結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)專(zhuān)家共識(shí)

《中國(guó)防癆雜志》編輯委員會(huì)中國(guó)醫(yī)療保健國(guó)際交流促進(jìn)會(huì)結(jié)核病防治分會(huì)基礎(chǔ)學(xué)組和臨床學(xué)組

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是全球及我國(guó)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug-resistant tuberculosis, XDR-TB)是目前臨床亟待解決的難題之一。因此，快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)標(biāo)本中耐藥結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis, MTB)，快速診斷耐藥結(jié)核病(drug-resistant tuberculosis, DR-TB)，對(duì)有效控制DR-TB疫情是至關(guān)重要的。隨著MTB耐藥分子機(jī)制的闡明，快速的分子藥物敏感性試驗(yàn)(drug susceptibility test，DST)和表型DST新方法的建立并在臨床上廣泛應(yīng)用，需要建立更趨完善的、規(guī)范的MTB耐藥性檢測(cè)方法和流程，以便結(jié)核病臨床醫(yī)生、檢驗(yàn)人員和防控人員能夠適宜地應(yīng)用檢測(cè)方法，正確判讀檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)而提高DR-TB的診治水平，加快DR-TB的控制。

我國(guó)常用的MTB DST檢測(cè)方法

目前在我國(guó)臨床應(yīng)用的MTB DST檢測(cè)方法根據(jù)其原理主要有兩種類(lèi)型：表型DST和分子DST。

一、表型DST檢測(cè)方法

該方法是建立在培養(yǎng)基礎(chǔ)上的，通過(guò)對(duì)比觀察MTB在含藥和不含藥培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況來(lái)檢測(cè)其耐藥性，是目前耐藥性檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。耐藥性檢測(cè)所采用的藥物濃度通常依據(jù)最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)確定，或按照機(jī)體藥代動(dòng)力學(xué)指標(biāo)制定，在體外可將耐藥菌株與敏感菌株分開(kāi)。絕大多數(shù)常用的表型DST需要MTB純培養(yǎng)物，MTB生長(zhǎng)慢的特性決定了該方法需花費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間，而且可能因?yàn)樯L(zhǎng)不良或其他微生物污染而導(dǎo)致結(jié)果的不確定性，但該方法可檢測(cè)多種抗結(jié)核藥物的耐藥性。

(一)傳統(tǒng)的DST方法

在含和不含一定濃度抗結(jié)核藥物的固體培養(yǎng)基上，檢測(cè)MTB的生長(zhǎng)情況以判斷其對(duì)藥物的敏感性，我國(guó)常用絕對(duì)濃度法和比例法[1]。

1.絕對(duì)濃度法(absolute concentration method)：將1mg/ml菌懸液用生理鹽水倍比稀釋至10-2mg/ml，吸取0.1 ml菌液分別接種于含高、低濃度藥液培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基上，置37 ℃培養(yǎng)4周，按下列方式報(bào)告菌落生長(zhǎng)情況：分枝桿菌培養(yǎng)陰性(-)：斜面無(wú)菌落生長(zhǎng)；分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性(+)：菌落生長(zhǎng)占斜面面積的1/4；分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性(++)：菌落生長(zhǎng)占斜面面積的1/2；分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性(+++)：菌落生長(zhǎng)占斜面面積的3/4；分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性(++++)：菌落生長(zhǎng)布滿(mǎn)整個(gè)斜面；培養(yǎng)基斜面上菌落數(shù)少于20個(gè)時(shí)，報(bào)告菌落數(shù)。

2.比例法(proportion method)：將1 mg/ml菌懸液用生理鹽水倍比稀釋至10-2mg/ml和10-4mg/ml，分別取0.01 ml的10-2mg/ml和10-4mg/ml的稀釋菌液同時(shí)接種于含藥培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基上，置37 ℃培養(yǎng)4周，將含藥培養(yǎng)基上的可計(jì)數(shù)菌落數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上的可計(jì)數(shù)菌落數(shù)相比，比值大于1%即判斷為耐藥。若高稀釋度菌液(10-4mg/ml)在對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)少于20個(gè)，則應(yīng)從對(duì)照管傳代培養(yǎng)，進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。

比例法與絕對(duì)濃度法耐藥性檢測(cè)的一致率均在80%以上，尤其是對(duì)利福平(RFP)的耐藥性檢測(cè)一致率達(dá)90%以上，比例法的耐藥檢出率高于絕對(duì)濃度法。傳統(tǒng)DST方法的優(yōu)點(diǎn)是可同時(shí)檢測(cè)一線(xiàn)[如RFP、異煙肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)和鏈霉素(Sm)]和二線(xiàn)[卡那霉素(Km)、阿米卡星(丁胺卡那霉素，Am)、卷曲霉素(Cm)、氟喹諾酮類(lèi)(FQs)、乙硫異煙胺(Eto)、丙硫異煙胺(Pto)、對(duì)氨基水楊酸(PAS)、環(huán)絲氨酸(Cs)]共十幾種抗結(jié)核藥物的耐藥水平，已有商業(yè)化的產(chǎn)品，簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，適用于基層；最近對(duì)貝達(dá)喹啉(Bdq)、德拉馬尼(Dlm)和利奈唑胺(Lzd)的DST方法已通過(guò)驗(yàn)證[2]。其缺點(diǎn)是對(duì)EMB、吡嗪酰胺(PZA)、Pto、PAS和Cs 進(jìn)行DST的檢測(cè)結(jié)果不可靠[2]，而且培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，平均需30 d以上的時(shí)間，試驗(yàn)結(jié)果易受含藥管中實(shí)際藥物濃度、MTB接種量和細(xì)菌活力的影響。

(二)分枝桿菌液體培養(yǎng)DST檢測(cè)方法[1-2]

通過(guò)分枝桿菌液體培養(yǎng)系統(tǒng)采用比例法進(jìn)行DST，設(shè)置1管生長(zhǎng)對(duì)照管，PZA還需另外設(shè)置1管專(zhuān)用的生長(zhǎng)對(duì)照管，其余管分別加入測(cè)試的一線(xiàn)抗結(jié)核藥物[INH、RFP、Sm、EMB、PZA]，置37 ℃培養(yǎng)至自動(dòng)報(bào)告結(jié)果。其優(yōu)點(diǎn)是與傳統(tǒng)的DST具有較高的符合率，較快速，平均只需8～10 d時(shí)間[3]，WHO認(rèn)可應(yīng)用快速培養(yǎng)系統(tǒng)開(kāi)展MTB對(duì)部分二線(xiàn)抗結(jié)核藥物的DST [如氧氟沙星(Ofx)、Km、Cm、Eto等]；最近對(duì)Bdq、Dlm和氯氟嗪(clofazimine)的DST檢測(cè)方法已通過(guò)驗(yàn)證[2]。其缺點(diǎn)是進(jìn)口的儀器和試劑較昂貴、易污染[4]。

(三)分枝桿菌MIC檢測(cè)法

是基于微量肉湯稀釋法原理，應(yīng)用比例法檢測(cè)十幾種一線(xiàn)和二線(xiàn)抗結(jié)核藥物的耐藥性[如Sm、INH、RFP、利福噴丁(Rft)、利福布汀(Rfb)、EMB、Ofx、左氧氟沙星(Lfx)、莫西沙星(Mfx)、Km、Am、Cm、Eto、Pto、PAS、對(duì)氨基水楊酸異煙肼(pasiniazide，Pa)、Cs、克拉霉素(Clr)和氯法齊明(Cfz)][5-6]，只需7～14 d時(shí)間。其優(yōu)點(diǎn)是大多數(shù)藥物與傳統(tǒng)的DST具有較高的符合率(84.6%～100%)，可獲得較多二線(xiàn)抗結(jié)核藥物的耐藥情況，實(shí)現(xiàn)了結(jié)果判讀的自動(dòng)化，為臨床提供更確切的耐藥信息；缺點(diǎn)是實(shí)際應(yīng)用中某些藥物的MIC值不好判讀。

二、分子DST方法

該方法是基于MTB對(duì)抗結(jié)核藥物耐藥分子機(jī)制，采用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)MTB的耐藥基因型(表1)。分子DST已成為DR-TB的確診方法之一[7-8]，其建立在基因擴(kuò)增基礎(chǔ)上，快速(2～48 h)、敏感地從MTB分離株或預(yù)處理的臨床標(biāo)本(包括涂陰、培陰的標(biāo)本)中檢出MTB耐藥基因突變；分子DST只在初始階段需要有較高的生物安全條件，標(biāo)本消化處理和DNA提取后標(biāo)本的傳染風(fēng)險(xiǎn)降低。但分子DST存在下列缺點(diǎn)[7-9]：(1)只有部分抗結(jié)核藥物特異的耐藥相關(guān)突變基因被發(fā)現(xiàn)，目前的耐藥基因檢測(cè)試劑也只能檢測(cè)已發(fā)現(xiàn)的抗結(jié)核藥物主要耐藥基因型。因此，分子DST檢測(cè)MTB耐受藥物的種類(lèi)有限；(2)分子DST無(wú)法確定標(biāo)本中耐藥細(xì)菌的比例，而可能難以檢出野生型和突變型菌株混合形成的異質(zhì)性耐藥(即從患者體內(nèi)同時(shí)分離出敏感菌株和耐藥菌株的現(xiàn)象)[10]，也可能無(wú)法檢出表型DST耐藥水平的耐藥菌株(如：比例法可陽(yáng)性檢出僅含1%耐藥菌株的標(biāo)本，而分子DST可能難以檢出)；(3)某些分子DST可能檢出不影響耐藥表型的同義突變(氨基酸沒(méi)有改變)、沉默突變[11](不影響編碼蛋白的表達(dá)，結(jié)構(gòu)或功能無(wú)顯著變化)[12-13]，從而導(dǎo)致不能鑒定突變性質(zhì)的分子DST方法存在報(bào)告假耐藥的可能性；(4)不同地區(qū)流行的MTB菌株的耐藥基因型并不完全相同，而目前商業(yè)化的MTB耐藥檢測(cè)試劑并未涵蓋所有的耐藥突變位點(diǎn)，因此，分子DST并不能檢出MTB所有表型耐藥菌株[14-15]，而可能出現(xiàn)假陰性。由此可見(jiàn)，分子DST不能完全取代傳統(tǒng)表型DST，可作為耐藥MTB快速篩查方法和(或)傳統(tǒng)DST的補(bǔ)充。

表1 分子DST檢測(cè)MTB對(duì)常見(jiàn)抗結(jié)核藥物的耐藥基因及突變位點(diǎn)

注利福平(rifampicin，RFP)；異煙肼(isoniazid，INH)；乙胺丁醇(ethambutol，EMB)；鏈霉素(streptomycin，Sm)；吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)；氟喹諾酮類(lèi)(fluoroquinolone，F(xiàn)Qs)；阿米卡星(丁胺卡那霉素，amikacin，Am)；卡那霉素(kanamycin，Km)；卷曲霉素(capreomycin，Cm)

(一)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

采用半巢式實(shí)時(shí)PCR技術(shù)快速、自動(dòng)化地同時(shí)檢測(cè)MTB基因及RFP常見(jiàn)耐藥決定區(qū)域[16-17]，核酸提取、擴(kuò)增、檢測(cè)一體化，操作簡(jiǎn)便，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需2 h，生物安全性高，不易污染，可用于除血液外的各種臨床標(biāo)本的檢測(cè)；但只能檢測(cè)RFP的耐藥性，不報(bào)告具體的突變類(lèi)型。

(二)探針熔解曲線(xiàn)法

采用多色探針熔解曲線(xiàn)法快速檢測(cè)MTB對(duì)RFP、INH、Sm、EMB和FQs常見(jiàn)耐藥決定區(qū)域[18]，簡(jiǎn)便、快速，閉管檢測(cè)不會(huì)交叉污染或造成實(shí)驗(yàn)室污染，只需1臺(tái)通用的熒光定量PCR儀，無(wú)需繁瑣的雜交、顯色過(guò)程，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需2～3 h，可較全面地了解耐藥基因突變信息，輔助診斷MDR-TB和pre-XDR-TB(指對(duì)FQs或至少1種二線(xiàn)注射類(lèi)藥物耐藥)[2]；其缺點(diǎn)是不報(bào)告具體的突變類(lèi)型。

(三)基因芯片技術(shù)

采用基因芯片技術(shù)較簡(jiǎn)便、快速地檢測(cè)MTB對(duì) RFP和INH耐藥的常見(jiàn)基因型[19]，可了解突變的位點(diǎn)和性質(zhì)，輔助診斷MDR-TB，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需24～48 h；其缺點(diǎn)是雜交、檢測(cè)過(guò)程較繁瑣。

(四)反向雜交技術(shù)

采用反向雜交技術(shù)可同時(shí)快速檢測(cè)對(duì)RFP、INH、EMB、FQs、Am、Km和Cm耐藥的常見(jiàn)基因型[20-22]，可了解突變的位點(diǎn)和性質(zhì)，輔助診斷MDR-TB和pre-XDR-TB、XDR-TB，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需1～2 d 時(shí)間；但其為開(kāi)放性檢測(cè)，可能會(huì)污染擴(kuò)增產(chǎn)物而導(dǎo)致假耐藥的報(bào)告，并且雜交、顯色過(guò)程較繁瑣。

(五)基因測(cè)序技術(shù)

采用PCR-Sanger測(cè)序方法檢測(cè)MTB對(duì) RFP和INH耐藥的常見(jiàn)基因型，可了解突變的位點(diǎn)和性質(zhì)，但目前尚未在臨床廣泛開(kāi)展。

MTB耐藥性檢測(cè)策略

注 RS為利福平敏感，RR為利福平耐藥圖1 TB患者M(jìn)TB耐藥性檢測(cè)流程圖

目前，采用任何單一形式的DST方法均無(wú)法完全滿(mǎn)足臨床需求，而采用多種方法聯(lián)合檢測(cè)雖能提高耐藥MTB的檢出率、縮短診斷時(shí)間，但同時(shí)也增加了TB患者的檢測(cè)費(fèi)用，而且若不同檢測(cè)方法的結(jié)果不一致，也給醫(yī)生的診斷和化療方案的制定帶來(lái)許多困擾。因此，本共識(shí)提出MTB耐藥性檢測(cè)的策略(見(jiàn)圖1)，以指導(dǎo)合理地選擇DST方法進(jìn)行耐藥性聯(lián)合檢測(cè)，為臨床DR-TB的快速、準(zhǔn)確診斷和早期有效治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

一、生物學(xué)安全與質(zhì)量控制

根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)辦公廳頒布的《人間傳染的病原微生物名錄(2018年修訂)》[23]規(guī)定，TB患者標(biāo)本DST需在生物安全Ⅱ級(jí)實(shí)驗(yàn)室根據(jù)生物安全通用要求開(kāi)展；應(yīng)實(shí)施完善的檢驗(yàn)質(zhì)量控制(QC)系統(tǒng)，并具有良好的可重復(fù)性和較高的可信度[24]；分子DST還需在符合基因擴(kuò)增規(guī)范的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，預(yù)防擴(kuò)增產(chǎn)物污染而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，保證和提高檢驗(yàn)質(zhì)量，確保MTB耐藥性檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

二、建議表型DST與分子DST聯(lián)合檢測(cè)，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)

表型DST方法可確定MTB對(duì)多種一、二線(xiàn)抗結(jié)核藥物的敏感性和藥物耐受程度，是臨床診斷DR-TB、制定化療方案的主要依據(jù)；雖然尚不完善，但其是DST的“金標(biāo)準(zhǔn)”。而敏感、快速的分子DST方法彌補(bǔ)了傳統(tǒng)DST的不足(如耗時(shí)長(zhǎng)、菌陰TB或普通細(xì)菌污染會(huì)導(dǎo)致DST無(wú)結(jié)果、對(duì)PZA的DST結(jié)果不準(zhǔn)確等)，為DR-TB的早期診斷提供了有效的手段。因此，通過(guò)分子DST對(duì)DR-TB、尤其是MDR-TB做出早期診斷，并先進(jìn)行及時(shí)合理的治療；待表型DST結(jié)果出來(lái)后，經(jīng)臨床綜合判斷是否需要進(jìn)一步調(diào)整化療方案。

三、建議采用分子DST方法直接檢測(cè)可疑TB患者臨床標(biāo)本以快速篩查MTB和耐RFP的MTB

通過(guò)可直接檢測(cè)的分子DST方法快速篩查臨床標(biāo)本(痰或肺外結(jié)核標(biāo)本)，可以輔助TB、RR-TB的早期診斷和鑒別診斷[2,25-29]。盡管此類(lèi)分子DST快速篩查技術(shù)無(wú)法提供較全面的抗結(jié)核藥物敏感或耐藥信息，但可大幅減少實(shí)驗(yàn)室的工作量，在沒(méi)有獲得表型DST結(jié)果的情況下(如：結(jié)果未出來(lái)、沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)、污染或與NTM混合感染等)，也能為DR-TB的診斷和鑒別診斷快速提供初步的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

四、建議采用分子DST方法直接檢測(cè)涂片陽(yáng)性的臨床標(biāo)本[18-19,22,30-32]

在進(jìn)行傳統(tǒng)培養(yǎng)和表型DST的同時(shí)，建議采用可檢測(cè)MDR(或XDR)-MTB的分子DST方法直接檢測(cè)涂片陽(yáng)性的臨床標(biāo)本，可使約85%～95%的TB患者獲得早期診斷MDR(或pre-XDR/XDR)-TB。

五、涂片陰性復(fù)治TB患者臨床標(biāo)本的處理

建議先進(jìn)行分子檢測(cè)。若MTB核酸檢測(cè)陽(yáng)性，再進(jìn)一步進(jìn)行分子DST，可使部分涂片陰性的標(biāo)本早期獲得明確的耐藥基因型結(jié)果[9,32-34]。

六、涂片和分子檢測(cè)陰性TB患者標(biāo)本的處理

建議在分枝桿菌快速培養(yǎng)檢測(cè)陽(yáng)性后，再進(jìn)一步進(jìn)行分子DST和傳統(tǒng)DST，以提高DR-TB的診斷率[34-35]。

七、RR-MTB或MDR-MTB檢測(cè)陽(yáng)性或XDR-TB可疑患者臨床標(biāo)本、培養(yǎng)物和(或)提取核酸的處理

對(duì)于上述標(biāo)本，建議同時(shí)進(jìn)行二線(xiàn)藥物的分子DST[2,18,36]和傳統(tǒng)DST，有條件的單位也可進(jìn)行新的表型DST(如MIC法)檢測(cè)MTB對(duì)FQs、Am、Km和Cm的耐受性，有助于快速診斷pre-XDR-TB和(或)XDR-TB，盡早確定合理的化療方案進(jìn)行治療[2,5]。

MTB DST檢測(cè)結(jié)果的判讀

目前表型DST和分子DST對(duì)一、二線(xiàn)抗結(jié)核藥物RFP、INH和FQs的檢測(cè)準(zhǔn)確度最高[24]。在現(xiàn)有科學(xué)證據(jù)的基礎(chǔ)上，對(duì)應(yīng)用傳統(tǒng)DST和分子DST診斷DR-TB、指導(dǎo)臨床化療有如下意見(jiàn)和建議。

一、DST是DR-TB的確診依據(jù)[24,32]

(1)若表型DST和分子DST結(jié)果一致，相應(yīng)結(jié)果可作為待測(cè)菌株對(duì)相應(yīng)藥物耐受性的判定依據(jù)。(2)若分子DST同時(shí)檢出敏感基因型和耐藥基因型時(shí)，需參考對(duì)不同抗結(jié)核藥物分子DST檢測(cè)的敏感度和特異度，若是對(duì)RFP、INH和FQs的檢測(cè)結(jié)果可判斷為MTB的異質(zhì)性耐藥[37]；若是其他抗結(jié)核藥物則還需結(jié)合臨床進(jìn)行綜合判斷。(3)若同一標(biāo)本不同分子DST檢測(cè)結(jié)果不一致，或該標(biāo)本應(yīng)用同一分子DST方法進(jìn)行2次檢測(cè)的結(jié)果不一致，或分子DST和表型DST結(jié)果不一致時(shí)，需參考對(duì)不同抗結(jié)核藥物分子DST檢測(cè)的敏感度和特異度；若是對(duì)RFP、INH和FQs的檢測(cè)結(jié)果，只要其中1種方法檢測(cè)結(jié)果顯示耐藥，首先考慮可能是耐藥或異質(zhì)性耐藥；若是其他抗結(jié)核藥物則還需結(jié)合臨床進(jìn)行綜合判斷。

二、初治TB患者的耐藥性檢測(cè)與結(jié)果判讀[24,38]

(1)初治TB患者1次分子DST檢測(cè)為對(duì)RFP、INH和FQs耐藥時(shí)可判斷為耐藥，并同時(shí)進(jìn)行表型DST，以了解耐藥水平及對(duì)其他藥物的耐藥情況，以供臨床醫(yī)生進(jìn)行綜合分析。(2)初治TB患者1次分子DST檢測(cè)為對(duì)RFP、INH和FQs以外抗結(jié)核藥物耐藥時(shí)，建議復(fù)查，并同時(shí)進(jìn)行表型DST；如果復(fù)查分子DST或表型DST仍為耐藥時(shí)， DR-TB的結(jié)論成立；如果分子DST復(fù)查結(jié)果為對(duì)被檢測(cè)藥物敏感，則建議等待表型DST結(jié)果；若表型DST結(jié)果為耐藥，則判斷為耐藥；若表型DST結(jié)果為敏感，應(yīng)結(jié)合臨床資料進(jìn)行綜合判斷。

三、對(duì)利福霉素類(lèi)藥物的耐藥性檢測(cè)

(1)應(yīng)用分子DST檢測(cè)MTB對(duì)RFP的耐藥性具有很高的敏感度和特異度，與傳統(tǒng)DST結(jié)果具有很高的符合率(90%以上)[9,19]，是對(duì)表型DST的有益補(bǔ)充，可初步判斷MTB對(duì)RFP耐藥。(2)我國(guó)TB患者中，MTB對(duì)RFP耐藥90%～95%是由于rpoB507至533位氨基酸密碼子突變所致，最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)是531和526位氨基酸密碼子，大多數(shù)呈現(xiàn)高水平耐藥；而511、513～516和521、522、529、533位密碼子突變一般導(dǎo)致中、低水平耐藥；507～509、517、523、532位氨基酸置換與MTB對(duì)RFP耐藥無(wú)關(guān)[39-41]。(3)約2.58%～18%的分子DST檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的對(duì) RFP耐藥的MTB菌株不是MDR-MTB，證明對(duì)RFP耐藥并非MDR-TB的替代標(biāo)志，條件許可時(shí)仍需同時(shí)檢測(cè)對(duì)INH是否耐藥的分子DST[42-44]。(4)利福霉素類(lèi)藥物RFP、Rft和Rfb均為一線(xiàn)抗結(jié)核藥物，其作用靶標(biāo)RNA聚合酶α、β、β′亞單位編碼基因rpoA、rpoB、rpoC突變均可能導(dǎo)致MTB對(duì)其耐藥，三者之間呈雙向交叉耐藥性，具有70%～90%的交叉耐藥率，其中531位和526位密碼子突變通常導(dǎo)致大多數(shù)MTB對(duì)RFP、Rft呈高水平耐藥，而對(duì)Rfb可能一部分為高水平耐受、一部分為低水平耐受或敏感[39-40,45]。

四、對(duì)INH及異煙酸衍生物的耐藥性檢測(cè)

(1)MTB對(duì) INH的分子DST結(jié)果與表型DST具有較好的符合率(89%～97%)[9,19]。(2)我國(guó)TB患者中，INH耐藥70%～80%是由于katG315位密碼子突變所致，應(yīng)認(rèn)識(shí)到該突變只是導(dǎo)致katG酶活性降低[46]，但仍能催化INH轉(zhuǎn)換為其活性型異煙酸而發(fā)揮抗結(jié)核作用，只是轉(zhuǎn)換效率降低，MICs差異很大，表型DST通常表現(xiàn)為MTB對(duì)INH低、中水平耐受或敏感[47]。(3)10%左右患者M(jìn)TB分離株中的katG完全缺失，一般會(huì)導(dǎo)致高水平耐INH[48]。(4)12%左右患者M(jìn)TB分離株inhA-15位核苷酸突變，表型DST通常表現(xiàn)為MTB對(duì)INH、Pto和Eto低、中水平耐受或敏感；InhA基因編碼區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)域若存在雙重突變，通常導(dǎo)致對(duì)INH高水平耐受[49]。InhA-15位突變會(huì)導(dǎo)致MTB對(duì)INH與Pto、Eto有一定的交叉耐藥性[47]，對(duì)Pto與Eto具有雙向交叉耐藥性。(5)EthA突變通常導(dǎo)致MTB高耐Eto，大約76%的分離株對(duì)Eto 的MICs>50 μg/ml，與氨硫脲、戊氧苯硫脲(thiocarlide)有廣泛的交叉耐藥性[50]。

五、對(duì)EMB的耐藥性檢測(cè)

(1)MTB耐EMB主要與阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因embABC操縱子突變或表達(dá)增高有關(guān)，其中大多數(shù)是因?yàn)閑mbB基因突變所致，少數(shù)與embA和embC基因突變有關(guān)[51]。(2)embB306位密碼子是最常見(jiàn)突變位點(diǎn)，但只有47%～89%耐EMB的MTB有embB306位密碼子突變[52]；此外，embB406和embB497也是較常見(jiàn)的突變位點(diǎn)[15,51]。鑒于對(duì)EMB的分子DST目前只能檢測(cè)單個(gè)embB306位點(diǎn)，而部分EMB敏感(19.7%～31.2%)尤其耐其他抗結(jié)核藥物(60%)的MTB菌株也出現(xiàn)embB306突變[52-53]，故其敏感度、特異度差，與傳統(tǒng)DST的符合率較低，不能滿(mǎn)足臨床需求[15]。因此，建議embB306基因檢測(cè)應(yīng)該聯(lián)合EMB表型DST，并根據(jù)臨床資料進(jìn)行綜合分析，以指導(dǎo)EMB的應(yīng)用和劑量的調(diào)整。(3)embB306位氨基酸置換通常導(dǎo)致MTB對(duì)EMB呈中等水平耐藥，但若此時(shí)傳統(tǒng)DST檢測(cè)結(jié)果顯示低水平耐受時(shí)，繼續(xù)應(yīng)用EMB可能是有效的，可能與EMB的耐藥是其作用靶標(biāo)emb表達(dá)增高，且其表達(dá)受多種因子的調(diào)控[53-55]有關(guān)。

六、對(duì)PZA的耐藥性檢測(cè)

(1)吡嗪酰胺酶編碼基因pncA突變(68%～97%)是導(dǎo)致MTB耐PZA的最常見(jiàn)原因，突變廣泛分布于編碼基因(約占97%)和啟動(dòng)子區(qū)域(約占3%)；目前，大約在400個(gè)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)600多個(gè)基因多態(tài)性，相對(duì)熱點(diǎn)區(qū)域位于3～17、61～85和132～142位密碼子[56-57]。通過(guò)分析，pncA突變檢測(cè)PZA耐藥性的分子DST在MDR-TB分離株中具有較高的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值；在非MDR-TB分離株中具有較高的陰性預(yù)測(cè)值，可排除對(duì)PZA耐藥[58-59]。但少數(shù)(8%)對(duì)PZA的敏感株也出現(xiàn)pncA突變[13]。(2)MTB 對(duì)PZA通常是敏感的，而且許多MDR-TB患者肺部長(zhǎng)期有炎癥，理論上會(huì)產(chǎn)生有利于PZA活性的酸性環(huán)境。(3)牛分枝桿菌和卡介菌的pncA存在His57Asp置換，而使其對(duì)PZA呈現(xiàn)天然抗藥性[60]。(4)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)中其他分枝桿菌(如非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌)可能缺乏吡嗪酰胺酶而呈現(xiàn)天然抗藥性[61]。

七、對(duì)Sm的耐藥性檢測(cè)[62]

(1)70%～95%的MTB耐Sm是由于其核糖體蛋白S12編碼基因(rpsL)和(或)16S rRNA編碼基因(rrs)突變所致，rpsL的突變率顯著高于rrs突變，rpsLK43R突變的發(fā)生率最高，少數(shù)分離株發(fā)生K88R突變，rpsL基因突變檢測(cè)具有很高的特異度[63]；rrs突變常發(fā)生于513位核苷酸。(2)rrs基因A513C突變可引起MTB對(duì)Sm、Km、Am較高水平的耐受[64]。

八、對(duì)二線(xiàn)注射類(lèi)抗結(jié)核藥物的耐藥性檢測(cè)

(1)rrs基因突變通常導(dǎo)致MTB對(duì)Km、Am和Cm耐藥，rrs基因突變檢測(cè)具有較高的特異度，但敏感度差異較大[65]。(2)Sm、Km、Am和Cm之間通常存在不同程度的交叉耐藥性，通常認(rèn)為Sm與Km、Am 為單向交叉耐藥，Km與Am及Cm為雙向交叉耐藥，Sm、Km、Am與Cm為單向交叉耐藥[66]。MDR-MTB對(duì)Km的耐藥率高于Am和Cm，對(duì)Km高水平耐藥時(shí)一般對(duì)Am也呈現(xiàn)高水平耐藥，而對(duì)Cm可能為高水平耐藥、也可能為低水平耐藥。對(duì)Km低水平耐藥時(shí)，對(duì)Am和Cm可能呈現(xiàn)低水平耐藥、也可能表現(xiàn)為敏感[22]。(3)rrs基因不同性質(zhì)的突變并不一定意味著MTB對(duì)Sm、Km、Am和Cm這4種藥物都有耐藥性，對(duì)每種藥物的耐藥水平可能會(huì)不同，呈現(xiàn)不同的MICs，其交叉耐藥的程度尚未完全了解[64-67]。(4)rrs基因最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)是A1401G(50%～65%)，該突變可引起對(duì)Km、Am呈現(xiàn)較高水平的耐受，對(duì)Cm呈現(xiàn)中等水平的抗性[22,68]。(5)MTBeis啟動(dòng)子區(qū)域突變可引起對(duì)Km低到中等水平的耐受，而對(duì)Am和Cm呈現(xiàn)較低水平的抗性[69]。

九、對(duì)FQs的耐藥性檢測(cè)[70-72]

(1)MTBgyrA和gyrB突變與對(duì)Ofx和Lfx的表型耐藥密切相關(guān)，但與對(duì)Mfx和加替沙星(Gfx)表型耐藥之間的相關(guān)性尚不十分清楚。(2)gyrA基因突變是對(duì)FQ類(lèi)抗結(jié)核藥物耐藥的最主要原因，MTBgyrA和gyrB突變?cè)谀虵Qs菌株中g(shù)yrA突變率為65%～92%，gyrA突變通常導(dǎo)致MTB對(duì)FQs的中、高水平耐藥。(3)gyrA基因突變大多發(fā)生在基因保守區(qū)第67～106位密碼子，94位Asp→Asn或Tyr或Gly或His或Ala、90位Ala→Val和91位Ser→Pro是較常見(jiàn)的突變位點(diǎn)。其中94位氨基酸密碼子突變的菌株通常FQ的 MIC≥2.0 μg/ml，而其他密碼子突變菌株的MIC較低。(4)gyrB突變通常導(dǎo)致低耐FQs，gyrB突變率很低[73]。(5)FQs各類(lèi)藥物之間呈現(xiàn)不完全的雙向交叉耐藥性，如MTB對(duì)Ofx、Lfx耐藥，可能對(duì)Mfx和Gfx仍是敏感的；gyrA突變株對(duì)Mfx 的MICs通常低于Ofx、Lfx[74]。

存在的問(wèn)題及展望

目前，DST檢測(cè)技術(shù)和臨床應(yīng)用仍存在諸多問(wèn)題亟待進(jìn)一步研究解決，新的、快速并敏感的分子DST方法仍需進(jìn)一步研發(fā)。

(1)MTB低水平的表型耐藥導(dǎo)致對(duì)DST檢測(cè)結(jié)果分析的復(fù)雜性增加。目前，發(fā)現(xiàn)一些耐藥相關(guān)基因突變會(huì)產(chǎn)生“低水平”耐藥性，使表型DST結(jié)果不明確并可能出現(xiàn)敏感結(jié)果，導(dǎo)致兩者結(jié)果不一致。(2)PZA 是DR-TB患者治療方案的重要組成成分之一，最近研究發(fā)現(xiàn)對(duì)PZA的耐藥率增高，并且隨著其他藥物耐藥風(fēng)險(xiǎn)增加而增高，尤其是在MDR-TB患者中[75]。因此，需常規(guī)開(kāi)展對(duì)PZA的DST，但吡嗪酰胺酶只有在低pH(pH 5.00～6.00)的條件下才有活性，目前表型DST中只有BACTEC MGIT 960已商業(yè)化而可供使用。由于表型DST基于酸性培養(yǎng)基，以及所用的臨界藥物濃度、結(jié)果的不一致性及易出現(xiàn)假陽(yáng)性等原因，WHO并不認(rèn)可對(duì)PZA進(jìn)行表型DST的檢測(cè)結(jié)果[24,76]。pncA突變檢測(cè)是目前PZA耐藥性檢測(cè)最常用的方法，但廣泛分布的pncA基因突變使得分子DST檢測(cè)很困難；而且部分pncA突變并不引起表型耐藥，若采用不了解基因突變性質(zhì)的突變檢測(cè)技術(shù)有可能出現(xiàn)假陽(yáng)性。因此，pncA基因序列分析(如靶向DNA測(cè)序、高通量測(cè)序)可能是對(duì)PZA進(jìn)行分子DST的未來(lái)趨勢(shì)[77]。小部分對(duì)PZA表型耐藥的菌株需進(jìn)一步進(jìn)行rpsA基因突變的分析。(3)盡管WHO建議MDR-TB與XDR-TB患者的治療應(yīng)根據(jù)對(duì)一、二線(xiàn)抗結(jié)核藥物的DST結(jié)果進(jìn)行個(gè)體化治療[78]，但對(duì)二線(xiàn)抗結(jié)核藥物進(jìn)行DST的臨床意義尚存在爭(zhēng)議，方法還需標(biāo)準(zhǔn)化以使其結(jié)果更可靠[79-81]。應(yīng)進(jìn)一步確定或修訂表型DST方法的藥物臨界濃度，如Mfx、Gfx、Cm、Eto、Cs和PZA等。用于治療MDR-TB的新藥或具有抗結(jié)核作用的抗生素，如Bdq、Dlm、Lzd等的表型DST方法尚需進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證和推廣應(yīng)用。由于定義MTB對(duì)二線(xiàn)抗結(jié)核藥物耐受的關(guān)鍵藥物臨界濃度非常接近MICs，應(yīng)進(jìn)一步研究各類(lèi)耐藥基因型與藥物MICs、表型DST、臨床療效之間的關(guān)系，開(kāi)展耐藥基因功能的遺傳學(xué)研究[80,82]。鑒于目前用于臨床對(duì)二線(xiàn)抗結(jié)核藥物的分子DST檢測(cè)試劑尚不能完全滿(mǎn)足臨床DR-TB診斷和治療的需求，仍有許多對(duì)二線(xiàn)抗結(jié)核藥物的耐受性檢測(cè)方法尚未建立。因此，無(wú)論是表型還是基因型檢測(cè)對(duì)二線(xiàn)抗結(jié)核藥物的DST檢測(cè)結(jié)果均需慎重解讀；需進(jìn)一步闡明其耐藥機(jī)制，并深入研究以提高對(duì)二線(xiàn)藥物采用DST預(yù)測(cè)臨床敏感或耐藥TB的診斷效能，開(kāi)發(fā)新的耐藥性快速檢測(cè)試劑。(4)目前，缺乏足夠的臨床研究數(shù)據(jù)證明耐藥基因型指導(dǎo)臨床治療的價(jià)值，這是因?yàn)門(mén)B采用多藥聯(lián)合化療的模式，使得這項(xiàng)研究非常困難。實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員與臨床醫(yī)師需緊密合作，開(kāi)拓新思路，開(kāi)展不同耐藥基因型與TB化療效果的相關(guān)性研究，深入探討耐藥基因型指導(dǎo)化療的臨床意義及其對(duì)流行病學(xué)的影響。(5)目前，在臨床應(yīng)用的分子DST檢測(cè)試劑主要用于直接檢測(cè)處理后的痰標(biāo)本和間接檢測(cè)MTB培養(yǎng)分離物。在檢測(cè)其他呼吸道內(nèi)、外標(biāo)本(如支氣管肺泡灌洗液、胃液、支氣管肺活檢組織、胸腔積液、腦脊液、腹腔積液、肺外病灶組織)時(shí)的敏感度仍不夠理想，需建立更多高敏感度的耐藥性檢測(cè)新技術(shù)(如數(shù)字PCR)，并轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品應(yīng)用于臨床。(6)目前，只有實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了模塊封閉性自動(dòng)化檢測(cè)，尚需進(jìn)一步研發(fā)將MTB分子DST和對(duì)一、二線(xiàn)藥物耐藥基因型檢測(cè)自動(dòng)化、一體化和智能化的產(chǎn)品，以解決分子DST檢驗(yàn)項(xiàng)目分散、手工操作多、人力投入多和工作量大的問(wèn)題。

參與討論與撰寫(xiě)本共識(shí)的主要單位和專(zhuān)家(排名不分先后)：北京，解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心 全軍結(jié)核病研究所(吳雪瓊、梁建琴、安慧茹、王仲元、凌彥博、張俊仙、白雪娟)；同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院結(jié)核病臨床中心(肖和平、范琳)；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院(黃海榮、陳效友)；北京，中國(guó)防癆協(xié)會(huì)秘書(shū)處(成詩(shī)明)；北京，《中國(guó)防癆雜志》期刊社(薛愛(ài)華、李敬文、范永德)；北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心耐多藥防治部(李仁忠)；北京，中國(guó)食品藥品檢定研究院(王國(guó)治)；廣州市胸科醫(yī)院(譚守勇、譚耀駒)；鄭州，河南省疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室(李輝)；濟(jì)南，山東大學(xué)附屬山東省胸科醫(yī)院漢光微生物實(shí)驗(yàn)室(鄧云峰)；北京結(jié)核病控制研究所中心實(shí)驗(yàn)室(丁北川、王甦民)；天津市結(jié)核病控制中心結(jié)核參比實(shí)驗(yàn)室(王春花)；重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心中心實(shí)驗(yàn)室(李同心)，結(jié)核病研究室(楊松、鐘敏)；福建省福州肺科醫(yī)院結(jié)核科(陳曉紅)；哈爾濱，黑龍江省傳染病防治院結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室(侯艷杰)；長(zhǎng)沙，湖南省胸科醫(yī)院 湖南省結(jié)核病防治所檢驗(yàn)科(譚云洪)；沈陽(yáng)市胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科(孫炳奇)