75%左右[1]，主要應(yīng)用于藥代動(dòng)力學(xué)、毒理學(xué)、行為學(xué)、遺傳學(xué)以及腫瘤學(xué)等領(lǐng)域，對(duì)實(shí)驗(yàn)大小鼠進(jìn)行血液采集是實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中重要的實(shí)驗(yàn)操作，不同的采血方法對(duì)動(dòng)物組織損傷程度、采血間隔及采血量要求等各不相同；那么選擇適合的采血方法，獲得高質(zhì)量的血液樣本，是獲得良好動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)。本文主要介紹幾種大小鼠常用的采血方法，對(duì)采血量的確定、采血頻率的選擇及不同采血方法對(duì)動(dòng)物福利的影響進(jìn)行闡述，為實(shí)驗(yàn)者在操作過(guò)程中選擇合適的采血方法提供依據(jù)。

1 常用的采血方法

依據(jù)采血位點(diǎn)不同實(shí)驗(yàn)大小鼠常用的采血方法可分為鼠尾采血、眼眶采血、頸靜脈采血、隱靜脈采血、面部采血、心臟采血和腹主動(dòng)脈采血；下面分別對(duì)不同的采血方法要點(diǎn)及應(yīng)用進(jìn)行介紹。

1.1 鼠尾采血

鼠尾采血主要包括尾尖采血、鼠尾刺血和尾靜脈穿刺采血，適用于少量多次采血。尾尖采血又稱(chēng)剪尾采血，一般可采集血量：大鼠0.3～0.5 mL，小鼠0.1～0.2 mL；剪尾長(zhǎng)度：小鼠不超過(guò)1 mm，大鼠不超過(guò)2 mm，最長(zhǎng)剪尾長(zhǎng)度均不超過(guò)5 mm；所采集血液為動(dòng)靜脈混合血，不適用于老齡鼠[2]。鼠尾刺血常用于大鼠，一般可采集血量0.01～0.05 mL。尾靜脈穿刺采血可采集血量：小鼠0.1～0.15 mL，大鼠0.1～2 mL；常規(guī)方法選擇使用注射器采血，操作時(shí)應(yīng)注意抽拉速度，避免因?yàn)槌槔^(guò)快致使血管內(nèi)呈負(fù)壓，阻止血液流出，為此實(shí)驗(yàn)人員將原有的注射式采血針進(jìn)行改進(jìn)，即選用真空采血管進(jìn)行血液采集[3]，有效的避免了使用注射器抽取血液因抽拉不均勻而產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。

從動(dòng)物福利角度出發(fā)鼠尾采血應(yīng)優(yōu)先選擇用于需血量較少的連續(xù)多次采血，如血常規(guī)或血糖的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等[4]。

1.2 眼眶采血

眼眶采血是大小鼠常用的采血方法，采血量一般大鼠0.4～0.6 mL，小鼠0.2～0.3 mL，適于多次重復(fù)采血。采血后需要一段的組織修復(fù)時(shí)間，一般同一眼眶重復(fù)采血至少需要10 d的組織修復(fù)過(guò)程，否則會(huì)對(duì)采血量產(chǎn)生一定的影響[5]。大鼠眼眶采血常規(guī)方法即選用毛細(xì)玻璃管進(jìn)行內(nèi)眥取血，采血時(shí)選擇使用無(wú)菌的毛細(xì)玻璃管，可以有效降低眼周感染和眼部損傷，同時(shí)也應(yīng)保證毛細(xì)管周?chē)钠交葟亩鴮⒀蹞p傷降至最低[6]。一些文獻(xiàn)表明眼眶的多次取血會(huì)引起組織學(xué)改變，使動(dòng)物臨床表現(xiàn)異常，出現(xiàn)不適[7]，從而對(duì)動(dòng)物的晝夜節(jié)律性有一定的潛在影響，甚至最終導(dǎo)致動(dòng)物死亡[2]。然而也有研究顯示重復(fù)進(jìn)行眼眶采血對(duì)動(dòng)物的晝夜節(jié)律性沒(méi)有影響[8]，可用于進(jìn)行眼眶組織的長(zhǎng)期研究[9]。

眼眶采血因其風(fēng)險(xiǎn)性，英國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物“3R”國(guó)際中心(簡(jiǎn)稱(chēng)NC3RS)[10]建議眼眶采血應(yīng)用于終末期實(shí)驗(yàn)的采血，或動(dòng)物處于全麻狀態(tài)下，且無(wú)其他可替代方法，并提供合理的科學(xué)依據(jù)。

1.3 頸靜脈采血

頸靜脈采血一般可采集血量為大鼠2～2.5 mL，小鼠0.3～0.5 mL。頸靜脈采血一般無(wú)需麻醉，直接從穿刺點(diǎn)進(jìn)針采集血液[11]，但是此種方法要求操作者技術(shù)嫻熟，而且由于動(dòng)物未麻醉和相應(yīng)的器械固定，動(dòng)物容易掙扎，增加進(jìn)針難度，易使動(dòng)物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)造成皮下出血；對(duì)此楊萍等人[12]選擇麻醉后使用一次性真空采血管進(jìn)行采血，該方法操作簡(jiǎn)捷、創(chuàng)傷小、采血量大，；但是多次大量采血時(shí)，由于動(dòng)物長(zhǎng)時(shí)間處于麻醉狀態(tài)，易損壞動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)，且一次性真空采血導(dǎo)管不適宜重復(fù)使用，此時(shí)套管技術(shù)的應(yīng)用大大彌補(bǔ)了重復(fù)采血多次進(jìn)針的不足，最大限度的降低了動(dòng)物的痛苦以及不適感，通過(guò)此種方法可連續(xù)采集到血液樣本0.25 mL[13]；同時(shí) 可以對(duì)大鼠血流動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行實(shí)時(shí)的檢測(cè)，有效的應(yīng)用于嚙齒動(dòng)物膿毒血癥的模型中[14]。

頸靜脈采血所采集的血液質(zhì)量較高，單次采血一次可采集全身循環(huán)血量的15%，常應(yīng)用于藥代動(dòng)力學(xué)研究，尤其頸靜脈套管技術(shù)的不斷應(yīng)用，為連續(xù)多次采血提供了便利。

1.4 隱靜脈采血

隱靜脈采血常用于大小鼠的少量血液采集，單次采血的安全采血量為動(dòng)物體重的0.5%，間隔一天多次采血采血量為動(dòng)物體重的0.05%，隱靜脈采血無(wú)需麻醉，待動(dòng)物固定后，后腿外側(cè)區(qū)域剃毛后暴露采血點(diǎn)，采血針刺入采血點(diǎn)，即可獲得血液樣本；隱靜脈采血常用于藥代動(dòng)力學(xué)研究，以及生化指標(biāo)和血液計(jì)數(shù)的檢測(cè)等[15]；由于在穿刺部位形成的痂可在后期輕輕擦掉，因此可從原來(lái)的穿刺點(diǎn)連續(xù)取樣[16]。

隱靜脈采血操作簡(jiǎn)單，因其靜脈位置表淺，穿刺準(zhǔn)確性較高，操作過(guò)程無(wú)需麻醉，消除了麻醉劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，有文獻(xiàn)研究表明隱靜脈采血可作為眼眶采血的替代方法用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究[17]。

1.5 面部靜脈采血

面部靜脈采血主要適用于成年小鼠，一般可采集血量約0.2～0.5 mL，常用采血位點(diǎn)為面靜脈和顳淺靜脈[18]，面部采血一般無(wú)需麻醉，待動(dòng)物固定，確定采血點(diǎn)后采血針迅速刺入，獲得血液樣本； 面部采血可通過(guò)對(duì)面頰兩側(cè)分別采血進(jìn)行重復(fù)采血，所得血樣為動(dòng)靜脈混合血。相較于面靜脈而言顳淺靜脈的應(yīng)用較少，因其靠近內(nèi)耳，血液采集時(shí)若操作不當(dāng)會(huì)損害內(nèi)耳，對(duì)動(dòng)物造成不可避免的壓力和疼痛[19]；面部取血一般不適用于與血凝相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究[20]，因?yàn)闀?huì)有不可控的出血過(guò)多產(chǎn)生，小鼠可能面臨低血容量和死亡的風(fēng)險(xiǎn)[21]。

因此面部取血的主要采血位點(diǎn)是面靜脈，其采血量較大，且操作過(guò)程無(wú)需麻醉，操作方法簡(jiǎn)便快捷，對(duì)動(dòng)物損傷較小，但因其有不可控的出血過(guò)多產(chǎn)生，所以應(yīng)避免應(yīng)用于與血凝相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。

1.6 心臟采血

心臟采血為無(wú)菌采血，采血量大，可采集血量大鼠1～1.5 mL，小鼠0.5～0.8 mL；此方法需在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行，操作時(shí)，選擇胸部左側(cè)心臟博動(dòng)最強(qiáng)處進(jìn)針，緩慢回抽針筒可見(jiàn)血液流入針管，避免氣體進(jìn)入心臟研究發(fā)現(xiàn)不同性別的小鼠心臟采血后白細(xì)胞計(jì)數(shù)差異有顯著性，雌性小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)最低，提示在白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分化的研究中，動(dòng)物性別和采血部位應(yīng)保持一致，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性[22]。

心臟采血所采血液為循環(huán)血液，由于其會(huì)給動(dòng)物帶來(lái)潛在的痛感，引起心包出血以及心包填塞等，故常用于實(shí)驗(yàn)終末期的動(dòng)物采血[1]；心臟采血中的右心室采血所得結(jié)果具有代表性，較優(yōu)于其它的終末采血方法[23]。

1.7 腹主動(dòng)脈采血

適用于大、小鼠實(shí)驗(yàn)終末期采血，可采集血量大鼠1.0～2.0 mL，小鼠0.8～1.2 mL；李學(xué)娟等人[24]通過(guò)動(dòng)物麻醉固定后，解剖暴露腹主動(dòng)脈的方式采集血液，此過(guò)程耗時(shí)30～60 s。李研等人[25]將采血針進(jìn)行了改良，采用真空采血管進(jìn)行采血，本法較傳統(tǒng)的腹主動(dòng)脈采血法有“方便、快捷、準(zhǔn)確、不易凝血、不易溶血”等優(yōu)點(diǎn)。

腹主動(dòng)脈采血法取血量大、不易溶血,適用于多項(xiàng)目檢測(cè),不損傷器官不會(huì)出現(xiàn)因操作不當(dāng)造成氣栓與瘀血等,有利于病理組織學(xué)檢查，但操作比較復(fù)雜,技術(shù)性較強(qiáng)，應(yīng)注意掌握適宜的麻醉深度，防止心跳驟停、減少出血、及大鼠躁動(dòng)[26]。

綜上所述，結(jié)合不同采血方法的特點(diǎn)，總結(jié)見(jiàn)表1。

2 采血方法的選擇

不同的采血方法采血量不同，且對(duì)動(dòng)物福利的影響也不相同，因此我們應(yīng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)要求選擇最適合的采血方法。

2.1 采血量的選擇

實(shí)驗(yàn)大鼠的循環(huán)血容量一般約為58～70 mL/kg，小鼠的循環(huán)血容量一般約為63～80 mL/kg[1]，動(dòng)物的采血量一般與被采血?jiǎng)游锏捏w重、采血頻率以及采血前是否給予補(bǔ)液有關(guān)系，且同種動(dòng)物不同采血位點(diǎn)的采血量一般也不相同。每2～4周可以采集血量為循環(huán)血容量的10%，每7 d可以采集循環(huán)血容量的7.5%，每24 h可以采集循環(huán)血容量的1%[27]。

2.2 采血方法的選擇對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利的影響

實(shí)驗(yàn)中應(yīng)考慮不同的采血方法對(duì)動(dòng)物福利的影響，在滿(mǎn)足“3R”原則的同時(shí)，應(yīng)選擇對(duì)動(dòng)物的疼痛、組織損傷及壓力最小的采血方法，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中與壓力相關(guān)的福利指標(biāo)通常指血清或血漿中的皮質(zhì)酮水平、血糖值、生長(zhǎng)激素或泌乳素、心率、血壓以及行為學(xué)等，依據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康目梢詫?duì)血液樣本進(jìn)行相應(yīng)的福利指標(biāo)檢測(cè)[28]。

近些年大量文獻(xiàn)針對(duì)不同采血方法對(duì)動(dòng)物福利的影響進(jìn)行了研究，Tsai等人[29]比較了大小鼠常用的五種采血方法對(duì)BALB/cO1aHsd小鼠動(dòng)物福利指標(biāo)的影響，結(jié)果顯示在無(wú)麻醉少量采血時(shí)應(yīng)選擇眼眶采血，因其對(duì)動(dòng)物的壓力最小，頸靜脈和面部靜脈的采血方法對(duì)動(dòng)物的壓力最大，隱靜脈對(duì)動(dòng)物的損害最持久；Aasland等人[30]將隱靜脈和尾靜脈兩種采血方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示尾靜脈采血尤其多次采血相較于隱靜脈會(huì)對(duì)動(dòng)物造成更多的壓力；Shirasaki等人[11]比較頸靜脈穿刺和尾靜脈切割兩種采血方法，結(jié)果顯示尾靜脈切割相較于頸靜脈穿刺會(huì)更易產(chǎn)生溶血，兩種方法對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生的壓力相似，因此頸靜脈采血更適用血液變量等相關(guān)研究中的多次連續(xù)的大量采血；Holmberg等人[31]研究眼眶采血和面部采血對(duì)血友病小鼠的血液質(zhì)量和動(dòng)物福利影響，結(jié)果顯示面部采血后FVIII小鼠會(huì)有失血過(guò)多產(chǎn)生，而眼眶采血僅引起了小鼠的輕微出血，且無(wú)臨床致盲現(xiàn)象，對(duì)動(dòng)物的壓力較小，因此眼眶采血相較于面部采血更適用于凝血功能的檢測(cè)。

綜上可見(jiàn)，隱靜脈相較于尾靜脈更適合多次少量的采血，頸靜脈采血適合于多次連續(xù)的大容量采血，面部靜脈采血由于其采血后出血的不可控性，故不適宜應(yīng)用于與凝血功能相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究，但其可用于無(wú)麻醉下多次采血的其他實(shí)驗(yàn)研究。

3 小結(jié)

不同實(shí)驗(yàn)所需要檢測(cè)的參數(shù)指標(biāo)不同，應(yīng)該根據(jù)自身的實(shí)驗(yàn)性質(zhì)(是否涉及凝血功能等)選擇合適的采血方法，避免因?yàn)檫x擇不當(dāng)致使動(dòng)物出血過(guò)多，發(fā)生致盲，組織損傷等損害；選擇適合的采血方法，明確實(shí)驗(yàn)中所需血樣的特點(diǎn)，確定最適采血位點(diǎn)及采血頻率，熟練的掌握各種采血方法的操作技能，從而獲得良好的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，最大程度的降低了對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

表1 實(shí)驗(yàn)大小鼠常用采血方法比較Table 1 Common methods of blood collection from rats and mice

注：*表示頸靜脈套管技術(shù)除外，套管技術(shù)需在麻醉的情況下進(jìn)行。
Note.*Except for the jugular cannula, which should be performed under anesthesia.