牛膝多糖對體外培養(yǎng)豬腸上皮細胞增殖的影響

王 雄，李孟偉，陳清華

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128；2.中國農(nóng)業(yè)科學院廣西水牛研究所，廣西 南寧 530001）

牛膝多糖對體外培養(yǎng)豬腸上皮細胞增殖的影響

王 雄1，李孟偉2，陳清華1

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128；2.中國農(nóng)業(yè)科學院廣西水牛研究所，廣西 南寧 530001）

試驗旨在研究不同濃度牛膝多糖（Achyranthes bidentata polysaccharides，ABPS）對體外培養(yǎng)的仔豬空腸上皮細胞（IPEC-J2）正?；蛑嗵牵↙PS）誘導的免疫應激模型中細胞增殖的影響。結(jié)果表明，正常培養(yǎng)條件下，額外添加1 200 μg/mL濃度的ABPS組在24 h時間點細胞增殖效果顯著高于對照組及其他試驗組（P＜0.05）；在48 h和72 h時間點，添加ABPS的所有組細胞增殖效果顯著高于對照組（P＜0.05）。此外試驗通過脂多糖（LPS）誘導建立IPEC-J2免疫應激模型，結(jié)果表明，額外添加ABPS的所有組在24 h和72 h時間點，細胞增殖效果顯著高于對照組（P＜0.05）；在48 h時間點，900和1 200 μg/mL ABPS組細胞增殖效果顯著高于對照組（P＜0.05）。綜上所述，ABPS能顯著促進正常培養(yǎng)條件下IPEC-J2增殖，也能顯著緩解LPS對IPEC-J2增殖的抑制，試驗中以添加濃度為1 200 μg/mL的ABPS效果最好。

牛膝多糖；IPEC-J2；LPS；增殖

AbstractThe aim of the present study was to investigate the effect of different concentrations of ABPS on proliferation of piglets jejunum epithelial cells,normal or the immunological stress of lipopolysaccharide in vitro.The results showed that the proliferation of ABPS group at the concentration of 1 200 μg/mL was significantly higher than that of the control and other groups(P＜0.05).At 48 h and 72 h,ABPS was added at all time points(P＜0.05).In addition,the IPEC-J2 immunosuppressive model was induced by lipopolysaccharide (LPS).The results showed that the cell proliferation was significantly higher in all groups with additional ABPS at 24 h and 72 h(P＜0.05)time point,900 and 1 200 μg/mL ABPS group were significantly higher than the control group(P＜0.05).In conclusion,ABPS can significantly promote the proliferation of IPEC-J2 under normal culture conditions,and significantly alleviate the inhibition of IPEC-J2 proliferation by LPS.In the study,ABPS with the concentration of 1 200 μg/mL was the best.

Key wordsAchyranthes bidentata polysaccharide;IPEC-J2;LPS;proliferation

牛膝多糖（Achyranthes bidentata polysaccharides，ABPS）是從莧科植物牛膝的根中提取、分離和純化的水溶性小分子中性多糖[1-2]。ABPS因具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、增強免疫和降血糖等多種生物學功能，因此逐漸成為當前營養(yǎng)學研究熱點[3]。腸道是機體消化和營養(yǎng)吸收的主要器官，參與機體能量代謝調(diào)節(jié)；也是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，能阻止病原微生物、代謝廢物從腸腔侵入機體[4]。腸上皮細胞位于腸腔表面，是腸黏膜物理屏障的主要組成部分，也能感知和響應微生物刺激來加強其屏障功能，參與和協(xié)調(diào)適當?shù)拿庖邞餥5]。本試驗采用的仔豬空腸上皮細胞（IPEC-J2）是分離自新生仔豬空腸中段的柱狀上皮細胞[6]。動物試驗的研究結(jié)果表明，ABPS能提高仔豬腸道吸收能力，緩解脂多糖（LPS）免疫應激所導致的腸道吸收功能下降[7-9]。秦文雅研究表明，ABPS能通過改善機體的免疫功能來增強仔豬的腸功能[10]。為了進一步探討ABPS對仔豬腸道上皮細胞功能的影響，采取細胞培養(yǎng)方式研究ABPS對腸上皮細胞增殖的影響很有必要。為此，本試驗考察正?；騆PS誘導的免疫應激模型中ABPS對體外培養(yǎng)的IPEC-J2增殖的影響，為推廣ABPS在豬生產(chǎn)上的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2016年9—10月在湖南農(nóng)業(yè)大學動科樓細胞實驗室進行。

1.2 材料

1.2.1 細胞株 仔豬空腸上皮細胞（IPEC-J2），中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所惠贈。

1.2.2 主要藥品與試劑 牛膝多糖購自西安天瑞科技生物有限公司，純度98%。DMEM/F12細胞培養(yǎng)基、0.25%豬胰蛋白酶、雙抗試劑購自Hyclone公司。胎牛血清（FBS）、細胞凍存液購自Gibco公司。中性磷酸緩沖液（PBS）購自Biotopped公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與細胞計數(shù) 選用4～5代的IPECJ2，培養(yǎng)在含有 DMEM/F12培養(yǎng)基（含10%FBS、1%雙抗）的培養(yǎng)皿中，置于二氧化碳（CO）2培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2、95%濕度）內(nèi)培養(yǎng)。IPEC-J2培養(yǎng)到對應的時間點，首先采用預熱后的PBS洗滌3次，然后采用預熱后的0.25%胰蛋白酶消化細胞3 min，加入DMEM/F12培養(yǎng)基終止反應，將細胞置于細胞計數(shù)板上通過顯微鏡統(tǒng)計細胞密度。

1.3.2 ABPS對IPEC-J2的增殖 取處在對數(shù)生長期的IPEC-J2細胞，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（DMEM/F12）中分別混入 0、600、900 和 1 200 μg/mL 的 ABPS，每個處理12個重復（一個12孔板），每孔為1個重復，每孔接種 1.0×105個/mL 的細胞。在 24 h、48 h、72 h時間點，分別對細胞計數(shù)。

1.3.3 LPS對IPEC-J2的增殖 取處在對數(shù)生長期的IPEC-J2細胞，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（DMEM/F12）中分別混入 0.01、0.1、1、10 和 100 μg/mL 的 LPS，每個處理12個重復（一個12孔板），每孔為1個重復，每孔接種 1.0×105個/mL 的細胞。在 24 h、48 h、72 h時間點，分別對細胞計數(shù)。

1.3.4 ABPS對LPS免疫應激下IPEC-J2的增殖取處在對數(shù)生長期的IPEC-J2細胞，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（DMEM/F12） 中分別混入 0、600、900、1 200 μg/mL的ABPS和10 μg/mL的LPS，每個處理12個重復（一個12孔板），每孔為1個重復，每孔接種1.0×105個/mL的細胞。在24 h、48 h、72 h時間點，分別對細胞計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)采用Excel進行整理，用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，用Duncan氏法進行多重比較，結(jié)果用平均值±標準差表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度ABPS對正常培養(yǎng)條件下IPEC-J2增殖的影響

由表1可知，IPEC-J2經(jīng)不同濃度ABPS培養(yǎng)24 h，1 200 μg/mL ABPS組對細胞的增殖效果顯著高于其他組（P＜0.05），600 和 900 μg/mL ABPS組細胞的增殖效果和對照組無顯著差異（P＞0.05），但添加效果要優(yōu)于對照組；細胞培養(yǎng)48 h，600、900和1 200 μg/mL ABPS組細胞的增殖效果顯著高于對照組（P＜0.05）；細胞培養(yǎng) 72 h，600、900 和1 200 μg/mL ABPS組細胞的增殖效果顯著高于對照組（P＜0.05）。

表1 不同濃度ABPS對正常培養(yǎng)條件下IPEC-J2增殖的影響 ×105個/mL

2.2 不同濃度LPS對IPEC-J2增殖的影響

由表2可知，IPEC-J2經(jīng)不同濃度L PS培養(yǎng)，0.01 μg/mL LPS組對細胞增殖的抑制作用最小，100μg/mL LPS組導致細胞過度應激死亡，LPS對細胞增殖的抑制效果隨LPS濃度的升高而增強。本試驗IPEC-J2對LPS最大耐受度為10 μg/mL，以此濃度的LPS建立免疫應激模型。

表2 不同濃度LPS對IPEC-J2增殖的影響 ×105個/mL

2.3 不同濃度ABPS對LPS誘導的免疫應激模型中IPEC-J2增殖的影響

由表3可知，LPS免疫應激下IPEC-J2經(jīng)不同濃度 ABPS 培養(yǎng) 24 h，600、900 和 1 200 μg/mL ABPS組細胞的增殖效果顯著高于對照組（P＜0.05）；培養(yǎng)48 h，900和1 200 μg/mL ABPS組細胞的增殖效果顯著高于對照組（P＜0.05），增殖效果與ABPS濃度呈正相關(guān)，600 μg/mL ABPS組細胞的增殖效果要優(yōu)于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）；培養(yǎng) 72 h，600、900和1 200 μg/mL ABPS組細胞的增殖效果顯著高于對照組（P<0.05）。

表3 不同濃度ABPS對LPS免疫應激下IPEC-J2增殖的影響 ×105個/mL

3 討論

3.1 不同濃度ABPS對正常培養(yǎng)條件下IPEC-J2增殖的影響

本試驗結(jié)果表明，正常培養(yǎng)條件下IPEC-J2培養(yǎng)24 h，1 200 μg/mL ABPS組細胞的增殖效果顯著高于其他組（P<0.05）；培養(yǎng) 48 h和 72 h，600、900和1 200 μg/mL ABPS組細胞增殖效果顯著高于對照組（P<0.05）。有研究表明，牛膝多糖能有效促進細胞增殖。鄒云等[11]試驗表明，ABPS可提高仔豬淋巴細胞轉(zhuǎn)化率；陳清華等[12]研究也表明，ABPS有提高仔豬淋巴細胞增殖的作用。細胞增殖實質(zhì)就是細胞分裂，真核細胞分裂周期分為4個時相：G1期，DNA合成前期；S期，DNA合成期；G2期，DNA合成后期；M期，分裂期。其中G1期是決定細胞是否能夠繼續(xù)通過周期或撤回的關(guān)鍵期，只有一次通過G1/S時相轉(zhuǎn)換，細胞才能繼續(xù)增殖[13]。細胞周期的每個時相由各種細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）及其調(diào)節(jié)亞基（細胞周期蛋白）的活性調(diào)控[14]。在G1期期間，細胞周期蛋白D1是與CDK4或CDK6相關(guān)的關(guān)鍵細胞周期調(diào)節(jié)蛋白，調(diào)控細胞周期的進程[15-16]。Yu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，ABPS能通過促進G1/S時相轉(zhuǎn)換和上調(diào)細胞周期蛋白D1、CDK4和CDK6的表達，有效促進細胞增殖。Wnt/β-catenin信號通路對細胞增殖的調(diào)節(jié)非常重要，當Wnt蛋白結(jié)合Frizzled家族受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP）5/6時，Wnt/β-catenin信號通路被激活，這導致dishevelled（Dvl）家族蛋白的激活[18-19]。Dvl的活化導致GSK-3β的抑制，其導致非磷酸化的β-catenin在細胞質(zhì)中積累并遷移至細胞核。隨后，β-連環(huán)蛋白與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而改變Wnt/β-catenin信號傳導靶基因的表達，如細胞周期蛋白D1等[20]。Weng等[21]試驗結(jié)果表明，ABPS 能激活 Wnt/β-catenin信號通路，并通過抑制GSK-3β促進非磷酸化βcatenin轉(zhuǎn)移到細胞核中以增強細胞周期蛋白D1的表達。

3.2 不同濃度LPS對IPEC-J2增殖的影響

本試驗結(jié)果顯示，LPS能有效抑制IPEC-J2的增殖效果，0.01 μg/mL LPS組對細胞增殖的抑制作用最小，100 μg/mL LPS組導致細胞過度應激死亡，LPS對細胞增殖的抑制效果隨LPS濃度的升高而增強。在本試驗中，IPEC-J2對LPS的最大耐受濃度為10 μg/mL。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，能通過結(jié)合TLR4和激活各種蛋白激酶信號通路導致NF-κB核轉(zhuǎn)位，調(diào)控多種炎癥因子基因及免疫相關(guān)基因的表達，產(chǎn)生一系列炎癥細胞因子和免疫因子，從而誘導細胞產(chǎn)生免疫應激[22-24]。孫麗等[25]通過0.1和1 μg/mL LPS誘導處理IPEC-J2發(fā)現(xiàn)，高濃度LPS處理后TLR4信號通路各基因mRNA表達量顯著高于低濃度LPS處理后各基因mRNA表達量。Yang 等[26]用 1 μg/mL LPS 刺激 IPEC-J2，發(fā)現(xiàn) TNF-α和IL-6 mRNA表達量顯著增加。高侃[27]研究表明，1 μg/mL LPS刺激IPEC-J2導致細胞致炎性細胞因子IL-6、IL-12、TNF-α的基因表達量顯著升高。以上研究表明，較高濃度的LPS使IPEC-J2更快速地產(chǎn)生炎癥反應，可能導致細胞過度應激而受損或凋亡，影響細胞的正常增殖。因此用其建立免疫應激模型來研究ABPS對免疫應激下IPEC-J2增殖的影響具有代表性。

3.3 不同濃度ABPS對LPS誘導的免疫應激模型中IPEC-J2增殖的影響

本試驗研究表明，LPS免疫應激下IPEC-J2培養(yǎng) 24 h，600、900 和 1 200 μg/mL ABPS 組細胞增殖效果顯著高于對照組（P<0.05）；培養(yǎng) 48 h，900和1 200 μg/mL ABPS組細胞增殖效果顯著高于對照組（P<0.05）；培養(yǎng) 72 h，600、900 和 1 200 μg/mL ABPS組細胞增殖效果顯著高于對照組（P<0.05），表明ABPS能顯著緩解LPS對IPEC-J2增殖抑制。有研究表明，ABPS可能是通過降低炎癥因子的分泌來緩解LPS應激導致的細胞炎癥損傷和增殖抑制。張立國等[28]研究表明，川牛膝多糖具有良好的細胞抗炎、免疫調(diào)節(jié)及促進細胞修復等活性。劉玉蘭等[29]研究也表明ABPS具有一定的緩解炎癥的作用。張文俊[8]研究發(fā)現(xiàn)，在仔豬飼糧中添加ABPS能有效降低LPS刺激導致的TNF-α含量上升。朱惠玲等[30]試驗也得出一致結(jié)果，ABPS能顯著緩解LPS刺激導致的細胞炎癥因子分泌量上升。ABPS屬于植物多糖，有研究表明，在LPS免疫應激下植物多糖可能通過TLR4信號通路來抑制NF-κB活化，發(fā)揮其抗炎免疫作用。袁媛等[31]試驗表明，黃芪多糖能顯著抑制LPS刺激小腸上皮細胞分泌產(chǎn)生的TNF-α和IL-8 mRNA的表達量增高，并能降低NF-κB的表達活性。武劍[32]研究發(fā)現(xiàn)，柴胡多糖可顯著降低LPS誘導細胞的TLR4表達及NF-κB磷酸化水平增高。王雪等[33]發(fā)現(xiàn)沙棘多糖提取物能有效抑制LPS/D-Gal N誘導的TLR4的表達。ABPS有可能也是通過TLR4信號通路來發(fā)揮抗炎免疫作用，有效緩解LPS對IPEC-J2增殖抑制。

4 結(jié)論

ABPS能顯著促進正常培養(yǎng)條件下IPEC-J2增殖，也能顯著緩解LPS對IPEC-J2增殖的抑制。本試驗中，1 200 μg/mL ABPS添加效果最好。

[1] 陳清華，劉祝英，賀建華.牛膝多糖的生物學功能及作用機制研究進展[J] .飼料研究，2008（9）：8-11.

[2] Tan Feng,Deng Jun.Analysis of the constituent and antisenile function of achyranthes bidentata polysaccharides[J] .Acta Botanica Sinica,2002,44(7):795-798.

[3] 時春娟，周永達，張劍波，等.牛膝多糖研究進展[J] .中國新藥雜志，2006，15（16）：1330-1334.

[4] Alizadeh A,Akbari P,Diflippo E,et al.The piglet as a model for studying dietary components in infant diets:effects of galacto-oligosaccharides on intestinal functions[J] .British Journal of Nutrition,2016(4):1-14.

[5] Peterson L W,Artis D.Intestinal epithelial cells:regulators of barrier function and immune homeostasis[J] .Nature Reviews Immunology,2014,14(3):141-153.

[6] Brosnahan A J,Brown D R.Porcine IPEC-J2 intestinal epithelial cells in microbiological investigations[J] .Veterinary Microbiology,2012,156(3-4):229-237.

[7] 陳清華，賀建華，劉祝英.牛膝多糖對仔豬腸道微生物及小腸黏膜形態(tài)的影響 [J] .湖南農(nóng)業(yè)大學學報：自然科學版，2007，33（6）：723-726.

[8] 張文俊.牛膝多糖對脂多糖應激斷奶仔豬生長性能、免疫功能和腸道功能的影響[D] .長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學，2011.

[9] 任芬芬.牛膝多糖對仔豬各腸段微生物多樣性影響的研究[D] .長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學，2012.

[10] 秦文雅.牛膝多糖對免疫應激仔豬腸道的影響及其作用機理[D] .長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學，2012.

[11] 鄒云，謝紅兵，禹琪芳，等.植物多糖對斷奶仔豬淋巴細胞增殖和細胞因子分泌的影響 [J] .動物營養(yǎng)學報，2014，26（1）：210-218.

[12] 陳清華，劉祝英，賀建華.牛膝多糖對仔豬淋巴細胞增殖作用和細胞因子分泌量的影響[J] .動物營養(yǎng)學報，2008（6）：712-717.

[13] Zhang M,Xie R,Hou W,et al.PTHrP prevents chondrocyte premature hypertrophy by inducing cyclin-D1-dependent Runx2 and Runx3 phosphorylation,ubiquitylation and proteasomal degradation[J] .Journal of Cell Science,2009,122(9):1382-1389.

[14] Golias C H,Charalabopoulos A,Charalabopoilos K.Cell proliferation and cell cycle control:a mini review[J] .International Journal of Clinical Practice,2004,58(12):1134-1141.

[15] Blagosklonny M V,Pardee A B.The restriction point of the cell cycle[J] .Cell Cycle,2002,1(2):103-110.

[16] Li X,Ye H,Yu F,et al.Millimeter wave treatment promotes chondrocyte proliferation via G1/S,cell cycle transition[J] .International Journal of Molecular Medicine,2012,29(5):823-831.

[17] Yu F,Li X,Cai L,et al.Achyranthes bidentata polysaccharides induce chondrocyte proliferation via the promotion of the G1/S cell cycle transition[J] .Mol Med Rep,2013,7(3):935-940.

[18] Tao H Y,He B,Liu S Q,et al.Effect of carboxymethylated chitosan on the biosynthesis of NGF and activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway in the proliferation of Schwann cells[J] .European Journal of Pharmacology,2013,702(1-3):85-92.

[19] Mac Donald B T,Tamai K,He X.Wnt/beta-catenin signaling:components,mechanisms,and diseases[J] .Developmental Cell,2009,17(1):9-26.

[20] Kim W,Kim M,Jho E.Wnt/β-catenin signalling:from plasma membrane to nucleus[J] .Biochemical Journal,2013,450(1):9-21.

[21] Weng X,Lin P,Liu F,et al.Achyranthes bidentata polysaccharides activate the Wnt/beta-catenin signaling pathway to promote chondrocyte proliferation[J] .Int J Mol Med,2014,34(4):1045-1050.

[22] Palssonmcdermott E M,O'Neill L A.Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor,Toll-like receptor-4[J] .Immunology,2004,113(2):153-162.

[23] Abe-Yutori M,Chikazawa T,Shibasaki K,et al.Decreased expression of E-cadherin by Porphyromonas gingivalis-lipopolysaccharide attenuates epithelial barrier function[J] .Periodontal Res,2016,52(1):42-50.

[24] Grinnell K L,Chichger H,Braza J,et al.Protection against LPS-induced pulmonary edema through the attenuation of protein tyrosine phosphatase-1B oxidation[J] .Am J Respir Cell Mol Biol,2012,46(5):623-632.

[25] 孫麗，夏日煒，殷學梅，等.LPS誘導條件下豬小腸上皮細胞TLR4及其信號通路基因表達變化分析 [J] .畜牧獸醫(yī)學報，2015，46（7）：1095-1101.

[26] Yang F,Wang A,Zeng X,et al.Lactobacillus reuteri I5007 modulates tight junction protein expression in IPEC-J2 cells with LPS stimulation and in newborn piglets under normal conditions[J] .BMC Microbiology,2015,15(1):1-11.

[27] 高侃.乳酸桿菌對LPS致敏小腸上皮細胞的免疫調(diào)節(jié)效應及機制研究[D] .杭州：浙江農(nóng)林大學，2015.

[28] 張立國，趙麗麗，倪力軍，等.以多糖為主要部位的6種腰痛寧衍生方對巨噬細胞中炎癥因子表達及軟骨細胞增殖的影響[J] .中草藥，2015，46（24）：3710-3716.

[29] 劉玉蘭，郭廣倫，吳志鋒，等.牛膝多糖對脂多糖免疫應激仔豬血液生化指標和白細胞分類計數(shù)的影響[J] .中國飼料，2010（2）：35-38.

[30] 朱惠玲，劉玉蘭，郭廣倫，等.牛膝多糖對免疫應激仔豬生長性能、炎性介質(zhì)和內(nèi)分泌激素的影響[J] .中國畜牧雜志，2011，47（5）：48-51.

[31] 袁媛，孫梅.黃芪多糖對LPS損傷小腸上皮細胞的保護作用[J] .世界華人消化雜志，2008，16（1）：15-19.

[32] 武劍.柴胡多糖對巨噬細胞免疫功能的調(diào)節(jié)及對TLR4信號通路的影響[D] .上海：復旦大學，2012.

[33] 王雪，張威，劉歡，等.沙棘多糖提取物對LPS/D-GalN誘導的小鼠肝損傷的保護作用及其對TLR4，SOCS3表達的調(diào)控[J] .中國免疫學雜志，2015（11）：1457-1460.

（編輯：富春妮）

Effects of Achyranthes Bidentata Polysaccharides on Intestinal Porcine Epithelial Cells Proliferation in Vitro Culture

WANG Xiong1,LI Mengwei2,CHEN Qinghua1
（1.College of Animal Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;2.Buffalo Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530001,China）

S828

A

1002-1957(2017)05-0013-04

2017-08-21

湖南省教育廳重點項目-牛膝多糖通過TLR4信號通路調(diào)控仔豬腸道樹突狀細胞成熟的研究（項目號：14A067）

王 雄（1991-），男，湖南長沙人，在讀碩士研究生，研究方向為飼料資源開發(fā)與利用.E-mail:188735129@qq.com

陳清華（1971-），男，湖南邵陽人，教授，博士，主要從事分子營養(yǎng)學與飼料資源開發(fā)利用研究工作.E-mail:chqh314@163.com