基因異常對(duì)胰腺癌預(yù)后影響的研究進(jìn)展

荊薇 楊向紅

1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第一腫瘤科（沈陽110022）；2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科（沈陽110004）

胰腺癌是預(yù)后極差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)2015年在中國(guó)共有超過79 400 例患者被確診為胰腺癌［1］。僅有15%～20%的患者于早期確診，近80%的患者因局部進(jìn)展或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移不能接受手術(shù)治療，晚期患者中位生存期僅為6～9 個(gè)月［2］。近30年治療技術(shù)的發(fā)展使胰腺癌的綜合治療有了更多的選擇，然而胰腺癌患者總體5年的生存率仍僅有5%［3］。因此，尋找影響胰腺癌預(yù)后的因素是目前的研究熱點(diǎn)。

既往研究提出的包括高齡、吸煙、糖尿病、慢性胰腺炎、KPS 評(píng)分、TNM 分期及血清CA199 水平等［4?7］臨床相關(guān)因素只能提示患者的預(yù)后趨勢(shì)及發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但對(duì)個(gè)體化預(yù)后預(yù)測(cè)及治療靶點(diǎn)缺乏指向性。

基因檢測(cè)研究技術(shù)的發(fā)展為我們深入認(rèn)識(shí)胰腺癌提供了幫助，在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的過程中，往往伴隨著多種基因的改變［8］。JUHASZ 等［9］發(fā)現(xiàn)胰腺癌中包含鼠類肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）基因在內(nèi)的多種基因改變。BIANKIN 等［10］發(fā)現(xiàn)基因改變多發(fā)生于如G1/S 檢查點(diǎn)、凋亡、血管新生調(diào)節(jié)等重要的通路。YACHIDA 等［11］發(fā)現(xiàn)在胰腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中腫瘤進(jìn)展的各個(gè)時(shí)期突變的基因亦各不相同。BREITKREUTZ 等［12］指出具有復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的胰腺癌患者與具有單一信號(hào)的惡性腫瘤患者相比，往往具有更差的生存。以上研究結(jié)果提示我們，單個(gè)或是一組相關(guān)基因的改變可能影響胰腺癌患者的預(yù)后。目前研究多集中于孤立基因改變對(duì)胰腺癌預(yù)后的影響，少有綜合性分析及匯總報(bào)道。因此，我們有必要對(duì)胰腺癌相關(guān)基因改變進(jìn)行分析歸納，以便對(duì)不同的胰腺癌患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分類，提示預(yù)后并指導(dǎo)個(gè)體靶向治療。

1 經(jīng)典的基因變化

1.1 KRAS 基因 癌基因KRAS 位于第12 號(hào)染色體，編碼RAS 同源體，屬于細(xì)胞質(zhì)GTPase 家族，通過活化MAPK 和（或）PI3K 通路促進(jìn)細(xì)胞增殖。有研究表明90%以上的胰腺癌患者存在KRAS 突變，突變常位于第12 外顯子，第13、61 外顯子突變也有報(bào)道［13］。目前認(rèn)為KRAS 基因突變是胰腺癌的早期事件。因而檢測(cè)KRAS 基因突變狀態(tài)可以用來區(qū)分胰腺病變的進(jìn)展程度［8］。

BLACKFORD 等［14］對(duì)89 例病理診斷胰腺癌的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，98.5%的患者存在KRAS 突變，但突變與患者預(yù)后不相關(guān)，KRAS 突變可以作為胰腺癌的診斷指標(biāo)。WINDON 等［15］指出90%的胰腺癌患者存在KRAS 突變，與KRAS 野生型患者相比，KAS 突變患者具有更差的生存。KRAS 基因檢測(cè)可以在血漿及胰液等臨床標(biāo)本中進(jìn)行。CHEN 等［16］對(duì)91 例不能接受手術(shù)切除的晚期胰腺癌患者進(jìn)行外周血DNA 中KRAS 基因突變狀態(tài)檢測(cè)，33%的患者具有KRAS 第12 外顯子突變。KRAS 突變與TNM 分期及肝轉(zhuǎn)移相關(guān)。KRAS 第12 外顯子突變患者的生存短于野生型患者。外周血DNA KRAS 基因第12 外顯子突變是影響胰腺癌患者生存的因素。GOLAN 等［17］發(fā)現(xiàn)KRAS 基因突變狀態(tài)與胰腺癌信號(hào)通路差異相關(guān)。KRAS 野生型表達(dá)Smad 4、Muc6、VEGFR?2 和VEGFB 蛋白，野生型患者可能從血管生成抑制劑治療中獲益。而KRAS 突變型則表達(dá)SHH、IHH 蛋白，突變型患者可能從Hedgehog 抑制劑治療中取得獲益。KRAS 基因突變狀態(tài)可以影響胰腺癌患者的治療決策，進(jìn)而影響患者治療的有效性。然而KRAS 基因突變與胰腺癌預(yù)后的關(guān)系尚無定論。

1.2 SMAD4/DPC4 基因 抑癌基因SMAD4/DPC4 基因位于第18 號(hào)染色體，其缺失及突變?cè)谝认侔┲械陌l(fā)生率為55%，為晚期事件［8］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子?β（transforming growth factor?β，TGF?β）與胞外受體結(jié)合通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使smad4進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)控制細(xì)胞生長(zhǎng)。該基因缺失或突變后，p21 因子不能被激活，腫瘤細(xì)胞無控制的增殖生長(zhǎng)。SMAD4/DPC4 基因具有以下二個(gè)特點(diǎn)，在胰腺癌中突變率明顯高于其他腫瘤；組織中smad4 蛋白可以用來代替表示SMAD4 基因狀態(tài)。因此，采用免疫組化方法檢測(cè)smad4 蛋白可以反映SMAD4/DPC4 基因的情況［18?19］。

MASETTI 等［19］研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中SMAD4/DPC4基因的突變或缺失導(dǎo)致其表達(dá)失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致更差的預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中該基因缺失的患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率明顯增高［20］。在89 例可手術(shù)切除的胰腺癌患者中檢測(cè)SMAD4、TP53、CDKN2A 基因及TGF?β信號(hào)通路相關(guān)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SMAD4 基因失活的胰腺癌患者中位生存期為11.5 個(gè)月，而野生型患者中位生存期為14.2 個(gè)月。SMAD4 野生型的患者生存明顯好于SMAD4 失活（突變或者純合子缺失）的患者。存在SMAD4 失活的患者多出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因而具有較差的預(yù)后。推測(cè)具有爭(zhēng)議的手術(shù)時(shí)，具有SMAD4 失活的患者可能具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，SMAD4 高表達(dá)的患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)更低，需要更加積極地進(jìn)行新輔助化療及手術(shù)切除［14］。

1.3 CDKN2A/P16INK4a 基因 抑癌基因CDKN2A 基因位于第9 號(hào)染色體，編碼p16 蛋白，通過p16/Rb 控制細(xì)胞周期，抑制cdk4/6 介導(dǎo)的Rb 磷酸化，抑制G1/S 期的轉(zhuǎn)變。p16 失活可導(dǎo)致細(xì)胞周期失控最終導(dǎo)致過度增殖。家族性多發(fā)黑痣患者多伴有CDKN2A 基因的突變，易發(fā)生黑色素瘤及胰腺癌［21?22］。95%的胰腺癌患者具有p16 蛋白的失活，但是DKN2A 基因的各種改變對(duì)p16 蛋白的失活起的作用各不相同。純合子缺失、突變及啟動(dòng)子甲基化發(fā)生率在胰腺癌中的發(fā)病率分別為40%、40% 及15%。其中突變及啟動(dòng)子甲基化都可以導(dǎo)致p16 蛋白的失活［8］。

LUO 等［23］對(duì)既往32 例胰腺癌患者組織標(biāo)本中p16 缺失進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果提示P16 失活為50%。在存活短的患者中發(fā)現(xiàn)p16INK4a 失活較高，因而判定p16INK4a 可能為導(dǎo)致患者預(yù)后差的因素。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，具有P16INK4a基因失活的小鼠在同時(shí)轉(zhuǎn)錄入P16INK4a 及P53 基因后，生存明顯好于分別單獨(dú)轉(zhuǎn)入P16INK4a 或P53 基因的小鼠。推測(cè)在P16INK4a 基因突變的患者中同時(shí)針對(duì)P16INK4a 及P53 的靶點(diǎn)治療才有效［24］。OSHIMA 等［25］對(duì)可切除的106 例胰腺癌患者病理組織進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，P16基因缺失發(fā)生率為67.0%，與淋巴結(jié)的侵襲及術(shù)后腫瘤遠(yuǎn)處播散轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。具有P16 基因缺失的胰腺癌患者具有較差的術(shù)后生存期。

1.4 TP53 基因 抑癌基因TP53 編碼p53 蛋白，位于17 號(hào)染色體短臂。p53 蛋白對(duì)G1/S 期、G2/M 期阻滯及細(xì)胞凋亡起重要作用。55%～75%的胰腺癌患者存在TP53 基因突變，通常為雜合子突變。TP53 基因突變導(dǎo)致p53 蛋白的缺失意味著胰腺癌中調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡及分化的兩條重要途徑出現(xiàn)異常［26］。TP53 基因共有3 個(gè)點(diǎn)突變位點(diǎn)，其中2 個(gè)位點(diǎn)位于編碼區(qū)，而另一個(gè)位點(diǎn)位于非編碼區(qū)的位點(diǎn)突變目前功能不詳［27］。

KIM 等［28］對(duì)397 例胰腺癌患者術(shù)后標(biāo)本進(jìn)行TP53、TAM 表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TAM 缺失伴TP53 表達(dá)的患者具有更差的生存。JEONG 等［29］對(duì)44 例胰腺癌患者標(biāo)本進(jìn)行p53蛋白檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，異常的p53 蛋白表達(dá)率31.8%，異常的p53 蛋白表達(dá)與病理組織分級(jí)相關(guān)，陽性表達(dá)異常p53蛋白的患者無病生存率低于陰性表達(dá)的患者。一項(xiàng)對(duì)可行手術(shù)切除的89 例胰腺癌患者研究中發(fā)現(xiàn)，即使對(duì)淋巴結(jié)狀態(tài)、腫瘤分級(jí)、手術(shù)切緣、年齡及腫瘤大小進(jìn)行標(biāo)化后，TP53 基因的突變狀態(tài)與患者的生存不相關(guān)［14］。另一項(xiàng)納入62 例患者的研究中提出長(zhǎng)期生存及短期生存的兩組患者TP53 基因突變率分別為55%、70%，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（校正后P＝0.686）。認(rèn)為TP53基因的突變狀態(tài)與生存不相關(guān)，TP53 基因的突變不能作為預(yù)后因子［23］。PETERSEN 等［30］的研究也指出，無論是單變量還是多變量分析后，TP53 突變的狀態(tài)與胰腺癌生存都不相關(guān)。

2 非經(jīng)典的基因變化

2.1 BRAF 基因 BRAF 基因位于第7 號(hào)染色體，在66%的惡性腫瘤中存在錯(cuò)義突變，但在每種惡性腫瘤中的突變率都比較低。其中80%的BRAF 基因突變發(fā)生于第15 外顯子V600E。突變所產(chǎn)生的RAF 蛋白可以不受RAS 蛋白的調(diào)控持續(xù)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。

與以往在肺癌及結(jié)腸癌報(bào)道的BRAF 基因突變與KRAS 基因突變不同時(shí)存在不同。近1/3 攜帶野生型KRAS基因的胰腺癌患者同時(shí)攜帶BRAF 基因突變。ZHOU 等［31］在126 例胰腺癌術(shù)后標(biāo)本中未檢測(cè)出BRAF 基因的突變，推測(cè)較低的BRAF 突變?cè)谝认侔┑陌l(fā)展及預(yù)后中作用有限。SCHULTZ 等［32］對(duì)170 例胰腺導(dǎo)管腺癌患者進(jìn)行KRAS及BRAF 基因突變檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BRAF 基因突變率為16%，14%的胰腺癌患者同時(shí)具有KRAS 及BRAF 基因的突變。但是BRAF 基因突變與胰腺癌患者的總生存不相關(guān)。

2.2 表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor recep?tor，EGFR）基因 EGFR 位于KRAS 的上游，可與其配體EGF 結(jié)合，通過RAS/RAF?MET?ERK 通路調(diào)控細(xì)胞的增殖。GUO 等［33］對(duì)357 例胰腺癌患者進(jìn)行EGFR 表達(dá)狀態(tài)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陰性及陽性的EGFR 表達(dá)患者對(duì)輔助治療及放療具有不同的反應(yīng)性，但EGFR 表達(dá)狀態(tài)不影響胰腺癌患者術(shù)后的生存。目前文獻(xiàn)報(bào)道在胰腺癌中EGFR 基因突變率＜3%。OLIVEIRA CUNHA 等［34］對(duì)88 例胰腺癌及壺腹周圍癌病例檢測(cè)，只有2 例患者存在EGFR 基因突變，且突變的位置位于第18?21 外顯子上。由于EGFR 基因突變率過低，目前認(rèn)為其對(duì)胰腺癌的預(yù)后不具有預(yù)測(cè)意義。

2.3 PIK3CA 基因 WEISS 等［35］在30 例胰腺癌患者的組織標(biāo)本中進(jìn)行磷脂酰肌醇?3?激酶（phosphatidylino?sitol 3?kinases，PI3Ks）的p110 亞單位PIK3CA（9?20）基因突變的檢測(cè)，但是未發(fā)現(xiàn)具有突變。在PIK3CA 8 號(hào)內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)一個(gè)此前沒有數(shù)據(jù)報(bào)道的SNP，但此患者的臨床數(shù)據(jù)無特殊差別?？偨Y(jié)目前文獻(xiàn)報(bào)道PI3KCA 基因的突變率小于5%，認(rèn)為不具有預(yù)測(cè)預(yù)后的作用。

2.4 RUNX3 基因 RUNX3 基因位于第1 號(hào)染色體，基因編碼的產(chǎn)物是TGF?β 信號(hào)通路的重要組成部分。在胰腺癌中，RUNX3 基因不表達(dá)或低表達(dá)，超甲基化及雜合子缺失為不表達(dá)的主要原因。SMAD2、SMAD3 與RUNX3 基因產(chǎn)物結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。在32 例胰腺癌患者組織中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)33.4%的患者存在RUNX3 基因雜合子缺失，62.5%存在RUNX3 基因的啟動(dòng)子高甲基化。32 例標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)基因突變及SNP。而RUNX3 基因啟動(dòng)子高甲基化預(yù)示患者具有較差的生存［36］。

2.5 MDM2 基因 MDM2 在腫瘤中過表達(dá)，是E3 的泛素連接酶，抑制P53 的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。而MDM2 啟動(dòng)子存在309 位核苷酸T→G 的轉(zhuǎn)變，該位點(diǎn)純合子G 可以使SP1 親和性增加，進(jìn)而促進(jìn)MDM2 的mRNA 及蛋白的表達(dá)，從而抑制p53 的活性，導(dǎo)致較差的預(yù)后。具有309G純和狀態(tài)的胰腺癌患者發(fā)病率是其他人的2 倍，生存率降低是其他患者的2～3 倍。MDM2?309 位點(diǎn)的雜合子T/G以及純合子G/G 狀態(tài)降低胰腺癌患者的無進(jìn)展生存及總生存［37］。

2.6 DNA 修復(fù)相關(guān)基因突變 DNA 錯(cuò)配修復(fù)基因MLH1和MSH2 是典型的胰腺癌DNA 修復(fù)基因。二者產(chǎn)物蛋白協(xié)同起作用，修復(fù)新復(fù)制生成DNA 的錯(cuò)誤小插入、缺失及片段錯(cuò)配。其中一個(gè)出現(xiàn)失活后（突變或啟動(dòng)子甲基化）可以出現(xiàn)DNA 的異常，稱為微衛(wèi)星不穩(wěn)定。胰腺癌出現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性為4%，有學(xué)者推測(cè)具有微衛(wèi)星不穩(wěn)定的胰腺癌患者具有較好的預(yù)后，但是卻具有伴隨非胰腺癌的其他腫瘤風(fēng)險(xiǎn)，其基因改變對(duì)胰腺癌預(yù)后的影響目前尚無研究報(bào)道［38?39］。

3 聯(lián)合多個(gè)基因改變

基因改變存在于胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等各個(gè)過程［40］。有研究根據(jù)基因改變的分布將胰腺癌分為4 個(gè)亞型［41］。穩(wěn)定亞型約占20%，該亞型腫瘤基因組包括＜50 個(gè)結(jié)構(gòu)變異事件，通常表現(xiàn)出廣泛的非整倍體細(xì)胞周期/有絲分裂的缺陷。KRAS 的點(diǎn)突變率及SMAD4 改變與其余亞型相似，TP53 突變的發(fā)生率為61%。局部重排亞型約占30%，其亞組中包括KRAS、SOX9 和GATA6 基因的局部擴(kuò)增，以及常用于臨床治療靶點(diǎn)的ERBB2、MET、CDK6、PIK3CA 以及PIK3R3 的小突變。約36%為散發(fā)亞型，這類腫瘤表現(xiàn)出中等范圍的非隨機(jī)染色體損傷和＜200 的結(jié)構(gòu)變異。不穩(wěn)定亞型約占14%，腫瘤表現(xiàn)出大量的基因結(jié)構(gòu)變化。這種基因組不穩(wěn)定性暗示DNA 修復(fù)缺陷，并提示了腫瘤對(duì)DNA 損傷藥物的敏感性。以上4 種亞型的具有潛在的臨床治療相關(guān)性，可能提示胰腺癌患者的預(yù)后生存。

近年來，采用全基因組和深度外顯子測(cè)序方法對(duì)456例胰腺癌組織基因變化進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)胰腺癌相關(guān)的基因突變多集中于DNA 損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、TGF?β 信號(hào)通路、染色質(zhì)調(diào)節(jié)、軸突導(dǎo)向通路［42］。而通過表達(dá)譜分析進(jìn)一步將病理因素預(yù)后不同的胰腺癌分為4 個(gè)亞型，分別為鱗狀細(xì)胞、胰腺祖細(xì)胞、免疫原性、異常分化的內(nèi)分泌外分泌型（ADEX）。胰腺癌的這些不同亞型具有不同的分子進(jìn)化、識(shí)別以及治療預(yù)后。鱗狀細(xì)胞型具有較差的預(yù)后，其富含TP53 和KDM6A 突變以及胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞命運(yùn)決定基因的高甲基化；胰腺祖細(xì)胞型優(yōu)先表達(dá)與胰腺早期發(fā)育相關(guān)的基因FXA2/3、PDX1 和MNX1；ADEX 型顯示上調(diào)調(diào)控KRAS 激活的網(wǎng)絡(luò)相關(guān)基因；免疫原性型上調(diào)免疫網(wǎng)絡(luò)，包括參與獲得性免疫抑制的途徑。

4 展望

由于多數(shù)胰腺癌患者在確診時(shí)已經(jīng)喪失手術(shù)機(jī)會(huì)，更好地了解胰腺癌的病理、分子等特點(diǎn)有益于早期診斷，判斷預(yù)后，使更多的患者得到接受根治手術(shù)的機(jī)會(huì)，針對(duì)靶點(diǎn)接受治療，從而延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，提高生存質(zhì)量。借助于基因分析的技術(shù)，構(gòu)建于基因分子改變特征之上，有助于我們?cè)谂R床中發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)人群，為胰腺癌的個(gè)體化治療、靶向治療提供新的依據(jù)。