獼猴桃POD基因的克隆和表達(dá)分析

陳義挺, 賴瑞聯(lián), 馮新, 高敏霞, 程春振, 陳文光, 吳如健

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獼猴桃基因的克隆和表達(dá)分析

陳義挺1, 賴瑞聯(lián)1, 馮新1, 高敏霞1, 程春振2, 陳文光1, 吳如健1*

(1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，福州 350013; 2. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福州 350002)

為了解獼猴桃基因的表達(dá)調(diào)控功能，采用RT-PCR技術(shù)從‘米良1號(hào)’獼猴桃(‘Miliang-1’)克隆了2個(gè)POD家族成員基因(和)。結(jié)果表明，和開(kāi)放閱讀框分別為984和957 bp, 預(yù)測(cè)分別編碼327和318個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)分別為MF774100和MF774101。AdPOD27和AdPOD64為親水性堿性蛋白，屬于植物亞鐵紅素依賴Ⅲ型POD超家族成員，含有信號(hào)肽、跨膜螺旋結(jié)構(gòu)和磷酸化位點(diǎn)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分別定位于線粒體和細(xì)胞外。qRT-PCR結(jié)果表明，在脫落酸(ABA)和4℃處理時(shí)表達(dá)量急劇上升，而只在ABA處理時(shí)表達(dá)量顯著提高。此外，表達(dá)量與POD活性、表達(dá)量均存在顯著相關(guān)性。因此，和可能在獼猴桃果實(shí)軟化、低溫響應(yīng)和ABA誘導(dǎo)等過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能。

獼猴桃；過(guò)氧化物酶；果實(shí)軟化；低溫；脫落酸

獼猴桃()是獼猴桃科(Actini- diaceae)獼猴桃屬落葉藤本果樹(shù)，果實(shí)中富含維生素C、亞麻酸、氨基酸和微量元素等，被認(rèn)為是20世紀(jì)野生果樹(shù)馴化最成功的果種之一[1]。然而，獼猴桃果實(shí)耐貯性差，采后易軟化腐爛，嚴(yán)重影響獼猴桃可食性和商品價(jià)值，如何延長(zhǎng)獼猴桃貯藏保鮮期成為獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟待解決的難題[2]。

過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)是由單一肽鏈與卟啉組成的一種血紅素蛋白，能夠以鐵卟啉為輔基，以H2O2為電子受體催化底物氧化，在植物體內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用。POD是多基因家族編碼的同工酶，功能廣泛且豐富多樣，在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和衰老過(guò)程中，POD活性水平均有強(qiáng)烈變化[3–4]。此外，POD還參與植物激素調(diào)控、活性氧代謝、抗病蟲(chóng)、耐干旱脅迫等生理過(guò)程，是植物響應(yīng)逆境脅迫的關(guān)鍵酶之一。過(guò)表達(dá)過(guò)氧化物酶基因明顯提高番茄對(duì)苯酚脅迫的耐受性[5]；基因能夠響應(yīng)缺硼脅迫改變柑桔砧木中木質(zhì)素含量[6]；POD活性會(huì)影響溫州蜜柑貯藏過(guò)程中果皮和果肉中的枯水發(fā)生，進(jìn)而影響果實(shí)采后衰老[7]。

已有研究表明，POD在獼猴桃采后貯藏和保鮮過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Zolfaghari等[8]認(rèn)為，低溫下獼猴桃POD活性均提高，長(zhǎng)時(shí)間冷藏于(1±1)℃, 相對(duì)濕度(80±5)%有利于維持獼猴桃最佳品質(zhì)。獼猴桃花后不同時(shí)間采收的果實(shí)中POD活性也存在顯著差異[9]。在獼猴桃采后貯藏效果影響因素研究中，一氧化氮、1-甲基環(huán)丙烯、氮?dú)?、硫化氫和槲皮素等均能上調(diào)獼猴桃果肉中POD活性，維持風(fēng)味品質(zhì)和較高的抗病能力，減少果實(shí)冷藏冷害，延緩果實(shí)衰老，但也可能引起部分品種果心木質(zhì)化[10–17]; 而草酸能夠顯著抑制獼猴桃果肉中POD等木質(zhì)素合成相關(guān)酶的活性，減輕因木質(zhì)化引起的果實(shí)品質(zhì)劣變[18]。此外，微波、高壓和熱處理也會(huì)影響獼猴桃果汁和果醬中POD活性，從而改變其貯藏效果[19–20]。

低溫貯藏是延長(zhǎng)獼猴桃果實(shí)貨架期的有效途徑，而脫落酸(abscisic acid, ABA)在獼猴桃后熟衰老過(guò)程中能夠促進(jìn)水解酶活性增強(qiáng)，參與獼猴桃果實(shí)成熟過(guò)程的軟化啟動(dòng)[21]。目前，獼猴桃POD相關(guān)研究主要集中在POD活性改變對(duì)果實(shí)貯藏、衰老和品質(zhì)等生理方面影響，其分子機(jī)理尚不明確。低溫和ABA作為目前已知的獼猴桃軟化兩個(gè)重要相關(guān)因素，其在軟化過(guò)程中與POD的相互作用關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制也未見(jiàn)報(bào)道。而在前期研究中，通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，和在獼猴桃不同貯藏處理組中存在明顯的轉(zhuǎn)錄水平差異。鑒于此，試驗(yàn)以‘米良1號(hào)’獼猴桃為材料，對(duì)獼猴桃基因組中預(yù)測(cè)的這2個(gè)基因家族成員進(jìn)行驗(yàn)證和生物信息學(xué)分析，同時(shí)研究了獼猴桃貯藏軟化、低溫和ABA處理下POD活性和表達(dá)模式的相關(guān)性，以期為獼猴桃基因的調(diào)控功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用‘米良1號(hào)’獼猴桃(‘Miliang-1’)采自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所建寧獼猴桃基地。2017年9月份，采集大小相近，成熟度一致，無(wú)病蟲(chóng)害和機(jī)械損傷的果實(shí)，參考陳義挺等[22]的方法進(jìn)行處理，將獼猴桃隨機(jī)分為6組(編號(hào)1~6)，每組10個(gè)果實(shí)，組1為25℃不貯藏(對(duì)照)，組2為25℃中貯藏1周，組3~5分別為4℃下貯藏1、2和3周，組6為50 mg L–1的ABA浸泡2 min后于25℃中貯藏1周。每處理重復(fù)3次，經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃超低溫冰箱中用于POD活性測(cè)定和RNA提取。

1.2 POD活性測(cè)定

根據(jù)獼猴桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)和序列進(jìn)行驗(yàn)證，分別獲得長(zhǎng)度為984和957 bp的ORF序列，預(yù)測(cè)分別編碼327和318個(gè)氨基酸，起始密碼子均為ATG，終止密碼子分別為T(mén)AA和TAG (圖2, 3)。POD27和POD64與‘紅陽(yáng)’獼猴桃(‘Hongyang’)基因組相應(yīng)CDS序列(GenBank登錄號(hào): Achn356831和Achn132211)的相似性分別達(dá)到99.39%和99.16%，而和間的核苷酸和預(yù)測(cè)蛋白序列的相似性分別為49.45%和40.00%。通過(guò)NCBI比對(duì)，獼猴桃與煙草()和楊樹(shù)()的相似性分別為74%和73%，與葡萄()和向日葵()的相似性分別為82%和79%，表明所獲得的序列為獼猴桃相應(yīng)基因，分別命名為和，GenBank登錄號(hào)分別為MF774100和MF774101。

1.3 RNA提取和cDNA逆轉(zhuǎn)錄

以獼猴桃為內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)。將各cDNA樣品等體積混樣，隨后按10–1、30–1、90–1和270–1進(jìn)行梯度稀釋用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)擴(kuò)增效率篩選適宜的退火溫度檢測(cè)不同樣品中基因的相對(duì)表達(dá)量。采用Eppendorf Realplex4熒光定量PCR儀設(shè)置qRT-PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性30 s; 94℃變性10 s，TM退火15 s，72℃延伸10 s，循環(huán)40次；94℃ 15 s，60℃ 15 s，再以0.11 ℃ s–1的速度升溫至94℃保持15 s，繪制融解曲線。qRT-PCR反應(yīng)體系為2×TransStart?Top Green qPCR SuperMix 10L，Passive Reference Dye (50×) 0.4L，上下游引物(表1)各0.2mol L–1，模板0.5mol L–1。采用Excel 2003和SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、差異顯著性分析和相關(guān)性分析。

1.4 基因克隆

與對(duì)照相比，25℃和ABA處理的獼猴桃貯藏1周后POD活性顯著提高(<0.01)，此時(shí)獼猴桃硬度急劇下降，可溶性固形物含量上升，果實(shí)軟化[21]，可見(jiàn)POD參與了獼猴桃軟化過(guò)程，并且POD活性可能受ABA影響(圖1)。而低溫貯藏過(guò)程中，4℃貯藏1周后POD活性明顯提高，隨后急劇下降，3周后重新上升恢復(fù)到對(duì)照水平(>0.01)，說(shuō)明獼猴桃POD活性能夠響應(yīng)低溫誘導(dǎo)，在獼猴桃抗冷早期發(fā)揮重要作用?？梢?jiàn)，POD可能在獼猴桃貯藏軟化、ABA誘導(dǎo)和低溫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用。

作為一家全球性的集團(tuán)公司，Walter主要研發(fā)、生產(chǎn)和銷(xiāo)售用于金屬加工的精密刀具。品牌Walter是可轉(zhuǎn)位硬質(zhì)合金和PCD刀具系統(tǒng)生產(chǎn)商；品牌Walter Titex是高速鋼和整體硬質(zhì)合金鉆頭及鉸刀生產(chǎn)商；品牌Walter Prototyp以高速鋼、整體硬質(zhì)合金螺紋加工刀具和銑刀而聞名；Walter Valenite提供可轉(zhuǎn)位車(chē)刀片、鉆頭、銑刀和高技術(shù)含量的MODCO品牌非標(biāo)刀具。

表1 基因克隆、qRT-PCR引物序列

1.5 生物信息學(xué)分析

采用在線軟件進(jìn)行POD生物信息學(xué)分析, 基本理化性質(zhì)(ExPASy，http://web.expasy.org/ protparam/),信號(hào)肽(SignalP 4.1 Server，http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)，亞細(xì)胞定位(PSORT Prediction, https://psort.hgc.jp/form.html), 跨膜結(jié)構(gòu)(TMpred, http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html), 磷酸化位點(diǎn)(NetPhos 3.1 Server, http://www. cbs.dtu.dk/services/NetPhos/), 保守結(jié)構(gòu)域(NCBI conserved domain searc, https://www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，結(jié)合位點(diǎn)(PROSITE, http://www.expasy.ch/prosite)，卷曲螺旋結(jié)構(gòu)(COILS, http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html),蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)(PSIPRED, http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/ psipred/), 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)(SWISS-MODEL, https:// swissmodel.expasy.org/)。

1.6 qRT-PCR分析

采用植物多糖多酚試劑盒RNAprep pure Plant Kit提取獼猴桃總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外光分光光度計(jì)進(jìn)行質(zhì)量和濃度檢測(cè)合格后進(jìn)行等量混合，利用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄cDNA用于PCR擴(kuò)增，同時(shí)采用 TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Removel; TransGen Biotech, Beijing)逆轉(zhuǎn)錄cDNA用于qRT-PCR試驗(yàn)。

由于互聯(lián)網(wǎng)發(fā)展的歷史原因，以傳輸控制協(xié)議（TCP）/網(wǎng)際協(xié)議（IP）為核心的互聯(lián)網(wǎng)模型將“盡力而為”的可達(dá)性作為網(wǎng)絡(luò)的首要任務(wù)，這使得報(bào)文攜帶的目的地址在路由過(guò)程中成為了唯一的決定因素。這種僅依靠目的地址的路由方式，大大限制了對(duì)報(bào)文轉(zhuǎn)發(fā)控制的靈活性。并且隨著互聯(lián)網(wǎng)規(guī)模的迅速增長(zhǎng)和用戶業(yè)務(wù)的多樣化，傳統(tǒng)路由協(xié)議越來(lái)越難以滿足許多業(yè)務(wù)對(duì)服務(wù)質(zhì)量的要求。

2 結(jié)果和分析

2.1 POD活性

從已公布的獼猴桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(Kiwifruit Genome Database, http://bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/kiwi/home.cgi)中搜索并下載獼猴桃和基因可能序列(Gene ID：Achn356831和Achn132211),設(shè)計(jì)引物(表1)進(jìn)行ORF全長(zhǎng)擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：2×?HiFi PCR SuperMix 12.5L，cDNA模板50 ng，上下游引物各0.1mol L–1，補(bǔ)足高壓ddH2O至終體積25L。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，TM退火30 s，72℃延伸1 min，35次循環(huán)后再72℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切割預(yù)期目的條帶采用?Quick Gel Extraction Kit回收，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)采用?-T5 Zero Cloning Kit連接目的片段和載體，轉(zhuǎn)化到-T1感受態(tài)細(xì)胞中涂板，37℃暗下培養(yǎng)12 h后挑取單克隆子進(jìn)行PCR檢測(cè)，選取陽(yáng)性克隆子送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2.2 POD基因克隆

根據(jù)POD催化H2O2氧化特定底物，在470 nm有特征光吸收的原理，采用植物過(guò)氧化物酶試劑盒(購(gòu)自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)測(cè)定獼猴桃的POD活性。

2.3 POD生物信息學(xué)分析

芬頓氧化技術(shù)的影響因素主要為pH值、Fe2+、H2O2投加量及投加方式。普通的芬頓氧化技術(shù)中雙氧水加藥方式為單點(diǎn)投加，而這種加藥方式在雙氧水投加初期系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生大量羥基自由基，過(guò)多的羥基自由基不能完全與廢水中有機(jī)污染物發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致芬頓試劑產(chǎn)生的部分羥基自由基被無(wú)效消耗，最終導(dǎo)致雙氧水利用率下降以及降低預(yù)處理效果。本文主要研究多點(diǎn)投加芬頓氧化技術(shù)最佳反應(yīng)條件和多點(diǎn)投加方式的優(yōu)化(包括投加位點(diǎn)及投加量)。

2.4 POD表達(dá)模式分析

從圖5可見(jiàn)，25℃貯藏1周后獼猴桃的表達(dá)量是對(duì)照的1.5倍，而的表達(dá)量未出現(xiàn)顯著變化，說(shuō)明可能參與獼猴桃果實(shí)軟化過(guò)程，而的調(diào)控作用較不明顯。ABA處理后，和的表達(dá)量急劇上升，分別為對(duì)照的419和23倍，說(shuō)明二者均能夠響應(yīng)ABA誘導(dǎo)，尤其是。獼猴桃果實(shí)在4℃處理1周后，的表達(dá)量明顯上調(diào)，為對(duì)照的98倍，隨后下降，在低溫貯藏后期的調(diào)控也不明顯，而的表達(dá)量幾乎不發(fā)生改變。此外，在所有處理中，的表達(dá)量均高于，可見(jiàn)，可能在獼猴桃果實(shí)軟化、低溫響應(yīng)和ABA誘導(dǎo)等過(guò)程中比發(fā)揮更全面的調(diào)控功能。

生物信息學(xué)分析表明，AdPOD27和AdPOD64的基本理化性質(zhì)存在一定差異(表2)，二者均為親水性堿性蛋白，但AdPOD27屬于穩(wěn)定蛋白，而AdPOD64屬于不穩(wěn)定蛋白；AdPOD27中亮氨酸(Leu)含量最多，達(dá)到9.8%，其次是賴氨酸(Lys)和丙氨酸(Ala)，分別為8.3%和8.0%，而AdPOD64中絲氨酸(Ser)含量最多，達(dá)到11.3%，其次是Leu和Ala，均為10.1%。亞細(xì)胞定位表明，AdPOD27和AdPOD64可能分別定位于線粒體和細(xì)胞外，二者分別于氨基酸序列5?端第1~26位和第1~24位氨基酸含有信號(hào)肽。保守結(jié)構(gòu)域和結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)表明, AdPOD27和AdPOD64蛋白均屬于植物亞鐵紅素依賴Ⅲ型過(guò)氧化物酶超家族成員，主要參與細(xì)胞間隙和液泡的過(guò)氧化氫分解、生長(zhǎng)素代謝、木質(zhì)素合成和脅迫響應(yīng)等(圖2, 3)。TMpred分析表明，AdPOD27含有4個(gè)由內(nèi)向外和由外向內(nèi)的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)以及28個(gè)磷酸化位點(diǎn)，AdPOD64含有4個(gè)由內(nèi)向外和2個(gè)由外向內(nèi)的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，磷酸化位點(diǎn)個(gè)數(shù)為38。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，AdPOD27中-螺旋和-折疊分別占45.9%和4.6%，而AdPOD64中二者含量分別為47.8%和2.5%。SWISS-MODEL預(yù)測(cè)表明, AdPOD27和AdPOD64與棕櫚(, PDB: 4usc.1.A)的相似度分別達(dá)到45.12%和46.44%，以此為模型預(yù)測(cè)2個(gè)獼猴桃POD的三維結(jié)構(gòu)(圖4)。

2.5 相關(guān)性分析

采用SPSS19.0進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析, 結(jié)果表明，獼猴桃經(jīng)不同處理，的表達(dá)量與POD活性呈顯著正相關(guān)(=0.533,=0.023<0.05),而與的表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)(=0.947，=0<0.01)。此外，的表達(dá)量與POD活性也存在正相關(guān)關(guān)系，但不顯著(=0.430,=0.075>0.05)。可見(jiàn)，在獼猴桃果實(shí)軟化、低溫響應(yīng)和ABA誘導(dǎo)過(guò)程中,和可能相互影響，而可能通過(guò)上調(diào)和下調(diào)表達(dá)影響POD活性，從而起到更重要的調(diào)控作用。

“……這樁慘絕人寰的人身傷害案發(fā)生在28日深夜10點(diǎn)18分。被害人王大明是我市飛騰集團(tuán)董事長(zhǎng)兼總經(jīng)理。據(jù)王大明說(shuō)，兇手一共有三人，他在毫無(wú)防備的情況下被他們?nèi)胧乙u擊，由于兇手用絲襪套頭，王沒(méi)有看到兇手的真面目……多年來(lái)，王大明一直致力于飛騰集團(tuán)的發(fā)展壯大，為我市的經(jīng)濟(jì)發(fā)展……”

表2 AdPOD27和AdPOD64的基本理化性質(zhì)

3 討論

大量研究表明，POD在ABA介導(dǎo)的非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程中具有重要調(diào)控功能。外源噴施ABA能夠提高水稻()幼苗的POD活性，增強(qiáng)其清除自由基的能力從而獲得更高的抗寒能力[23]; 葉片或者根系外施ABA能夠增強(qiáng)POD等抗氧化酶活性，維持植物膜系統(tǒng)和光合器官的穩(wěn)定性，降低超氧陰離子和過(guò)氧化氫含量，延緩膜脂丙二醛含量增加，顯著提高獼猴桃、姜()、小麥()和豌豆()等植物抗干旱能力[24–27]；ABA處理還導(dǎo)致小麥胚胎超氧自由基、過(guò)氧化氫和氧化應(yīng)激指標(biāo)提高，從而誘導(dǎo)部分POD同工酶活性增強(qiáng)[28]。此外，對(duì)番茄()、甘蔗(spp.)和檉柳()等的研究也表明，ABA能夠誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[29–31]。本試驗(yàn)中，ABA處理的和表達(dá)量大幅度提高，說(shuō)明這2個(gè)成員參與了ABA介導(dǎo)的非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程，然而與25℃處理相比，POD活性整體水平并沒(méi)有顯著變化，表明仍有其他POD同工酶參與了該過(guò)程，結(jié)果也預(yù)示著POD同工酶不同成員可能存在特異的調(diào)控功能。

低溫貯藏是獼猴桃延緩果實(shí)軟化，延長(zhǎng)貨架期的有效手段，然而果實(shí)低溫貯藏過(guò)程中冷害常常導(dǎo)致果面皺縮，果肉水漬化[32]。而果實(shí)采后抗冷性與抗氧化性酶活性呈顯著正相關(guān)性，通過(guò)低溫鍛煉或逐步降溫保存可以顯著增強(qiáng)POD等抗氧化酶活性，清除丙二醛、過(guò)氧化氫和超氧陰離子等從而明顯提高果實(shí)的耐冷性[33–34]。然而，家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)模式和功能豐富多樣甚至在部分物種間完全相反，胡椒()的并不參與冷脅迫過(guò)程，低溫敏感性的威廉蕉(sp.)低溫處理后POD活性甚至下調(diào)[35]。本試驗(yàn)中，低溫處理早期表達(dá)量和POD活性整體水平大幅度上調(diào)，而表達(dá)量并未發(fā)生顯著變化，進(jìn)一步驗(yàn)證并非所有家族成員都能響應(yīng)低溫誘導(dǎo)。此外，處理中后期表達(dá)量和POD活性均下降，與王允等[26]的研究結(jié)果相似。因此，POD同工酶參與了獼猴桃低溫貯藏早期的抗冷作用，然而這種響應(yīng)機(jī)制只在部分家族成員中發(fā)揮調(diào)控。

大型機(jī)械壓力機(jī)大多為二到三級(jí)傳動(dòng)結(jié)構(gòu)，第一級(jí)為電動(dòng)機(jī)通過(guò)皮帶帶動(dòng)主軸轉(zhuǎn)動(dòng)，第二級(jí)為主軸上的小齒輪帶動(dòng)曲軸上的大齒輪轉(zhuǎn)動(dòng)。從而通過(guò)曲柄滑塊機(jī)構(gòu)驅(qū)動(dòng)滑塊作上下往復(fù)的直線運(yùn)動(dòng)。因此大型機(jī)械壓力機(jī)傳動(dòng)系統(tǒng)噪聲主要是齒輪副的噪聲。

本研究中，25℃室溫貯藏軟化過(guò)程中，POD活性也顯著提高，但只有略微上調(diào)表達(dá)?？梢?jiàn)，這一過(guò)程可能存在這2個(gè)成員以外的其他POD同工酶編碼基因發(fā)生了轉(zhuǎn)錄水平改變。此外，試驗(yàn)中所有處理的表達(dá)量均高于,說(shuō)明可能在獼猴桃果實(shí)軟化、低溫響應(yīng)和ABA誘導(dǎo)等過(guò)程中發(fā)揮比更為重要的調(diào)控功能。

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Cloning and Expression Analysis ofGenes in Kiwifruit

CHEN Yi-ting1, LAI Rui-lian1, FENG Xin1, GAO Min-xia1, CHENG Chun-zhen2, CHEN Wen-guan, WU Ru-jian1*

(1. Fruit Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, China;2. Institute of Horticultural Biotechnology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

To understand the regulation function of peroxidase genes in kiwifruit, two members ofgene family (and) were clonedfrom‘Miliang-1’ by using reverse transcription PCR, the bioinformations of AdPOD27 and AdPOD64 were analyzed, and the correlation between their expression and POD activity were also studied.The results showed that the length of open read frame ofandwas 984 and 957 bp, encoding 327 and 318 amino acids, respectively, which GenBank accession No. were MF774100 and MF774101. AdPOD27 and AdPOD64 were hydrophilic and alkaline proteins belonging to class III of the plant heme-dependent peroxidase superfamily. The two proteins had signal peptide, transmembrane structure and phosphorylation sites. AdPOD27 and AdPOD64 located in mitochondrion and extracellular region, respectively. qRT-PCR analysis showed that the expression ofwas up-regulated greatly treated with abscisic acid (ABA) and under 4℃, whileexpression only enhanced treated with ABA. Moreover, theexpression had significant correlations with POD activity andexpression. Therefore,andwould be involved in fruit softening, low temperature response and ABA induction of.

Kiwifruit; Peroxidase; Fruit softening; Low temperature; Abscisic acid

10.11926/jtsb.3919

2018-04-04

2018-07-02

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2017J01044, 2018J05051); 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(DC2017-2); 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(STIT2017-3-6); 福建省公益類(lèi)科研院所基本科研專(zhuān)項(xiàng)(2015R1014-3)資助

This work was supported by the Natural Science Foundation in Fujian (Grant No. 2017J01044, 2018J05051), the Doctoral Research Starting Fund of Fujian Academy of Agricultural Sciences (Grant No. DC2017-2), the Project for Science and Technology Innovation Group of Fujian Academy of Agricultural Sciences (Grant No. STIT2017-3-6), the Project for Basic Science and Technology of Public Welfare Scientific Research Institution in Fujian Province (Grant No. 2015R1014-3).

陳義挺(1972~ )，男，博士，副研究員，研究方向?yàn)楣麡?shù)生物技術(shù)與遺傳資源。E-mail: chyiting@163.com

E-mail: wurujian@126.com