催吐蘿芙木離體培養(yǎng)和植株再生體系的建立

董佳穎，楊小田，向小群，郭晉雅，高峰

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催吐蘿芙木離體培養(yǎng)和植株再生體系的建立

董佳穎，楊小田，向小群，郭晉雅，高峰*

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣州 510631)

為建立催吐蘿芙木(Afzel.)的快繁再生體系，以莖段為外植體，比較了植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)其愈傷組織誘導(dǎo)、分化及生根的影響。結(jié)果表明，誘導(dǎo)愈傷組織的適宜培養(yǎng)基為MS+2,4-D 1.0 mg L–1+TDZ 0.5 mg L–1或MS+2,4-D 2.0 mg L–1+TDZ 0.5 mg L–1，出愈率達(dá)100%且生長狀況良好；誘導(dǎo)叢生芽的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg L–1+NAA 0.1 mg L–1,出芽率為46.6%，平均出芽數(shù)為3.04。這為催吐蘿芙木的快速繁殖和遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定了基礎(chǔ)。

催吐蘿芙木；愈傷組織；再生；組織培養(yǎng)

蘿芙木為夾竹桃科(Apocnyaceae)蘿芙木屬()植物的總稱，是一類天然名貴的熱帶藥用植物。富含多種生物堿，如利血平、阿馬尼新、育亨賓等, 可以用于治療多種疾病[1–5]。蘿芙木屬植物共有135種和變種，我國產(chǎn)9種，比較重要的有中國蘿芙木()、云南蘿芙木()、催吐蘿芙木()和印度蘿芙木()[6]。

有研究表明，催吐蘿芙木的各項(xiàng)生長指標(biāo)明顯高于其他蘿芙木物種。云南蘿芙木植株較小，生物產(chǎn)量低，利血平含量也低；印度蘿芙木植株中等, 生物產(chǎn)量也較多，利血平含量高[5]；催吐蘿芙木植株高大，生物產(chǎn)量多，利血平含量高；作為提取利血平的原料開發(fā)，應(yīng)首選催吐蘿芙木和印度蘿芙木[7]。在國內(nèi)催吐蘿芙木已用作提取利血平的原料，并將其制成治療高血壓的降壓靈(verticil)和降壓平(resemine)等藥品應(yīng)用于臨床[8]。

然而，由于蘿芙木的種子繁殖出芽率低，生長緩慢，扦插繁殖生根困難[7]，無法用于大規(guī)模的生產(chǎn)。因此，采用離體培養(yǎng)蘿芙木無疑具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。目前，關(guān)于蘿芙木的組織培養(yǎng)僅在印度蘿芙木和云南蘿芙木中有報(bào)道[8–11]，而催吐蘿芙木的離體培養(yǎng)及植株再生尚未見報(bào)道。本文以催吐蘿芙木的莖段和葉片為外植體，通過比較不同植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)其愈傷組織誘導(dǎo)、分化及試管苗生根的影響，以建立催吐蘿芙木的離體培養(yǎng)植株再生體系，為催吐蘿芙木的快速繁殖及遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

催吐蘿芙木(Afzel.)由華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院周先葉副教授鑒定并提供, 種植于該校生物園內(nèi)。

1.2 外植體的表面消毒

選取幼嫩莖段或幼葉作為外植體，用洗潔精浸泡和流水沖洗30 min后，蒸餾水沖洗2~3次，潔凈紗布吸干。用70%乙醇浸泡20 s后，用2%次氯酸鈉消毒7~8 min，再用無菌水沖洗5~8次。

1.3 愈傷組織的誘導(dǎo)

將消毒后的幼莖切成長度為5 mm的莖段，葉片切成0.5 cm×0.5 cm接種于含有不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合的MS培養(yǎng)基上，在28℃黑暗培養(yǎng)。每3 d觀察1次，30 d統(tǒng)計(jì)出愈率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)。每處理接種27個(gè)外植體，重復(fù)3次。

1.4 芽的分化誘導(dǎo)

將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含6-BA (1.0~4.0 mg L–1)+ NAA (0.05~0.5 mg L–1)的MS培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)1周后轉(zhuǎn)為16 h d–1光照培養(yǎng)(光強(qiáng)2 000mol m–2s–1)。每3 d觀察1次，6周后統(tǒng)計(jì)出芽率=(分化出芽的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織總數(shù))×100%。

1.5 叢生芽的生根誘導(dǎo)

叢生芽生長至1~2 cm長時(shí)，切成單芽，扦插至含不同濃度NAA和IBA的1/2MS生根培養(yǎng)基中。4周后統(tǒng)計(jì)生根率和根的數(shù)量，篩選最適生根培養(yǎng)基。

1.6 煉苗移栽

將已生根試管苗的培養(yǎng)瓶蓋擰松(但不揭開), 自然光照2~3 d后再揭去瓶蓋。在自然光照下經(jīng)過5~7 d練苗，將試管苗移栽入盛有營養(yǎng)土的培養(yǎng)缽中，并觀察成活情況。

2 結(jié)果和分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

分別將外植體接種在含生長素類激素2,4-D、NAA、IBA和含細(xì)胞分裂素類激素6-BA或TDZ的MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行不同植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響的單因素試驗(yàn)。結(jié)果表明，幼莖切段在兩端的切口處能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織(圖1: A)，但不同植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效果不同(表1), 除IBA和6-BA外，2,4-D、NAA和TDZ均能誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生，且TDZ>2,4-D>NAA。

從表2可見，在2.0 mg L–12,4-D+0.5 mg L–1NAA，2.0 mg L–12,4-D+0.5 mg L–16-BA，1.0 mg L–12,4-D+0.5 mg L–1TDZ，2.0 mg L–12,4-D+0.5 mg L–1TDZ,2.0 mg L–16-BA+0.5 mg L–1NAA的培養(yǎng)基上，出愈率均為100%。外植體在2,4-D+TDZ組合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，開始產(chǎn)生愈傷組織，一周后愈傷組織較明顯，三周后整個(gè)外植體基本被愈傷組織覆蓋,且愈傷組織生長狀況好，愈傷組織量大；在2,4-D+ 6-BA和2,4-D+NAA的組合中，外植體啟動(dòng)愈傷組織發(fā)生的時(shí)間稍慢，一般為一周左右；而在6-BA+ NAA的組合中，愈傷組織易褐化。綜合考慮愈傷組織啟動(dòng)時(shí)間、出愈率和愈傷組織生長情況, 誘導(dǎo)催吐蘿芙木產(chǎn)生愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+2,4-D 1.0 mg L–1+TDZ 0.5 mg L–1或MS+2,4-D 2.0 mg L–1+ TDZ 0.5 mg L–1。

2.2 6-BA與NAA配比對(duì)愈傷組織芽分化的影響

不同濃度6-BA與NAA配比對(duì)催吐蘿芙木誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生不定芽具有一定的影響(表3)。6-BA濃度對(duì)愈傷組織的不定芽分化的影響尤為明顯。隨6-BA濃度的增加，愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的分化率也提高，但并不呈線性正相關(guān)。同時(shí)，6-BA/NAA對(duì)愈傷組織分化出芽有明顯影響，比值低時(shí)促進(jìn)愈傷組織生長，抑制芽的分化，分化的芽矮小畸形; 隨6-BA/NAA比值的增加，芽分化率也逐漸增大，愈傷組織也由原來的黃白色逐漸變?yōu)榫G色，表面芽點(diǎn)突出；當(dāng)6-BA/NAA比值達(dá)到30時(shí)，芽的數(shù)量和生長狀態(tài)為最佳(圖1: B)。

表1 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表2 植物生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)催吐蘿芙木愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3 試管苗的生根培養(yǎng)與煉苗

不定芽在添加NAA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周后, 基部分化出不定根(圖1: C)，同時(shí)，隨NAA濃度增加生根率和生根數(shù)呈先升高后下降的趨勢(shì)；NAA濃度為0.1 mg L–1時(shí)，生根數(shù)量少，長出的根細(xì)而長; NAA濃度為0.5 mg L–1時(shí)，生根數(shù)量多，且根粗而短；NAA濃度達(dá)到1.0 mg L–1時(shí)，生根率下降到60%;當(dāng)NAA濃度為2.0 mg L–1時(shí)，生根率僅為13.3%。這說明低濃度的NAA利于生根，而高濃度的NAA對(duì)生根具有抑制作用。從生根數(shù)和根的生長情況來看，IBA對(duì)試管苗根的誘導(dǎo)效果較NAA差。當(dāng)IBA濃度為0.5~1.0 mg L–1時(shí)，能不同程度誘導(dǎo)生根, 但根數(shù)量少，且比較細(xì)長。兩種生長素等比例混合對(duì)根的誘導(dǎo)效果并沒有表現(xiàn)出疊加效應(yīng)，甚至與單一生長素相比，產(chǎn)生根的數(shù)量更少，誘導(dǎo)效果更差。因此，綜合生根率、生根數(shù)和根生長情況來看，催吐蘿芙木生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.5 mg L–1，生根率達(dá)100%，且根的生長狀態(tài)最佳, 從而形成完整的再生植株(圖1: D)。選擇生長健壯、株高、莖粗和木質(zhì)化程度高的完整再生植株進(jìn)行煉苗(圖1: E)，然后將再生植株移栽至土壤，幼苗成活且生長狀態(tài)良好(圖1: F)。

表3 6-BA與NAA配比對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

3 討論

植物生長調(diào)節(jié)劑在植物離體培養(yǎng)中起著啟動(dòng)愈傷組織形成和芽、根的分化等作用，其種類和配比是影響愈傷組織產(chǎn)生和分化的主要因素。其中生長素具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和促進(jìn)生根等生理作用，細(xì)胞分裂素具有引起細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)芽的形成和促進(jìn)芽的生長等生理作用。蘿芙木屬植物愈傷組織誘導(dǎo)中，常用的生長素是2,4-D和NAA，細(xì)胞分裂素是6-BA。印度蘿芙木愈傷組織誘導(dǎo)使用的是6-BA和NAA組合[8]；而云南蘿芙木愈傷組織誘導(dǎo)使用的是2,4-D和6-BA組合[11]。本研究結(jié)果表明，2,4-D和TDZ單獨(dú)使用對(duì)催吐蘿芙木莖段愈傷組織的啟動(dòng)效果優(yōu)于NAA、IBA和6-BA，且2,4-D與TDZ或6-BA的組合效果更佳；其中2,4-D與TDZ是誘導(dǎo)催吐蘿芙木愈傷組織形成的最佳組合，啟動(dòng)愈傷組織的時(shí)間快且出愈率高。從芽的分化誘導(dǎo)來看，云南蘿芙木不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基是MS+6-BA 3.0 mg L–1+NAA 0.05 mg L–1[11]；印度蘿芙木則為MS+6- BA 1.0 mg L–1+NAA 0.1 mg L–1[8]；而催吐蘿芙木則是MS+6-BA 3.0 mg L–1+NAA 0.1 mg L–1。這說明蘿芙木屬不同物種的愈傷組織誘導(dǎo)和分化所需的植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度存在一定的差異。

云南蘿芙木用葉片，而印度蘿芙木用腋芽、葉片和頂芽都可成功誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生和分化，并獲得再生植株[8–11]。本文采用2,4-D與TDZ或6-BA組合可誘導(dǎo)催吐蘿芙木葉片產(chǎn)生愈傷組織，但經(jīng)過幾個(gè)月的培養(yǎng)仍未分化。高燕等[11]對(duì)印度蘿芙木組織培養(yǎng)的研究表明，葉片容易產(chǎn)生愈傷組織，但再分化能力較差，這與本研究結(jié)果相一致。而以云南蘿芙木的葉片作為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織可正常分化，并獲得再生植株[8]。這可能是由于蘿芙木不同物種或不同組織對(duì)植物生長調(diào)節(jié)劑的敏感度不同所致，但具體原因尚需進(jìn)一步研究。

此外，蘿芙木離體培養(yǎng)技術(shù)除了可用于快速繁殖外，還可用于作為基因工程技術(shù)的受體系統(tǒng)，通過根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因到蘿芙木組織內(nèi)，進(jìn)行品種改良與器官再生[12–15]，培育出優(yōu)良高產(chǎn)的催吐蘿芙木新品種。本文所建立的催吐蘿芙木組織培養(yǎng)及植株再生體系將為其遺傳轉(zhuǎn)化奠定重要的技術(shù)基礎(chǔ)。

[1] ZHENG Y, LIAO Z H. Research progress of tissue culture technology of[J]. J Anhui Agric Sci, 2011, 39(15): 8929– 8930,8984. doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2011.15.042.鄭月, 廖志華. 蘿芙木組織培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(15): 8929–8930,8984. doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2011.15.042.

[2] YU J, MA Y, DRISKO J, et al. Antitumor activities ofextract and potentiation of carboplatin effects against ovarian cancer [J]. Curr Ther Res, 2013, 75: 8–14. doi: 10.1016/j.curtheres. 2013. 04.001.

[3] Rao B G, Rao P U, Rao E S, et al. Evaluation ofantibacterialactivity and anti-inflammatory activity for different extracts ofL. root bark [J]. Asian Pac J Trop Biomed, 2012, 2(10): 818–821. doi: 10.1016/S2221-1691(12)60235-4.

[4] Lobay D.in the treatment of hypertension [J]. Integr Med (Encinitas), 2015, 14(3): 40–46.

[5] EZEIGBO I I, EZEJA M I, MADUBUIKE K G, et al. Antidiarrhoeal activity of leaf methanolic extract of[J]. Asian Pac J Trop Biomed, 2012, 2(6): 430–432. doi:10.1016/S2221-1691(12) 60070-7.

[6] ZHAO Y S, ZHOU Y X, CHA Y S. Introduction and domestication ofand its prospects for development [J]. Chin J Ethnomed Ethnopharm, 2006(3): 179–180.趙永生, 周亞興, 查云盛. 云南蘿芙木引種馴化栽培及發(fā)展前景[J]. 中國民族民間醫(yī)藥雜志, 2006(3): 179–180.

[7] ZHANG L X, GUO S R, LI X L, et al. The main insect pests and control of[J]. J Chin Med Mat, 2006, 29(12): 1276–1278. doi:10.3321/j.issn:1001-4454.2006.12.005.張麗霞, 郭紹榮, 李學(xué)蘭, 等. 催吐蘿芙木的主要蟲害及其防治[J]. 中藥材, 2006, 29(12): 1276–1278. doi:10.3321/j.issn:1001-4454.2006.12.005.

[8] LONG J X, CAO F X, CAO J W, et al. Callus inducement and plantlet regeneration from leaves ofTsiang [J]. J CS Univ For Technol, 2008, 28(3): 49–54. doi:10.3969/j.issn.1673-923X. 2008.03.010.龍絳雪, 曹福祥, 曹基武, 等. 云南蘿芙木葉愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 28(3): 49–54. doi:10.3969/ j.issn.1673-923X.2008.03.010.

[9] Baksha R, Jahan M A A, Khatun R, et al.rapid clonal propagation of(Linn.) Benth [J]. Bangladesh J Sci Ind Res, 2007, 42(1): 37–44. doi: 10.3329/bjsir.v42i1.353.

[10] Shahrear A, Amin M N, Azad M A K, et al. Micropropagation and plant regeneration ofby tissue culture technique [J]. Pakistan J Biol Sci, 2002, 5(1): 75–79. doi:10.3923/pjbs. 2002.75.79.

[11] GAO Y, LI S L, BAI Y B, et al. Study on[J]. Trop Agric Sci Technol, 2009, 32(2): 29–31,34. doi:10.3969/j. issn.1672-450X.2009.02.011.高燕, 李守嶺, 白燕冰, 等. 印度蘿芙木組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科技, 2009, 32(2): 29–31,34. doi:10.3969/j.issn.1672-450X. 2009.02.011.

[12] BENJAMIN B D, ROJA G, HEBLE M R.mediated transformation ofRegeneration and alkaloid synthesis [J]. Plant Cell Tiss Org, 1993, 35(3): 253–257. doi: 10.1007/BF00037278.

[13] SUDHA C G, REDDY B O, RAVISHANKAR G A, et al. Production of ajmalicine and ajmaline in hairy root cultures ofHook f., a rare and endemic medicinal plant [J]. Biotechnol Lett, 2003, 25(8): 631–636. doi:10.1023/A:1023012114628.

[14] Ding L M, Long R J, Zhu T X. The effect of 2,4-dichlorophen- oxyacetic acid (2,4-D) and 6-benzyladenine (6-BA) on callus induction of bluegrasses [J]. Grassl Turf, 2003(1): 34–37. doi: 10.3969/j.issn. 1009-5500.2003.01.010.丁路明, 龍瑞軍, 朱鐵霞. 2,4-D和6-BA對(duì)早熟禾愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J]. 草原與草坪, 2003(1): 34–37. doi: 10.3969/j.issn.1009-5500. 2003.01.010.

[15] Wang H, Liao Z H, Tian G X, et al. Genetic transformation oftsiang by[J]. J SW China Norm Univ (Nat Sci), 2006, 31(2): 137–141. doi: 10.3969/j.issn. 1000-5471.2006.02.032.王泓, 廖志華, 田桂香, 等. 發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)云南蘿芙木的遺傳轉(zhuǎn)化[J]. 西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2006, 31(2): 137–141. doi: 10.3969/j.issn.1000-5471.2006.02.032.

Culture and Establishment of Rapid Regeneration System of

DONG Jia-ying, YANG Xiao-tian, XIANG Xiao-qun, GUO Jin-ya, GAO Feng*

(School of Life Sciences, South China Normal University,Guangzhou 510631, China)

To constructe the rapid regeneration system of Rauvolfia vomitoriaAfzel., the effects of plant growth regulators on callus induction, differentiation, and rooting were studied with young stems as explants. The results showed that the optimal medium for callus induction was MS+2,4-D 1.0 mg L–1+TDZ 0.5 mg L–1or MS+2,4-D 2.0 mg L–1+TDZ 0.5 mg L–1with callus induction rate of 100%. The optimal medium for callus differentiation was MS+6-BA 3.0 mg L–1+NAA 0.1 mg L–1with shooting rate of 46.6% and average buds of 3.04. So, these would lay a foundation for studying on rapid regeneration and genetic transformation of R. vomitoria.

Afzel.; Callus; Regeneration; Tissue culture

10.11926/jtsb.3935

2018-04-25

2018-07-04

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31171601)資助

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31171601).

董佳穎(1994~ )，女，碩士研究生，主要從事植物遺傳調(diào)控研究。E-mail: ddongjiaying@163.com

E-mail: peak0041@vip.sina.com