5-氟尿嘧啶聯(lián)合機(jī)械劃傷致金黃地鼠口腔黏膜炎模型的建立

唐曉麗，楊 霖，楊 依，張宇軒，陳瀲月，方 芳*

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010)

口腔黏膜炎(oral mucositis，OM)是腫瘤患者接受放化療后常出現(xiàn)的并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為口腔組織出現(xiàn)紅斑、變薄，隨著組織繼續(xù)變薄，最終會(huì)發(fā)生潰瘍[1-2]。OM引發(fā)的疼痛、吞咽困難及食欲減退等，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[3]。目前，對(duì)OM的防治措施主要有冷凍療法、激光療法、抗菌消炎劑、細(xì)胞保護(hù)劑及細(xì)胞因子等，雖然防治方式多樣，但臨床上還未有被大家公認(rèn)的療效確切的防治方法[4]。

5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)是細(xì)胞周期特異性的細(xì)胞毒類抗癌藥物。臨床資料顯示[5]，應(yīng)用5-FU化療導(dǎo)致OM的發(fā)生率為28%左右。本研究給金黃地鼠腹腔注射5-FU聯(lián)合機(jī)械劃傷頰囊，通過(guò)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)建立OM動(dòng)物模型，為進(jìn)一步開發(fā)防治OM的藥物提供穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12只SPF級(jí)雄性金黃地鼠，8～9周齡，體質(zhì)量130～150 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK (京) 2016-0011]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：BUCM-2-2018031101-1003)，在北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物室進(jìn)行[SYXK (京) 2016-0038]，每籠飼養(yǎng)3只金黃地鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用按照3R原則給予人道主義的關(guān)懷照顧。

1.2 主要試劑與儀器

5-氟尿嘧啶(美國(guó)MedChem Express公司，批號(hào)：HY-90006/CS-0993)；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)ELISA試劑盒(武漢博士德生物公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)。酶標(biāo)儀(德國(guó)BMG Labtech股份有限公司)；全景掃描儀(3D Histech Pannoramic MIDI，Hungary)；超聲細(xì)胞破碎儀(北京平利洋醫(yī)療設(shè)備有限公司)；高速低溫離心機(jī)(Eppendorf AG，Hamburg，Germany)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組與模型制備

1.3.2 金黃地鼠口腔頰囊宏觀分析

造模后觀察金黃地鼠右側(cè)口腔頰囊劃傷部分宏觀變化(紅斑、糜爛、血管擴(kuò)張、上皮潰瘍和膿腫等)并拍照，進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[6]如下：0分：頰囊健康，無(wú)糜爛、血管擴(kuò)張等；1分：頰囊可見(jiàn)紅斑，無(wú)糜爛；2分：紅斑嚴(yán)重，血管擴(kuò)張，有糜爛面；3分：黏膜可見(jiàn)一個(gè)或多個(gè)潰瘍面，總面積不超過(guò)頰囊表面區(qū)域面積的25%；4分：潰瘍面面積約為頰囊表面區(qū)域的50%；5分：頰囊黏膜幾乎完全潰爛。

1.3.3 口腔頰囊組織病理學(xué)檢測(cè)

取右側(cè)頰囊組織浸泡在4%多聚甲醛中進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片(4 μm)及經(jīng)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色后脫水封片，用全景掃描儀在20倍光鏡下拍照并觀察口腔黏膜病變情況。

1.3.4 血清中TNF-α和IL-1β含量測(cè)定

腹主動(dòng)脈取血，靜置，2500 r/min離心10 min，分離血清。按照ELISA試劑盒的說(shuō)明書測(cè)定血清中TNF-α和IL-1β的含量。

1.3.5 口腔頰囊組織生化指標(biāo)檢測(cè)

將右側(cè)頰囊組織按照質(zhì)量1∶9體積生理鹽水進(jìn)行勻漿，離心并分離上清，按照SOD試劑盒、MDA試劑盒以及BCA蛋白定量試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

(1)風(fēng)化裂隙及采空塌陷導(dǎo)水裂隙。區(qū)內(nèi)對(duì)煤礦床充水有明顯影響的風(fēng)化裂隙主要發(fā)育在龍?zhí)督M及其上覆地層的地表淺部，而深部風(fēng)化程度減弱，其導(dǎo)水性亦差。采礦期間產(chǎn)生的采空塌陷導(dǎo)水裂隙將起到主要的導(dǎo)水作用，其作用是溝通巷道上部水源，從而使充水水源滲入或涌入礦井。由此可見(jiàn)，采空塌陷導(dǎo)水裂隙具有明顯導(dǎo)水作用。

1.3.6 臟器指數(shù)測(cè)定

迅速剖取金黃地鼠胸腺和腎上腺，稱濕重，計(jì)算臟器指數(shù)：臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)× 100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 5-FU聯(lián)合機(jī)械劃傷對(duì)金黃地鼠進(jìn)食量和體重的影響

與對(duì)照組相比，模型組動(dòng)物在造模后第1～8天內(nèi)每只動(dòng)物的日平均進(jìn)食量顯著減少(P< 0.01)。模型組在造模后第8～14天內(nèi)每只動(dòng)物的日平均進(jìn)食量有所恢復(fù)，與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(見(jiàn)表1)。

實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組動(dòng)物的體重未見(jiàn)明顯變化，而造模后第8天模型組動(dòng)物體重降低，其它時(shí)間點(diǎn)未見(jiàn)明顯變化(見(jiàn)表2)。

2.2 5-FU聯(lián)合機(jī)械劃傷對(duì)金黃地鼠口腔頰囊宏觀變化的大體觀察

對(duì)照組頰囊比較紅潤(rùn)且顏色較淺，無(wú)血管擴(kuò)張，模型組在造模后第1天出現(xiàn)紅腫，與對(duì)照組相比頰囊顏色明顯較深，評(píng)分明顯升高，第3天出現(xiàn)潰瘍面但面積較小，評(píng)分達(dá)高峰(P< 0.01)，第8天之后顏色逐漸恢復(fù)，評(píng)分降低，且潰瘍情況明顯好轉(zhuǎn)，第10天及第14天的頰囊損傷恢復(fù)，評(píng)分與對(duì)照組相同(見(jiàn)圖1、表3)。

表1 5-FU聯(lián)合機(jī)械劃傷對(duì)金黃地鼠進(jìn)食量的影響Table 1 Effect of 5-FU combined with mechanical scratch on food intake of golden hamsters

注：與對(duì)照組相比，**P< 0.01。
Note. Compared with the control group,**P< 0.01.

表2 5-FU聯(lián)合機(jī)械劃傷對(duì)金黃地鼠體重的影響Table 2 Effect of 5-FU combined with mechanical scratch on the weight of golden hamsters

注：與對(duì)照組相比，P> 0.05。
Note. Compared with the control group,P> 0.05.

2.3 HE染色觀察5-FU聯(lián)合機(jī)械劃傷對(duì)金黃地鼠頰囊組織的病理?yè)p傷

頰囊組織HE染色結(jié)果顯示：對(duì)照組動(dòng)物頰囊組織的表皮層結(jié)構(gòu)清晰，真皮層膠原含量豐富且排列緊密；肌層部分肌細(xì)胞排列疏松，間隙增大，組織未見(jiàn)明顯炎癥反應(yīng)。模型組動(dòng)物在造模后第8天可見(jiàn)頰囊組織中皮下血管周圍有較多肥大細(xì)胞；第14天時(shí)，可見(jiàn)肌層肌細(xì)胞排列疏松，間隙增大且肌層血管附近有少量肥大細(xì)胞。與對(duì)照組相比，模型組炎癥反應(yīng)重，肥大細(xì)胞數(shù)量多(見(jiàn)圖2)。

表3 5-FU聯(lián)合機(jī)械劃傷對(duì)金黃地鼠口腔頰囊宏觀影響的評(píng)分Table 3 Effect of 5-FU combined with mechanical scratch on macroscopic scores of right cheek pouch of golden hamsters

注：與對(duì)照組相比，**P< 0.01。
Note. Compared with the control group,**P< 0.01.

注：A：對(duì)照組；B：模型組造模后第1天；C：模型組造模后第3天；D：模型組造模后第8天；E：模型組造模后第10天；F：模型組造模后第14天。圖1 5-FU聯(lián)合機(jī)械劃傷對(duì)金黃地鼠右側(cè)頰囊的宏觀影響Note. A: Control group. B: Model group on day 1 after surgery. C: Model group on day 3 after surgery. D: Model group on day 8 after surgery. E: Model group on day 10 after surgery. F: Model group on day 14 after surgery.Figure 1 Macroscopic effect of 5-FU combined with mechanical scratches on the right cheek pouch of golden hamsters

注：A：對(duì)照組第8天；B：模型組第8天；C：模型組第14天。肌層部分肌細(xì)胞間隙增大，如圖中紅色箭頭所示；皮下血管周圍較多肥大細(xì)胞，如圖中黑色箭頭所示。圖2 5-FU聯(lián)合機(jī)械劃傷對(duì)金黃地鼠頰囊組織的影響(HE染色，× 20)Note. A: Control group on day 8. B: Model group on day 8. C: Model group on day 14. The space between some muscle bundles was increased, as indicated by the red arrow in the figure. High numbers of mast cells were present around subcutaneous blood vessels, as indicated by the black arrows in the figure.Figure 2 Effect of 5-FU combined with mechanical scratch on cheek pouch tissue in golden hamsters. HE staining

2.4 5-FU聯(lián)合機(jī)械劃傷對(duì)金黃地鼠血清中TNF-α和IL-1β含量的影響

與對(duì)照組相比，模型組在造模后第8天和第14天金黃地鼠血清中TNF-α、IL-1β的含量均有明顯升高(P< 0.05，P< 0.01)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組金黃地鼠血清中TNF-α、IL-1β的含量逐漸升高(見(jiàn)表4)。

2.5 5-FU聯(lián)合機(jī)械劃傷對(duì)金黃地鼠頰囊組織MDA含量和SOD活性的影響

與對(duì)照組相比，模型組在造模后第8天和第14天金黃地鼠頰囊組織中MDA的含量明顯升高(P< 0.05)，SOD的活性明顯降低(P< 0.05，P< 0.01)(見(jiàn)表5)。

2.6 5-FU聯(lián)合機(jī)械劃傷對(duì)金黃地鼠臟器指數(shù)的影響

與對(duì)照組相比，模型組金黃地鼠第8天和第14天的腎上腺指數(shù)和胸腺指數(shù)均無(wú)明顯差異(見(jiàn)表6)。

表4 5-FU聯(lián)合機(jī)械劃傷對(duì)金黃地鼠血清中TNF-α和IL-1β含量的影響Table 4 Effect of 5-FU combined with mechanical scratch on serum TNF-α and IL-1β in golden hamsters

注：與對(duì)照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。
Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表5 5-FU聯(lián)合機(jī)械劃傷對(duì)金黃地鼠頰囊組織中MDA含量和SOD活性的影響Table 5 Effect of 5-FU combined with mechanical scratch on MDA content and SOD activity in cheek pouch tissue of golden hamsters

注：與對(duì)照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。
Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表6 5-FU聯(lián)合機(jī)械劃傷對(duì)金黃地鼠的臟器指數(shù)的影響Table 6 Effect of 5-FU combined with mechanical scratch on the organ indexes of golden hamsters

注：與對(duì)照組相比，P> 0.05。
Note. Compared with the control group,P> 0.05.

3 討論

近年來(lái)，化療對(duì)腫瘤的治療作用越來(lái)越明顯，但是隨之而來(lái)的并發(fā)癥OM也越來(lái)越嚴(yán)重。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7]，對(duì)接受化療的患者進(jìn)行口腔檢查時(shí)，發(fā)現(xiàn)59%的癌癥患者出現(xiàn)紅斑、糜爛等口腔軟組織炎癥?；熕驴谇火つp傷的發(fā)生機(jī)制可能與口腔黏膜上皮細(xì)胞的直接損傷作用和骨髓抑制等有關(guān)，但具體發(fā)病機(jī)制尚不完全明確[8]。有研究表明，OM的病理學(xué)過(guò)程分為五個(gè)階段：?jiǎn)?dòng)，信息生成，信號(hào)放大，潰瘍和愈合。在初始階段，通過(guò)產(chǎn)生氧化應(yīng)激和活性氧，內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)DNA損傷。轉(zhuǎn)錄因子如核因子-κB(NF-κB)的激活導(dǎo)致許多基因上調(diào)，包括IL-1β和TNF-α，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)和增加皮下血管分布。這些細(xì)胞因子也參與正反饋循環(huán)，放大初始反應(yīng)，最終可能導(dǎo)致疼痛的黏膜發(fā)生潰瘍[9]。

目前，國(guó)內(nèi)有很多關(guān)于化療致OM的臨床研究報(bào)道，但是對(duì)于如何建立化療致口腔黏膜炎動(dòng)物模型的研究卻很少?；熤翺M產(chǎn)生的關(guān)鍵因素是化療藥物而非腫瘤自身，雖然選用正常動(dòng)物在模擬臨床腫瘤患者化療后OM產(chǎn)生過(guò)程上有一定的局限性，但是相比荷瘤動(dòng)物應(yīng)用方便，也可出現(xiàn)類似于臨床的癥狀，故有關(guān)化療致OM的研究大多采用正常動(dòng)物。國(guó)外用于OM研究的動(dòng)物主要有：大鼠[10]，倉(cāng)鼠[11]，金黃地鼠[6]等。倉(cāng)鼠和金黃地鼠具有口腔頰囊大的典型特征，易于觀察，常被用作研究OM的動(dòng)物模型。Lima等人[11]的研究證明了用5-FU干預(yù)倉(cāng)鼠，然后對(duì)頰囊進(jìn)行機(jī)械性創(chuàng)傷會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的OM，在第5天出現(xiàn)紅斑，充血，出血以及大面積的潰瘍和膿腫，第10天炎癥程度達(dá)到最大。Medeiros等[12]使用5-FU誘導(dǎo)金黃地鼠口腔黏膜炎，在初次注射后第10天顯著增加了頰囊組織中TNF-α和IL-1β的含量。本實(shí)驗(yàn)使用金黃地鼠研究5-FU聯(lián)合機(jī)械劃傷致OM的模型，通過(guò)拍照觀察發(fā)現(xiàn)在造模后第3天金黃地鼠口腔頰囊出現(xiàn)潰瘍面，炎癥反應(yīng)最明顯且評(píng)分最高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，從第8天開始炎癥反應(yīng)逐漸減輕，第14天基本恢復(fù)正常。HE染色顯示，在第8天和第14天模型組金黃地鼠頰囊組織均有肌細(xì)胞間隙增大及皮下血管周圍細(xì)胞肥大現(xiàn)象，存在炎癥反應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)，在造模后第8天和第14天金黃地鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量均明顯升高。這提示雖然宏觀方面觀察口腔頰囊在第8天后開始恢復(fù)，但是在第14天血清中促炎癥細(xì)胞因子的含量仍然較高，炎癥反應(yīng)依然存在。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，此造模方法模擬了化療藥物所致OM的臨床表現(xiàn)(如紅斑，潰瘍等)。

在OM的初始階段，口腔黏膜釋放自由基和各種炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，這種氧化應(yīng)激狀態(tài)除了減少抗氧化酶如SOD的活性外，還會(huì)使MDA的水平增加[13]，而氧化應(yīng)激損傷也會(huì)進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[14]，采用5-FU誘導(dǎo)雄性金黃地鼠口腔黏膜炎，頰囊組織中MDA的含量明顯較高，SOD的活性明顯較低。本研究發(fā)現(xiàn)，用5-FU聯(lián)合機(jī)械劃傷誘導(dǎo)金黃地鼠口腔黏膜炎，在造模后第8天及第14天頰囊組織中MDA的含量明顯升高，SOD的活力顯著下降。這提示5-FU聯(lián)合機(jī)械劃傷對(duì)金黃地鼠影響持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，在第14天MDA的含量和SOD的活性未見(jiàn)恢復(fù)，口腔頰囊組織炎癥反應(yīng)仍然存在。

本研究還發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組金黃地鼠在造模后8 d內(nèi)日平均進(jìn)食量明顯減少且體重減輕，而第8～14天內(nèi)的日平均進(jìn)食量和體重未見(jiàn)明顯差異。這提示造模引起的口腔黏膜炎癥影響了動(dòng)物進(jìn)食和體重。

腎上腺和胸腺與體內(nèi)的炎癥反應(yīng)有關(guān)，胸腺是體內(nèi)重要的免疫臟器，臟器相對(duì)質(zhì)量的變化稱為臟器指數(shù)，能夠評(píng)估動(dòng)物的免疫功能，同時(shí)也是臨床上最常用、最基本的評(píng)估指標(biāo)[15]。本實(shí)驗(yàn)中未見(jiàn)金黃地鼠的腎上腺指數(shù)和胸腺指數(shù)有明顯變化。

綜上所述，5-FU聯(lián)合機(jī)械劃傷可以引起OM的臨床癥狀，在造模后第3天最明顯，8 d后慢慢恢復(fù)，但促炎癥細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激反應(yīng)在造模后14 d持續(xù)存在，提示成功建立金黃地鼠口腔黏膜炎動(dòng)物模型，可用于口腔黏膜炎發(fā)病機(jī)制及治療藥物的研究。

注：金黃地鼠是倉(cāng)鼠科倉(cāng)鼠亞科金倉(cāng)鼠屬動(dòng)物，在公開出版物中使用倉(cāng)鼠作為名稱更為科學(xué)。但鑒于目前我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中提到的動(dòng)物的種類都是地鼠，作為專業(yè)人員能夠清楚該物種在動(dòng)物分類中地位，并不妨礙科學(xué)研究的成果和使用，故本文在發(fā)表時(shí)仍沿用“金黃地鼠”，待國(guó)標(biāo)修訂后再統(tǒng)一命名為“倉(cāng)鼠”。