動脈粥樣硬化相關miRNAs研究新進展

范翥元 劉丹 張廣煒

內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院（內蒙古包頭014010）

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，主要發(fā)生在大、中動脈的層流紊亂部位，尤其是動脈支點和分叉處［1］，是腦卒中的主要危險因素之一［2］。當各種理化因素使血管內皮受損后，血液中的低密度脂蛋白膽固醇滲入血管內皮下，導致血管內皮細胞黏附分子激活，調節(jié)單核細胞進入血管內皮下，分化成巨噬細胞，吞噬脂蛋白顆粒，形成泡沫細胞，導致動脈粥樣硬化形成，同時，平滑肌細胞遷移至血管表面，分泌因子如人成纖維細胞生長因子β、腫瘤壞死因子α、表皮生長因子等則使平滑肌細胞轉變?yōu)槌衫w維細胞表型，然后分泌各種纖維，在斑塊表面形成纖維帽，纖維帽變薄、斑塊內出血使斑塊破裂［3］。隨著科學技術的發(fā)展，可以越來越準確地識別出有破裂危險的易損斑塊。因此，通過監(jiān)測動脈粥樣硬化斑塊來檢測易損斑塊，對無癥狀、但是有腦卒中危險的斑塊攜帶者，能夠預防腦卒中的發(fā)生。目前已證實，miRNAs參與動脈粥樣硬化相關的多個細胞和分子過程，并且發(fā)揮著重要作用［4-5］。

1 miRNAs與動脈粥樣硬化的相關性

miRNA與動脈粥樣硬化發(fā)病機制密切相關，主要參與調控頸動脈內膜中層厚度（intima-media thickness，IMT）、血流動力學、氧化應激、膽固醇代謝、血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）、血管新生、炎性反應、泡沫細胞、穩(wěn)定纖維帽等發(fā)生發(fā)展過程，現從以下幾個方面進行概述。

1.1miRNAs的生物合成與作用機制miRNAs是一種內源性的、單鏈的、長度為18～25個核苷酸的非編碼RNA，存在于線蟲、果蠅、植物和包括人在內的真核生物中。miRNAs通過與mRNA的相互作用，參與調控約60%的哺乳動物蛋白編碼基因的表達［6］。同時，miRNAs與穩(wěn)定載體（包括微粒子和外泌體）相關，可能作為疾病的生物標記物或治療靶點［7］。

利用RNA聚合酶Ⅱ，將細胞核內編碼microRNA的基因轉錄成初級miRNA，再經Drosha/DGCR8微處理機復合物處理，形成具有莖環(huán)結構的前體microRNA；前體microRNA通過依賴于Ran-GTP的核質轉運體Exportin5輸出到細胞質中。在DIcerase、Ago蛋白家族和RNA結合蛋白TEBP的共同作用下，形成成熟的miRNAs，并與RNA誘導的沉默復合物（RISC）結合形成miR-RISC復合物，通過與靶mRNA的3′端非翻譯區(qū)完全或不完全配對結合，可降解靶mRNA或抑制其翻譯，進一步發(fā)揮調控作用［8-9］。

1.2miRNAs與頸動脈IMT動脈粥樣硬化主要涉及大動脈和中動脈的內膜。首先，IMT變厚，內膜變粗糙并逐漸形成斑塊，斑塊伸入管腔并導致管腔狹窄。當頸動脈狹窄＞50%時，可能發(fā)生血流動力學變化，導致遠端狹窄和低灌注。IMT增厚是早期評價動脈粥樣硬化及腦血管病的指標［10］。

測量IMT厚度通常用于評估亞臨床動脈粥樣硬化形成或動脈粥樣硬化的程度。HUANG等［11］使用實時熒光定量PCR檢測血漿miR-29c水平，頸動脈超聲檢測IMT，通過Spearman相關系數和多元線性回歸分析，評價miR-29c與IMT之間的相關性，研究表明IMT與miR-29c呈正相關，這項研究首次表明血漿miR-29c可以作為亞臨床動脈粥樣硬化的獨立預測因子。但是動脈粥樣硬化的發(fā)展是復雜的，一個重要的假設是動脈粥樣硬化是由幾種炎癥細胞類型和（或）炎癥反應的血管浸潤引起的。C反應蛋白是1930年發(fā)現的一種急性期蛋白，是感染或炎癥狀態(tài)的早期重要指標。C反應蛋白也是頸動脈粥樣硬化進展的重要標志物。同時，發(fā)現研究組血漿miR-29c和C反應蛋白水平高于對照組，CIMT與miR-29c、C反應蛋白呈正相關，miR-29c水平也與C反應蛋白呈正相關。證實miR-29c和C反應蛋白聯(lián)合曲線下面積比單獨使用miR-29c或C反應蛋白的曲線下面積更能反映臨床前動脈粥樣硬化，提示miR-29c聯(lián)合C反應蛋白可能在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。此外，LIU等［12］使用ApoE/小鼠構建動脈粥樣硬化模型，用超聲生物顯微鏡檢測IMT，研究血清miR-217水平及其與IMT的相關性，結果證明，ApoE/小鼠血清miR-217水平下降，與動脈IMT呈負相關，結合miR-217模擬治療后血脂水平下降和IMT減低，進一步研究證實miR-217可以抑制動脈粥樣硬化相關炎癥因子的分泌和脂質沉積形成，可以推斷miR-217具有抑制動脈粥樣硬化斑塊形成的能力，表明miR-217可能是一種潛在的新的治療策略。

1.3miRNAs與動脈粥樣硬化

1.3.1miRNAs與血流動力學暴露于不均勻環(huán)境下的動脈的分支和彎曲處，動脈粥樣硬化斑塊優(yōu)先形成，血流紊亂模式的兩種機制為對機械刺激的質量輸運和血管反應的改變，可以解釋血流紊亂和動脈粥樣硬化發(fā)展之間的聯(lián)系。質量運輸理論認為，某些生物活性物質，可能在血液中，與血管內皮細胞長期接觸，導致在血流紊亂的部位得到促進。剪切應力理論強調血流誘導的機械力對血管生理的影響。上述兩種機制都會影響斑塊的形成，并在功能層面相互作用［13］。

LEE等［14］采用大鼠和載脂蛋白E缺乏小鼠模型，進行體外和體內實驗，通過靶向GATA6，下調促炎信號通路GATA6/VCAM-1，抗動脈粥樣硬化保護脈沖剪切應力誘發(fā)RARα/RXRα異質二聚體的形成，提高miR-10a轉錄；相反，促動脈粥樣硬化振蕩剪切應力誘發(fā)HDAC-3/5/7 RARα阻遏雜合物的形成，抑制miR-10a的表達，從而在內皮細胞中上調GATA6/VCAM-1信號。研究表明miR-10a可能成為動脈粥樣硬化的診斷分子。研究結果還表明，通過給予RARa/RARα特異性激動劑在體內誘導內皮細胞miR-10a。研究發(fā)現提供了新的機制，調節(jié)病變發(fā)展的血管壁，從而干擾血液流動，可能提供一種基于血流動力學的動脈粥樣硬化治療策略。

1.3.2miRNAs與膽固醇代謝動脈壁的脂質積累，是動脈粥樣硬化形成的第一步。脂質代謝的改變增加腦部代謝紊亂的風險。對于脂質代謝紊亂，藥物治療仍然是降低腦血管病發(fā)生率的最常用措施。miRNAs參與脂質代謝，主要作用于轉錄后水平。新的證據表明，miRNAs是脂質和脂蛋白代謝的關鍵調控因子，可能是動脈粥樣硬化的治療靶點［15-16］。

以往研究證實miR-33a和miR-33b參與調控HDL-C代謝與膽固醇逆轉運（reverse cholesterol transport，RCT）的過程。NGUYEN 等［17］研究出殼聚糖納米顆粒，稱為chNPs，用于向巨噬細胞傳遞功能miRNA模擬物，研究發(fā)現chNPs可以保護和轉移外源性miR-33到幼稚巨噬細胞，并改變其靶基因腺苷三磷酸結合盒轉運體A1基因（ATP-Binding Cassette Transporter 1 gene，ABCA1）在體內和體外的表達。此外，證實用含有miR-33的chNPs處理的巨噬細胞向apoA1的膽固醇外排減少，而用這些納米顆粒處理的小鼠的RCT也下降。研究結果表明，miRNAs可以通過納米顆粒高效地傳遞到巨噬細胞，在那里它們可以逃脫內溶酶原降解，并能夠調節(jié)ABCA1表達和膽固醇外排。這可能應用于其他基于miRNA的治療，特別是在心腦血管和炎癥性疾病中，并可能使基于RNA治療這些疾病。另外，RAMIREZ等［18］發(fā)現，ABCA1是miR-144的直接作用靶點，抑制miR-144可以增加肝細胞和巨噬細胞中ABCA1的表達，并提高小鼠血漿HDL水平。許多miRNAs，包括miR-33、miR-122和miR-148a，已經被證明通過調節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài)和脂蛋白代謝在控制急性腦血管病風險方面發(fā)揮重要作用［19］。WEZE等［20］觀察到通過抑制miR-494、HDL進入肝臟，可減少病灶的壞死核大小及增加膠原含量，可以將血管壁多余的膽固醇清除，減少動脈粥樣硬化的發(fā)生。之前有研究表明，趨化因子受體4/趨化因子受體12在動脈粥樣硬化中起保護作用，抑制miR-494導致內皮細胞和平滑肌細胞中趨化因子受體4顯著上調，其配體趨化因子受體12在巨噬細胞和肥大細胞中顯著升高，并導致巨噬細胞人激活素A受體I和金屬蛋白酶組織抑制因子的上調。miR-494成為動脈硬化新的治療靶點。

1.3.3miRNAs與氧化應激氧化應激是動脈粥樣硬化的主要特征之一。動脈粥樣硬化危險因素與過量活性氧生成和低密度脂蛋白氧化有關。作用于細胞類型的氧化型低密度脂蛋白促進動脈粥樣硬化形成。針對過量活性氧生成、抗氧化系統(tǒng)、抑制氧化低密度脂蛋白的形成以及阻斷其受體的治療策略可預防氧化應激和改善動脈粥樣硬化［21］。

LIN等［22］研究靶向Nrf2和Sirt2的miR-140-5p，影響動脈粥樣硬化患者的高血壓和氧化應激的分子機制。研究發(fā)現miR-140-5p作為一種優(yōu)秀的抗氧化劑，誘導Sirt2/Nrf2/HO-1信號通路抑制動脈粥樣硬化中的氧化應激。因此，研究結果表明miR-140-5p/Sirt2/Nrf2在動脈粥樣硬化的防治中具有重要作用。GOU等［23］研究發(fā)現miR-92a在糖尿病ECs中的表達升高。miR-92a過表達損害內皮功能，抑制內皮細胞HO-1表達。抑制miR-92a通過增強HO-1在db/db小鼠主動脈中的表達和活性，能夠減輕氧化應激并改善內皮功能。LIU等［24］研究miR-181a在氧化應激誘導的內皮細胞功能障礙中的作用。研究報道m(xù)iR-181a在人類動脈粥樣硬化斑塊中較正常血管上調。miR-181a是由H2O2處理誘導的。外源性過表達miR-181a可加速H2O2作用下HUVECs的凋亡率。研究確定Bcl-2是miR-181a的直接靶點。此外，還觀察到H2O2處理抑制了Bcl-2在蛋白和mRNA水平的表達。抑制miR-181a可以恢復Bcl-2的表達，導致對H2O2的耐藥性增加。此外，miR-181a過表達，HUVECs中Bcl-2的恢復使細胞耐受更高濃度的H2O2。最后，miR-181a與Bcl-2在人動脈粥樣硬化斑塊中的表達呈負相關關系。研究結果證實miR-181a在動脈粥樣硬化形成過程中通過調節(jié)內皮功能障礙，給用于開發(fā)新的抗氧化藥物及動脈粥樣硬化的治療提供機制。

1.3.4miRNAs與VSMCVSMC的增殖在動脈粥樣硬化中起著重要作用，在動脈粥樣硬化的病理過程的開始，不規(guī)則的VSMC增殖促進斑塊的形成。最近的研究表明，miRNAs在血管系統(tǒng)中表達，參與VSMC增殖的調控［25］。

ZHANG等［26］在體內構建大鼠血管損傷模型，然后，用miRNA芯片分析miRNA的表達譜，觀察到miR-451在損傷頸動脈中顯著下調，尤其是miR-451的上調在體內顯著抑制頸動脈結扎誘導的內膜增生，在體外抑制血小板衍生生長因子型BB（platelet-derived growth factor type BB，PDGF-BB）誘導的VSMCs增殖和遷移。重要的是，研究證實miR-451可以通過靶向Ywhaz阻斷p38 MAPK信號通路，從而抑制PDGF-BB處理的VSMCs的增殖和遷移。在此基礎上，miR-451可能成為動脈粥樣硬化內膜增生的潛在治療靶點。此外，LIU等［27］研究了miR-133b在體外對動脈粥樣硬化血管平滑肌細胞的影響，發(fā)現miR-133b在動脈粥樣硬化家兔血液和動脈粥樣硬化斑塊組織中顯著降低，并且使用TargetScan和雙熒光素酶報告基因分析miR-133b的靶基因，證明了基質金屬蛋白酶9是miR-133b的直接靶基因，結果表明rVSMCs中miR-133b的表達與基質金屬蛋白酶9呈負相關。研究數據顯示，與對照組相比，miR-133b模擬物能夠顯著抑制rVSMC細胞增殖活性、遷移能力，誘導細胞凋亡，而這些作用均被基質金屬蛋白酶9質粒逆轉，這些發(fā)現強調了miR-133b/基質金屬蛋白酶9軸在動脈粥樣硬化中的重要作用。miR-133b可能是動脈粥樣硬化的一個有價值的臨床標志物和治療靶點。LI等［28］發(fā)現，在PDGF刺激后，miR-320在人VSMCs中的表達在時間和劑量上顯著下調。功能分析表明，miR-320可以抑制VSMCs在基礎和PDGF刺激條件下的增殖和遷移。此外，在熒光素酶報告基因檢測中，npilin 1（NRP1）被證明是miR-320的直接靶點，無論是否經過PDGF處理，miR-320過表達均可抑制NRP1的表達。最后，結扎損傷后小鼠頸動脈中miR-320表達明顯下降，而AdmiR-320通過降低NRP1表達，使新生內膜增生減弱，而恢復miR-320。結果證實miR-320通過靶向NRP1調控VSMCs的增殖、遷移和新生內膜的形成。這些新發(fā)現提示miR-320調控NRP1表達在增殖血管疾病的早期診斷和治療中具有重要意義。因此，研究miRNAs對VSMC和內皮細胞增殖的影響具有重要意義。

1.3.5miRNAs與血管新生血管生成是動脈粥樣硬化斑塊破裂發(fā)生發(fā)展過程中的重要因素，局部新生血管形成與斑塊穩(wěn)定性密切相關［29］。

CHEN 等［30］評估 miRNA-21在血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）介導的人微血管內皮細胞（human microvascular endothelial cells，HMECs）促血管生成反應中的功能參與。研究發(fā)現AngⅡ在HMECs中具有促血管生成的作用，表現為促進增殖、遷移和成管。其次，miRNA-21在AngⅡ治療的HMECs中表達上調，其特異性抑制劑有效地阻斷了AngII的促血管生成作用。隨后，重點研究了信號轉導與轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在AngⅡ介導的血管生成過程中的本構性激活。生物信息學分析表明，STAT3是啟動miRNA-21表達的轉錄因子，并經ChIP PCR驗證。一個基因報告實驗進一步確定了miRNA-21啟動子區(qū)域中STAT3的3個功能結合位點。此外，磷酸酶和緊張素同源物（phosphatase and tensin homologues，PTEN）被認為是miRNA-21的靶點，抑制STAT3可以恢復AngⅡ誘導的PTEN的減少。同樣，STAT3/miRNA-21軸在體內介導AngⅡ引起的血管生成，這是通過使用適當的抑制劑來證明的。研究表明STAT3/miRNA-21通路參與了AngⅡ誘導的HMECs新生血管萌發(fā)。進一步證實，在暴露于AngⅡ的HMECs中，STAT3通過誘導miRNA-21介導抑制PTEN，是連接血管生成和動脈粥樣硬化的表觀遺傳開關的一部分。研究發(fā)現以STAT3miRNA-21軸為靶點，結合現有的常規(guī)治療策略，可作為動脈粥樣硬化的有效治療手段。LIANG等［31］探討缺氧誘導內皮細胞細胞膜微粒（endothelial microparticles，EMPs）中 miRNA-19b的變化及其對內皮細胞的影響，研究證實miRNA-19b在缺氧誘導的EMPs中是存在的，并且可以從EMPs轉移到人臍靜脈血管內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中。研究發(fā)現，在miRNA-19b上的人轉化生長因子β2（human converted growth factor beta 2，TGFβ2）轉錄活動的抑制作用，熒光素酶檢測TGFβ2是miRNA-19b靶基因，通過下調TGFβ2表達，來減少HUVEC遷移和血管生成。這項研究表明EMPs中的miR-19b可能是進一步研究動脈粥樣硬化的新靶點。QUN等［32］研究miRNA-27b在動脈粥樣硬化環(huán)境下內皮細胞血管生成活性中的作用，在動脈粥樣硬化斑塊中，發(fā)現miRNA-27b的表達顯著增加，進一步鑒定其靶基因為Tubedown-1（Tbdn-1，Naa15），研究證實，通過調控調控內皮細胞miRNA-27b的表達，可能是一種的治療動脈粥樣硬化的方法。MIAIMAITI等［33］發(fā)現，miR-106b通過STAT3參與的信號通路，直接作用于STAT3位點，在內皮細胞中發(fā)揮抗血管生成作用。

1.3.6miRNAs與炎性反應動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥，炎性反應的關鍵成分之一是巨噬細胞，巨噬細胞分泌促炎性因子導致斑塊破裂，巨噬細胞的極化受各種微環(huán)境刺激分為M1、M2型，影響動脈粥樣硬化的易感性。考慮到M1促炎、M2抗炎巨噬細胞在動脈粥樣硬化斑塊中的不同特性，發(fā)現能夠逆轉巨噬細胞M2表型分化，對預防腦卒中事件十分重要。

AN等［34］發(fā)現，miR-181b參與調節(jié)免疫細胞分化，在單個核細胞中高表達，在大腦缺血后降低，并參與動脈粥樣硬化斑塊的形成。并且Notch1信號的異常激活與巨噬細胞功能失調有關，miR-181b通過直接靶向Notch1調控巨噬細胞極化，從而調控動脈粥樣硬化斑塊的易損性。SU等［35］研究發(fā)現，在動脈粥樣硬化斑塊中，miR-181a-5p和miR-181a-3p的表達均下降，并且能夠緩解血管炎癥和細胞募集，阻斷HUVECs中的NF-κB傳導信號通路。研究首次證明miR-181a-5p及其傳遞鏈miR-181a-3p是抗動脈粥樣硬化的miRNA，通過靶向TAB2和NEMO來延緩動脈粥樣硬化的進展。因此，miR-181a-5p和miR-181a-3p的修復可能是治療動脈粥樣硬化的一種新的治療方法。DU等［36］研究發(fā)現miR-135a可以通過調節(jié)RAW264.7細胞中的TLR4信號通路，使miR-135a過表達從而抑制細胞炎癥和氧化應激，并驗證了二者之間的負相關關系。研究證實，miR-135a可以通過體外抑制TLR4信號通路抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。

1.3.7miRNAs與泡沫細胞在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中，巨噬細胞通過吞噬大量的脂質而形成泡沫細胞，構成了斑塊內的脂質核心，同時，可以分泌大量的細胞因子、趨化因子和蛋白酶和其他炎癥介質，促進斑塊局部炎性反應，減少斑塊穩(wěn)定性，導致斑塊破裂，從而導致急性腦血管病的發(fā)生。

ZHANG等［37］研究miR-155通過調控巨噬細胞中膽固醇酯酶的表達，改變巨噬細胞向泡沫細胞轉化的潛在機制。結果發(fā)現miR-155模擬物導致巨噬細胞中膽固醇酯酶在轉錄和翻譯水平上均表達增加，可以有效抑制泡沫細胞的形成，減少細胞內脂質的積累。結果證實通過抑制Tim-3的表達，使得miR-155的這一作用顯著降低。因此，miR-155可能是治療動脈粥樣硬化的一個新的治療靶點。YANG等［7］發(fā)現，miR-23a-5p是泡沫細胞形成相關的miRNA，直接抑制ABCA1和ABCG1的表達，抑制膽固醇的外排促進泡沫細胞的形成，增加斑塊易損性。所以ABCA1/ABCG1依賴性通路和miR-23a-5p可能是抑制動脈粥樣硬化的潛在治療靶點。此外，DAI等［38］發(fā)現miR-98表達降低可能與載脂蛋白e/-小鼠主動脈中LOX-1表達、泡沫細胞形成和脂質積累有關。血漿miR-98水平可能是動脈粥樣硬化疾病過程的生物標志物，其調控可能為動脈粥樣硬化提供治療策略。

1.3.8miRNAs與穩(wěn)定纖維帽穩(wěn)定纖維帽，防止動脈粥樣硬化斑塊破裂，可能是一種降低腦血管發(fā)病率和死亡率的方法。EKEN等［3］利用局部采集的、血漿中的纖維帽組織，發(fā)現miR-210是纖維組織合成、并釋放到局部組織環(huán)境中主要的miRNAs。miR-210在不穩(wěn)定斑塊的纖維帽中顯著下調，抑制Wnt信號轉導的抑癌基因APC（腺瘤息肉大腸桿菌）的表達。miR-210-APC-Wnt信號軸在動脈粥樣硬化中的作用表明，miR-210模擬物特異性可以穩(wěn)定斑塊，減少腦卒中的發(fā)生。

2 miRNAs展望

miRNAs通過與多種因子的靶mRNA結合，上調或下調動脈粥樣硬化相關基因的表達，調控細胞內多種信號通路的轉導，進而參與頸動脈內膜中層厚度、血流動力學、氧化應激、膽固醇代謝、血管平滑肌、血管新生、炎性反應、泡沫細胞、穩(wěn)定纖維帽等過程的調節(jié)。近些年的研究發(fā)現miRNAs在不同類型的細胞中，可能表現出不同的作用，而且，相同的miRNA在動脈粥樣硬化的不同時期表現出不同的作用。最新研究證實，臨床試驗中miRNAs的進一步發(fā)展和miRNAs遞送方法的改進，可能會促進在動脈粥樣硬化背景下細胞特異性miRNAs治療的發(fā)展?？傊瑢iRNAs在動脈粥樣硬化發(fā)病機制中作用的深入研究，有助于為人類腦血管疾病的預測及治療提供新思路。