光動力對白色念珠菌生物膜的作用研究進(jìn)展

楊倩 黃力毅

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科（南寧530000）

近年來，隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用及免疫缺陷病患者數(shù)量增多，真菌感染是較常見的臨床問題，念珠菌是最常見的真菌病原體之一，同時也是醫(yī)院獲得性感染的主要病原菌，而白色念珠菌感染在相關(guān)念珠菌屬中的發(fā)病率最高［1-2］，其常寄生在人體的口腔、皮膚、腸道黏膜及陰道等部位。當(dāng)宿主免疫力低下或寄居處微環(huán)境發(fā)生改變，則易導(dǎo)致淺表性或全身系統(tǒng)性感染?，F(xiàn)有的抗真菌藥物濃度對浮游態(tài)白色念珠菌有效，但對已形成生物膜中的白色念珠菌細(xì)胞無效，雖然更高的濃度可以有效地對抗生物膜，但這些高劑量往往會對宿主造成嚴(yán)重的副作用（肝或腎毒性），耐藥率也越來越高，難以徹底根治［3-4］。白色念珠菌耐藥性與生物膜形成有關(guān)［5］，研究表明微生物生物膜占人類所有細(xì)菌和真菌感染的80%［6］，因此開發(fā)新的抗生物膜方法顯得尤為迫切，光動力療法（photodynamic therapy，PDT）作為一種可替代傳統(tǒng)抗菌療法的新型非侵入性療法，可使生物膜實質(zhì)性的減少，甚至徹底的根除［7］。相關(guān)研究［8-11］表明PDT 可以抑制白色念珠菌生物膜形成、破壞生物膜結(jié)構(gòu)、殺滅生物膜內(nèi)菌體以及影響生物膜相關(guān)基因的表達(dá)，從而有效滅活耐藥性白色念珠菌。本文主要從以下5 個方面闡述PDT 對白色念珠菌生物膜作用的研究進(jìn)展。

1 PDT 的概念及作用機(jī)制

PDT 是光敏劑（photosensitizer，PS）在光源照射下發(fā)生激化反應(yīng)引起一系列級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生大量活性氧物質(zhì)導(dǎo)致靶細(xì)胞發(fā)生不可逆損傷的治療方法。其作用機(jī)制涉及吸收光子激發(fā)PS 到其短壽命的單重態(tài)，然后經(jīng)歷電子躍遷到更長壽命的三重態(tài)，較長的壽命允許三重態(tài)PS 與兩種不同的光化學(xué)（Ⅰ型和Ⅱ型）途徑之一的環(huán)境（基態(tài)）氧反應(yīng)。在Ⅰ型光化學(xué)反應(yīng)中，PS 通過電子轉(zhuǎn)移方式生成羥自由基、超氧陰離子、過氧化氫等；Ⅱ型光化學(xué)反應(yīng)是PS通過能量碰撞轉(zhuǎn)移方式產(chǎn)生單線態(tài)氧。根據(jù)激發(fā)態(tài)PS 所處的位置，所產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的活性氧物質(zhì)，迅速誘導(dǎo)損傷周圍環(huán)境中微生物的細(xì)胞壁、脂膜、蛋白質(zhì)等，最終非特異性地殺滅微生物［12］。

2 白色念珠菌生物膜的形成過程及影響其形成的因素

白色念珠菌生物膜形成過程大致分為4 個階段：早期（0～11 h）白色念珠菌細(xì)胞以芽生孢子的形式附著于物體表面并繼續(xù)繁殖；中期（12～30 h）細(xì)胞分泌胞外聚合物，黏結(jié)單個真菌細(xì)胞而形成真菌團(tuán)塊，進(jìn)而形成分散的微菌落，并逐漸融合形成生物膜的基底層；成熟期（31～72 h）細(xì)胞外基質(zhì)的不斷產(chǎn)生和釋放，覆蓋在真菌微菌落表面直至將細(xì)胞完全包裹，同時隨菌絲或假菌絲的形成，結(jié)構(gòu)逐漸復(fù)雜，發(fā)育為成熟的生物膜；72 h 后生物膜結(jié)構(gòu)發(fā)生解離，酵母相的細(xì)胞脫落下來，繼續(xù)形成新的生物膜。胞外聚合物、微生物細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)生物分子是影響生物膜形成的三大因素，其中胞外聚合物通過“聚合物橋接”過程克服微生物細(xì)胞與基質(zhì)之間的靜電排斥，從而確保微生物細(xì)胞附著或錨定到基質(zhì)［7］，這一過程對細(xì)胞的初始黏附是至關(guān)重要的。

3 白色念珠菌生物膜耐藥性及耐藥機(jī)制

白色念珠菌復(fù)雜的生物膜形成，使其耐藥性增加。研究表明，念珠菌生物膜細(xì)胞對抗真菌藥物如兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑和酮康唑的抗藥性比浮游細(xì)胞高30 ～2 000 倍［13］。其耐藥機(jī)制可能與生物膜外基質(zhì)的屏障作用、生物膜內(nèi)細(xì)胞生長緩慢和營養(yǎng)限制、相關(guān)耐藥基因表達(dá)、細(xì)胞膜甾醇代謝異常、藥物外排泵的上調(diào)以及持留細(xì)胞的存在等有關(guān)［14-16］。研究證實PDT 的抗菌作用與微生物細(xì)胞是否存在抗菌藥物抗藥性無關(guān)［17］。

4 PDT 對白色念珠菌生物膜的作用

4.1 抑制生物膜形成酵母和菌絲型細(xì)胞的發(fā)育對生物膜的形成至關(guān)重要。PINTO 等［8］體外研究證實甲苯胺藍(lán)-O（toluidine blue o，TBO）介導(dǎo)的PDT 能夠抑制生物膜的整個形成階段。經(jīng)過不同濃度（0.01、0.02、0.05、0.1 mg/mL）的TBO 介導(dǎo)的PDT 處理白色念珠菌ATCC10231，通過測定在不同發(fā)育階段（6、12、24、48 h）形成的生物膜的代謝率，證實上述4 種濃度的TBO 均可以不同程度地抑制生物膜形成，并且在生物膜的不同發(fā)育階段都觀察到這種抑制效應(yīng)，其中0.1 mg/mL 的TBO 介導(dǎo)的PDT 可以抑制約50%生物膜形成。該研究利用光學(xué)顯微鏡觀察比較PDT（0.1 mg/mL TBO）治療前后生物膜的變化，治療前，12 h 的生物膜形成過程中，酵母和絲狀體的細(xì)胞數(shù)量減少，而48 h 的生物膜形成呈現(xiàn)出更多的細(xì)胞，包括絲狀體。治療后，觀察到生物膜結(jié)構(gòu)中細(xì)胞數(shù)量的減少，在12 和48 h 的生物膜形成中，絲狀體完全沒有細(xì)胞，而對照組中當(dāng)細(xì)胞被單獨照射或單獨使用TBO 時，形成的生物膜的形態(tài)沒有改變。研究結(jié)果表明，TBO 介導(dǎo)的PDT 可以通過減少從酵母菌到絲狀體的過渡過程，從而有效地減少生物膜形成，這可能是PDT 抑制生物膜形成的機(jī)制之一。QUISHIDA［18］研究也得到了相似的結(jié)論，發(fā)現(xiàn)白色念珠菌ATCC90028 不同發(fā)育階段（24、48 h）生物膜對不同濃度（80、100、120 μmol/L）的姜黃素介導(dǎo)的PDT 都是敏感的，且24 h 生物膜比48 h 生物膜對PDT 更敏感。CARVALHO 等［9］研究證實二氫卟酚e6介導(dǎo)的PDT 可降低白色念珠菌ATCC10231 形成生物膜的能力，當(dāng)二氫卟酚e6 濃度為7 μmol/L，可抑制50%生物膜形成；當(dāng)二氫卟酚e6 濃度為20 μmol/L，生物膜形成率降低了90%以上。同時，通過光學(xué)顯微鏡觀察到酵母細(xì)胞和菌絲形成都大大減少，在生物膜結(jié)構(gòu)中完全沒有絲狀形式，表明PDT 對生物膜形成的抑制與減少芽殖酵母形式到絲狀形式的轉(zhuǎn)變有關(guān)，這是定植和毒力的重要階段。DAVIES 等［19］體外實驗證實PDT 能夠減少白色念珠菌生物膜形成，在室溫37 ℃條件下，經(jīng)過52.2 μmol/L 的咪康唑孵化2 h，緊接著7.3 μmol/L 的四甲苯磺酸卟啉孵育30 min，能量密度為58.5 J/cm2的可見光照射，用XTT 實驗測定發(fā)現(xiàn)ATCC 菌株（白色念珠菌MYA-2732、白色念珠菌MYA-274）及臨床分離株（白色念珠菌6122/06）生物膜形成分別減少60%、46%、73%，其抑制效果均顯著高于單獨使用咪康唑組或四甲苯磺酸卟啉介導(dǎo)的PDT 組。這種聯(lián)合療法為將來用于假牙和口腔表面念珠菌生物膜的治療提供依據(jù)。KHAN 等［20］探索了新型納米金顆粒（gold nanoparticles，GNP）增強(qiáng)亞甲藍(lán)（methylene blue，MB）介導(dǎo)的PDT 對頑固性致病性白色念珠菌生物膜的作用，用MB 介導(dǎo)的PDT 可以抑制81.9%生物膜的形成，實驗證明同時結(jié)合GNP，可以增加對生物膜的抑制，其抑制率為95.4%。QUISHIDA等［21］研究證實不同濃度（175、200 mg/L）的二氫卟吩e6 衍生物光狄沙嗪介導(dǎo)的PDT 均能減少白色念珠菌ATCC90028 生物膜生物量，并且連續(xù)3 次PDT 的應(yīng)用效果更明顯。

4.2 破壞生物膜結(jié)構(gòu)生物膜復(fù)雜的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使得抗真菌藥物無法直接作用于內(nèi)部的真菌，其機(jī)械穩(wěn)定性取決于微生物分泌的胞外聚合物的組成和數(shù)量［22］，同時胞外聚合物作為抵御抗生素和生物殺菌劑擴(kuò)散的第1 道防線，也限制了PS 的滲透［7］。由于PDT 涉及到活性氧物質(zhì)的原位生成，生物膜結(jié)構(gòu)上的重要元素很有可能被氧化破壞，從而削弱生物膜的完整性［23］。KHAN 等［20］利用體外實驗評估GNP 裝載MB 介導(dǎo)的PDT 對白色念珠菌ATCC90028生物膜結(jié)構(gòu)的影響，用掃描電子顯微鏡觀察，與對照組比較，實驗組出現(xiàn)生物膜萎縮，菌絲完全破裂，并以不規(guī)則形狀物質(zhì)的形式聚集，導(dǎo)致生物膜規(guī)則空間三維結(jié)構(gòu)的消失，白色念珠菌生物膜結(jié)構(gòu)被MB 介導(dǎo)的PDT 破壞。CARVALHO 等［9］研究證實20 μmol/L 的二氫卟酚e6 介導(dǎo)的PDT可有效改變白色念珠菌ATCC10231 生物膜結(jié)構(gòu)，用光學(xué)顯微鏡觀察，與對照組比較，實驗組中酵母細(xì)胞和菌絲形成都大大減少，在生物膜結(jié)構(gòu)中完全沒有絲狀形式。孫紅英等［24］利用共焦顯微鏡檢測5-氨基酮戊酸介導(dǎo)的PDT 對白色念珠菌ATCC90028 生物膜活性的抑制作用，計算殺菌率的變化，通過定量分析5-氨基酮戊酸介導(dǎo)的PDT 對生物膜結(jié)構(gòu)的破壞效果，證實其對生物膜結(jié)構(gòu)有一定的破壞作用。這種破壞生物膜結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，在動物模型中也得到證實，SHERWANI 等［11］在雌性BALB/c 小鼠背部及口腔分別建立感染白色念珠菌ATCC90028 的模型，經(jīng)組織病理學(xué)分析，證實單獨GNP-MB 組、GNP-TBO 組以及GNP-MB 和GNP-TBO 組介導(dǎo)的PDT 均可以減少小鼠舌背的酵母細(xì)胞和菌絲纖維的穿透，并且發(fā)現(xiàn)GNP-MB 和GNP-TBO 具有明顯的協(xié)同作用，從動物模型中可見GNP 能夠增強(qiáng)PDT 的抗生物膜能力，其抗生物膜作用在牙周炎和種植體周圍炎等牙科感染中有特殊應(yīng)用［25-26］。迄今為止，在控制牙科生物膜感染的新方法中，PDT 是導(dǎo)致微生物耐藥概率最小的一種療法［27］。

4.3 殺滅生物膜內(nèi)菌體生物膜本質(zhì)上主要由菌細(xì)胞群體組成，PDT 是一種細(xì)胞毒性治療方法，它能引起細(xì)胞凋亡或壞死，研究證實PDT 在體內(nèi)外均能殺死生物膜內(nèi)的細(xì)胞［22］。SHI 等［10］體外研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)5 mmol/L 的ALA 孵育5 h，用波長為635 nm、不同能量密度（50、100、200、300 J/cm2）的紅光分別處理白色念珠菌ATCC90028 形成的生物膜，用LIVE/DEAD 真菌生存試劑盒進(jìn)行快速免疫熒光染色，與對照組相比，白色念珠菌ATCC90028 生物膜中的細(xì)胞分別被抑制59.82%、67.95%、71.70%、74.45%。ROSSONI 等［28］體外研究白色念珠菌血清型A 和B 的生物膜對PDT 的敏感性。300 μmol/L 的MB 孵育5 min，波長660 nm，能量密度26.3 J/cm2的激光分別照射白色念珠菌A（ATCC36801）和白色念珠菌B（ATCC36802）形成的生物膜后，用無菌牙簽將生物膜細(xì)胞刮下壁，在超聲勻漿器中對于生物膜進(jìn)行破壞后進(jìn)行培養(yǎng)測定，與對照組相比，發(fā)現(xiàn)MB 介導(dǎo)的PDT使白色念珠菌A 和B 生物膜細(xì)胞分別減少了64%和99%。ERNáKOVá等［29］體外研究證實PDT 抗白色念珠菌生物膜的作用是顯著有效的，經(jīng)1 mmol/L 的MB 孵育1 h ，波長為660 nm、輸出功率為190 mW/cm2的紅色激光分別處理氟康唑敏感菌株白色念珠菌SC5314 和氟康唑耐藥菌株白色念珠菌CY1123 形成的生物膜，能量密度為15、23、57 J/cm2時，敏感菌株和耐藥菌株生物膜的生存率分別為24.57%、23.46%、22.29%和40.28%、17.91%、5.89%。結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察證實以活力菌絲為主的白色念珠菌SC5314 生物膜，PDT 的能力受到限制，增加能量密度并沒有提高PDT 抗生物膜的效率，而酵母形態(tài)為主的白色念珠菌CY1123 生物膜對PDT 更敏感，隨著能量密度的提高，PDT 抗生物膜的效率顯著增加。在PDT 中，PS 的選擇對抗菌療效至關(guān)重要，研究發(fā)現(xiàn)微生物細(xì)胞比哺乳動物細(xì)胞更具有明顯的負(fù)電荷，陽離子PS 選擇性的結(jié)合，與微生物細(xì)胞的結(jié)合相對較快，而哺乳動物細(xì)胞對陽離子PS 的吸收較慢［12］。

4.4 影響生物膜相關(guān)基因的表達(dá)白色念珠菌生物膜的基因表達(dá)與浮游細(xì)胞不同，其形成過程錯綜復(fù)雜，受多種調(diào)控機(jī)制的影響。分泌型天冬氨酸蛋白酶（SAP）、磷脂酶B（PLB）、脂肪酶（LIP）、菌絲壁蛋白1（HWP1）、凝集素樣序列（ALS）等基因在白色念珠菌生物膜中持續(xù)表達(dá)。FREIRE 等［30］研究了300 μmol/L 的MB 介導(dǎo)的PDT 處理9個白色念珠菌的臨床分離株（分別從9 例艾滋病患者口腔分離）和1 個白色念珠菌參考菌株ATCC18804，分析以上基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明SAP5 基因的表達(dá)減少了60%，LIP9 和PLB2 基因的表達(dá)減少了50%，但與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，證明以MB 為PS 介導(dǎo)的PDT 對基因的表達(dá)僅有輕微的作用。此外，F(xiàn)REIRE 等［31］的另一個研究通過評價300 μmol/L 的MB 介導(dǎo)的PDT 和400 μmol/L 的赤蘚紅介導(dǎo)的PDT 對3 種白色念珠菌（1 種為標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC18804，另2 種分別從HIV 陽性患者和義齒口腔炎患者的臨床樣本中分離得出）生物膜的影響，應(yīng)用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測方法證實以上兩種PDT 組合均使白色念珠菌生物膜ALS3、HWP1、BCR1、TEC1、CPH1 和EFG1 基因表達(dá)均下調(diào)，毒力降低，而對照組中以上分析基因均無明顯的變化，同時通過分析這兩個PDT 組合抗白色念珠菌生物膜療效，兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。SHERWANI 等［11］轉(zhuǎn)錄分析研究表明GNP 介導(dǎo)的PDT 處理白色念珠菌ATCC90028 生物膜后，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，對兩種重要基因ALS3 和HYR1 均有抑制作用。何淼等［32］體外研究標(biāo)準(zhǔn)株ATCC10231 和ATCC90028 形成生物膜的早期、中期和成熟期，分別提取總RNA，應(yīng)用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測8 個ALS 基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在整個生物膜形成的時期，ALS1、ALS2、ALS3 和ALS5 持續(xù)高表達(dá)，是主要表達(dá)的黏附素基因，而ALS6、ALS7、ALS9，尤其是ALS4 則表達(dá)較弱。鄧可可等［33］研究也發(fā)現(xiàn)ALS3 的表達(dá)與白色念珠菌形成生物膜的能力相關(guān)。研究結(jié)果提示PDT 可能抑制白色念珠菌生物膜ALS 基因家族的其他有關(guān)高表達(dá)基因。

5 結(jié)語和展望

生物膜是導(dǎo)致人類微生物持續(xù)感染的主要原因。PDT 在治療復(fù)發(fā)和慢性生物膜感染有良好的前景。PDT具有多靶點，不僅能有效殺死微生物細(xì)胞本身，而且生成的活性氧物質(zhì)可以通過攻擊大量生物分子削弱和降解基質(zhì)結(jié)構(gòu)、胞外聚合物。不同于傳統(tǒng)抗菌藥物的單一行為模式，PDT 既不引起微生物的耐藥性，也不受現(xiàn)有耐藥狀況的影響，其非特異廣譜殺菌性質(zhì)意味著在感染病原體被鑒定以前就可以使用，雖然人類許多感染發(fā)生在身體深處，但是現(xiàn)在有可能通過內(nèi)窺鏡儀器、窄直徑的間隙插入針、光纖將PS 和光傳送到幾乎任何解剖部位發(fā)揮抗菌作用，從而有效應(yīng)對抗菌藥物耐藥性危機(jī)。目前相關(guān)研究主要集中在體外和動物模型實驗，臨床實驗研究較少。未來新型安全PS 的研發(fā)問題、可見光光源最適宜PS 的波段選擇以及機(jī)體對PDT 治療過程中產(chǎn)生的過敏反應(yīng)問題，如果能得到進(jìn)一步的研發(fā)和解決，將會是一個碩果累累的研究方向。隨著對生物膜作用機(jī)制的進(jìn)一步研究以及實驗條件的優(yōu)化，PDT 的抗生物膜潛力將具有越來越高的臨床應(yīng)用價值，尤其應(yīng)用在醫(yī)療器械（如植入物和導(dǎo)管）生物膜感染以及艾滋病患者合并口腔念珠菌慢性感染的治療。