生物大分子載體在腫瘤納米靶向藥物研發(fā)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

董麗娜，蔡璐璐，趙明明，張秀莉，李夢(mèng)雙，竇賓茹，解婷，徐凱，李菁菁

(1徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)影像學(xué)院，江蘇徐州 221004；2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

精確診斷和有效的藥物傳遞一直是癌癥治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，以納米顆粒為基礎(chǔ)的診療平臺(tái)可通過(guò)主動(dòng)和被動(dòng)靶向進(jìn)行精確診斷和有效給藥[1]，但是納米材料的毒性和不可降解性也限制了其作為藥物載體的應(yīng)用。生物大分子作為生物體內(nèi)的天然活性成分，具有良好的內(nèi)在生物化學(xué)和生物物理特性，在半衰期、穩(wěn)定性、安全性和制造易用性等方面均表現(xiàn)出潛在的優(yōu)勢(shì)；將生物大分子與納米材料相結(jié)合可以顯著提高納米材料的生物相容性，并且生物大分子可通過(guò)識(shí)別特異性受體而實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向功能。因此，生物大分子在納米藥物載體的構(gòu)建、靶向納米藥物的制備等方面均具有良好的發(fā)展前景。蛋白質(zhì)、多糖及脂類是目前應(yīng)用最廣泛的生物大分子，作為載體應(yīng)用于納米藥物不僅能改善化療藥物的水溶性、穩(wěn)定性，還能進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)通過(guò)溫度、pH或空間控制的方式智能釋藥，除此之外還可憑借自身特異性靶向配體實(shí)現(xiàn)靶向給藥。本文對(duì)蛋白質(zhì)、多糖、脂類等生物大分子作為載體在腫瘤靶向治療相關(guān)納米藥物中的應(yīng)用作一綜述。

1 蛋白質(zhì)

1.1 白蛋白 白蛋白是人體內(nèi)最豐富的血漿蛋白，具有維持膠體滲透血壓和運(yùn)送金屬離子、不溶性小分子、營(yíng)養(yǎng)素到各組織器官等作用，目前研究較為廣泛的是人血清白蛋白(HSA)和牛血清白蛋白(BSA)。HSA、BSA均具有良好的水溶性，而且分子量相近[2]，BSA的高同源性和低成本使其成為相關(guān)研究中HSA的合適替代物。由于白蛋白的粒徑約為7.2 nm，高于腎清除閾值，因此白蛋白的血漿半衰期比其他小分子長(zhǎng)，平均19 d。白蛋白作為一種天然的生物大分子，憑借其良好的生物相容性、長(zhǎng)血漿半衰期而被視為理想的藥物載體。白蛋白結(jié)合型藥物進(jìn)入細(xì)胞后，白蛋白可降解為氨基酸，為周圍的組織和細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，而釋放出來(lái)的游離藥物則發(fā)揮治療作用[3]。

早在2005年，美國(guó)食品藥品管理局(FDA)已批準(zhǔn)白蛋白結(jié)合型紫杉醇用于乳腺癌的治療，該納米藥物是由紫杉醇與白蛋白通過(guò)疏水作用形成的，是FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)用于乳腺癌治療的納米藥物[4]。以白蛋白為藥物載體制備納米藥物主要通過(guò)共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合兩種方式實(shí)現(xiàn)，其中非共價(jià)結(jié)合包括包封、疏水作用、化學(xué)配位和靜電相互作用等，部分學(xué)者成功地將米托蒽醌、多柔比星(DOX)、5-氟尿嘧啶等化療藥物通過(guò)上述作用與白蛋白相連[5]。除了與一般化療藥物連接外，由于白蛋白富集N-端和半胱氨酸殘基，使其與過(guò)渡金屬離子如Au3+、Cu2+、Gd3+和Bi3+具有較強(qiáng)的配位能力[6]。You等[7]構(gòu)建了BSA包覆中空金納米殼(Au@BSA-Gd)的多功能納米材料，同步實(shí)現(xiàn)光熱治療和計(jì)算機(jī)斷層掃描/光聲成像相結(jié)合。Ding等[8]以BSA為模板合成具有良好熒光性能的BSA@Au NCs，并利用環(huán)精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cRGD)對(duì)其進(jìn)行修飾，利用雙官能團(tuán)交聯(lián)劑spdp既可與BSA反應(yīng)生成吡啶基又可與DOX-SH共軛形成雙硫鍵的特性，得到診療一體化納米探針DOX/cRGD-BSA@Au NCs。該二硫鍵可被腫瘤細(xì)胞內(nèi)過(guò)量表達(dá)的谷胱甘肽(GSH)破壞，釋放出DOX，達(dá)到靶向治療的目的。因此，白蛋白成為目前研究最廣泛的生物大分子載體，已成功應(yīng)用于臨床。

1.2 轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF) TF是一種具有儲(chǔ)存和代謝鐵元素的多功能蛋白，對(duì)血管生成、增殖和免疫抑制具有重要作用。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TFRs)是一種跨膜糖蛋白，其主要作用是通過(guò)與轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向結(jié)合介導(dǎo)鐵的吸收。研究發(fā)現(xiàn)，一些惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和腦癌等細(xì)胞中TFRs高度表達(dá)，這是由于癌細(xì)胞在生長(zhǎng)、DNA合成、分化和再生過(guò)程中需要大量鐵的緣故;并且與正常細(xì)胞相比，TFRs在癌細(xì)胞中表達(dá)升高了近100倍[9]。因此，TF可用作藥物傳遞系統(tǒng)中的靶向配體。Chen等[10]利用高壓均勻化法制備了轉(zhuǎn)鐵蛋白和葉酸共同修飾的蟾毒靈納米脂質(zhì)體，實(shí)現(xiàn)了肺癌的雙靶向治療作用;而且經(jīng)TF修飾后，脂質(zhì)體穩(wěn)定性得到提高，有效避免了納米脂質(zhì)體的非特異性、快速藥物釋放等缺點(diǎn)。

由于血腦屏障的存在，很多化療藥物無(wú)法進(jìn)入顱腦腫瘤內(nèi)部，導(dǎo)致化療藥物的治療效果大大降低。而TFRs是影響血腦屏障的主要蛋白之一，因此可以將化療藥物與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合，通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用，穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入腫瘤內(nèi)部[11]。Jhaveri等[12]將白藜蘆醇(RES)裝載到聚乙二醇化脂質(zhì)體(RES-L)中，并將該脂質(zhì)體表面修飾轉(zhuǎn)鐵蛋白分子形成靶向藥物TF-RES-Ls;與游離RES或RES-L相比，TF-RES-Ls對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。該研究對(duì)皮下種植GBM細(xì)胞的裸鼠模型進(jìn)行靶向藥物TF-RES-Ls的療效評(píng)估，結(jié)果表明TF-RES-Ls在抑制腫瘤生長(zhǎng)和提高裸鼠存活率方面比其他治療方案更有效。

但是有研究指出，TF的半衰期僅為8 min，TF可被迅速循環(huán)回到細(xì)胞表面并釋放[3]。如果TF與藥物分子之間連接的化學(xué)鍵在這8 min內(nèi)不能在細(xì)胞內(nèi)被破壞，其負(fù)載的藥物將隨TF一起出胞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離藥物濃度降低，細(xì)胞毒性降低。因此，如何延長(zhǎng)TF修飾納米藥物的半衰期是需要重點(diǎn)考慮和解決的問(wèn)題。

1.3 脂蛋白 脂蛋白是體內(nèi)重要的蛋白質(zhì)之一，主要由載脂蛋白、磷脂、TG和TC組成，TG和TC組成中心疏水核，外圍包被的載脂蛋白及磷脂組成親水基團(tuán)。根據(jù)脂類、載脂蛋白的類型、密度及大小，可將脂蛋白分為5類：乳糜微粒、極低密度脂蛋白(VLDL)、中間密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL)。脂蛋白主要參與TC和其他疏水分子在血液中的轉(zhuǎn)運(yùn)，通過(guò)識(shí)別其特異性受體進(jìn)入細(xì)胞。由于TC和脂肪酸水平的提高對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生存和快速增殖至關(guān)重要，在一些惡性腫瘤細(xì)胞中，特別是急性骨髓性白血病(AML)、直腸癌、肺癌、腦癌、轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞中脂蛋白受體過(guò)量表達(dá)[13]。因此，脂蛋白可被作為一種天然的內(nèi)源性靶分子。LDL和HDL是脂蛋白的兩個(gè)主要類型，目前被廣泛應(yīng)用于腫瘤的靶向治療。Shi等[14]制備出氨基化二氧化硅納米粒子，通過(guò)靜電吸附作用與脂蛋白相連，經(jīng)過(guò)修飾的納米粒子可裝載阿霉素用于直腸癌的靶向治療。

但是LDL結(jié)構(gòu)中多含有超過(guò)45%的膽固醇酯疏水核心，血液中過(guò)量的TC會(huì)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，增加心腦血管疾病發(fā)生的危險(xiǎn)。因此有學(xué)者嘗試對(duì)LDL的疏水核心重構(gòu)，代之以脂肪酸[15]等無(wú)害物質(zhì)。但是由于大多數(shù)正常組織及細(xì)胞中均存在LDL受體，LDL載體修飾的納米藥物可能被正常組織吸收，從而增加藥物的不良反應(yīng)；且LDL的溶酶體代謝途徑可能導(dǎo)致藥物分解，使LDL用于靶向藥物的傳遞作用受到限制。與LDL不同， HDL的受體是清道夫受體B類Ⅰ型(SR-BⅠ受體)，HDL可通過(guò)SR-BⅠ受體途徑而非溶酶體分解途徑，有效地將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)。而且，HDL被認(rèn)為是血管內(nèi)脂質(zhì)的清道夫，具有抗動(dòng)脈硬化的作用，故研究者們逐漸將重點(diǎn)投向HDL。Han等[16]將HDL與非甲基化寡核苷酸(CpG ODN)及AS1411適配體相連，使其具備特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞和核蛋白的雙靶向功能，隨后將DOX插入到CpG的CG堿基對(duì)中；CpG ODN可通過(guò)激活抗原提呈細(xì)胞(巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)，導(dǎo)致TNF、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、IL-12等促炎因子表達(dá)升高，產(chǎn)生免疫刺激作用，最終同步實(shí)現(xiàn)化療及免疫治療。

但是大量分離獲取天然HDL和LDL非常困難，并可能存在微生物感染的風(fēng)險(xiǎn)。為了解決這一問(wèn)題，部分學(xué)者已成功制備出具有脂蛋白受體識(shí)別功能的模擬肽[17]，無(wú)疑為以脂蛋白為載體修飾的靶向藥物傳遞系統(tǒng)的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供了新思路。

2 多糖

2.1 殼聚糖(CS) CS是由甲殼素通過(guò)脫乙酰作用得到的天然線性生物多糖，其基本結(jié)構(gòu)單元由氨基葡萄糖和N-乙酰胺基葡萄糖組成，這種結(jié)構(gòu)使CS中存在著大量游離的氨基[18]。游離的氨基不僅使CS帶有正電荷，還可以作為CS化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾的靶點(diǎn)，通過(guò)引入不同基團(tuán)和配體的方式制備一系列CS衍生物，從而提高CS的水溶性，增強(qiáng)相關(guān)生物活性[19]。多數(shù)陰離子藥物與帶正電荷的CS之間會(huì)發(fā)生強(qiáng)烈的電荷作用，形成交聯(lián)聚合物，這種交聯(lián)聚合物具有較為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，有利于延長(zhǎng)藥物釋放周期，以達(dá)到緩釋、控制釋藥的目的[20]。Song等[21]制備了磁性海藻酸鈉/殼聚糖納米粒子用于乳腺癌的靶向治療，體外釋放結(jié)果顯示，納米粒子中的姜黃素(Cur)在前兩天內(nèi)釋放較快，隨后釋放變慢；前兩天釋放速度較快的原因很可能是納米粒子表面或靠近粒子表面的Cur分子丟失所致，兩天之后Cur的釋放取決于粒子內(nèi)部Cur分子通過(guò)聚合物基質(zhì)向PBS溶液擴(kuò)散的速度，由于形成的聚合物基質(zhì)結(jié)構(gòu)致密，所以Cur釋放較為緩慢。

除了作為緩釋藥物載體外，CS由于富含氨基而對(duì)pH具有高度敏感性，不同pH可誘導(dǎo)CS鏈上氨基(-NH2)的質(zhì)子化/去質(zhì)子化，從而改變?nèi)苊浡?，影響藥物釋放[21]。消化道的pH從胃的1～3到小腸的6～7.5不等，pH變化可用來(lái)控制藥物釋放。對(duì)pH敏感的聚合物膠束可保護(hù)藥物在胃腸道上部不被破壞，實(shí)現(xiàn)以空間控制的方式釋放藥物。Woraphatphadung等[22]通過(guò)透析法成功制備出載藥率較高的Cur-CS-聚合膠束，并用于結(jié)腸癌的靶向治療，該膠束與不同pH的介質(zhì)接觸后形態(tài)發(fā)生變化，間接證實(shí)膠束的pH敏感性；該研究顯示，在模擬胃液(pH 1.2)中，膠束累積釋放Cur的百分比控制在20%左右，但在模擬腸液(pH 6.8)和模擬結(jié)腸液(pH 7.4)中，膠束Cur累積釋放量明顯增加，表明對(duì)pH敏感的CS-聚合膠束有望成為結(jié)腸靶向給藥的理想載體。

2.2 透明質(zhì)酸(HA) 與CS類似，HA是經(jīng)5β-膽汁酸修飾的酸性黏多糖，廣泛存在于細(xì)胞基質(zhì)中。HA由D-葡萄糖醛酸和N-乙?；?D-葡萄糖胺交替單元組成，通過(guò)交替的β-1，4和β-1，3-糖苷鍵連接在一起，其分子中有4個(gè)化學(xué)修飾位點(diǎn)，分別是羧基、羥基、N-乙酰氨基和還原末端，羥基和羧基是常用的修飾位點(diǎn)，可利用酯化、酰胺化、靜電作用等方法對(duì)其修飾,從而改善其性能。HA降解速度很快，機(jī)體通過(guò)透明質(zhì)酸酶可將基質(zhì)中的HA降解為無(wú)毒的CO2和H2O。HA無(wú)抗原性，可存在于任何一種生物體內(nèi)，無(wú)物種和組織差異性，最重要的是HA可以與許多腫瘤細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)的CD44受體特異性結(jié)合。因此，目前HA已被作為靶向配體用于癌癥治療[23]。此外，HA可在納米粒子表面形成親水層，保護(hù)其不被降解，從而延長(zhǎng)HA修飾納米粒子的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。Teijeiro-Valino等[24]將HA與腫瘤歸巢穿膜肽Lyp1(tLyp1)結(jié)合作為納米外殼，包埋油性核，并證實(shí)該納米載體所負(fù)載的藥物在原位腫瘤及淋巴系統(tǒng)均出現(xiàn)富集，在扼制原位腫瘤生長(zhǎng)的同時(shí),也抑制了腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移。

除了通過(guò)特異性識(shí)別CD44受體實(shí)現(xiàn)靶向功能外，由于HA可被透明質(zhì)酸酶水解，一些學(xué)者利用該原理構(gòu)建基于HA的納米載體，實(shí)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境的藥物釋放。近年來(lái)，能夠?qū)囟?、pH、氧化還原反應(yīng)、光輻照、酶及特定物質(zhì)(如過(guò)氧化氫[25])等外界和內(nèi)部刺激作出反應(yīng)的智能藥物遞送納米系統(tǒng)被認(rèn)為是最理想的藥物載體，封裝在這些系統(tǒng)中的藥物可以在指定的地點(diǎn)和時(shí)間,以期望的速度進(jìn)行釋放。Xu等[26]成功開發(fā)了一種新型的多功能納米探針金納米棒(GNRs)-HA-光敏劑5-氨基乙酰丙酸(ALA)/顯像劑(Cy7.5)-HER2，實(shí)現(xiàn)了雙靶向給藥、三重刺激藥物釋放、近紅外成像聯(lián)合PDT/PTT治療HER2陽(yáng)性乳腺癌；該納米探針在血液循環(huán)中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，GNRs、HA、ALA及Cy7.5所構(gòu)建的納米平臺(tái)能夠應(yīng)對(duì)pH、GSH和透明質(zhì)酸酶三重刺激觸發(fā)的藥物釋放行為。HA作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)了較好的應(yīng)用潛能，但大多數(shù)研究仍處于體外試驗(yàn)階段，體內(nèi)研究報(bào)道較少，而且HA生產(chǎn)工藝復(fù)雜，工業(yè)化難度大。因此，HA作為藥物載體的產(chǎn)業(yè)化和廣泛臨床應(yīng)用仍需進(jìn)一步研究。

3 脂類

目前，臨床上常用的化療藥物大多數(shù)為疏水性，由于水溶性差、 滲透性低等原因，導(dǎo)致其生物利用度低。脂類作為人體所需的重要營(yíng)養(yǎng)素之一，雖然種類繁多，但其分子結(jié)構(gòu)具有共同的特點(diǎn)，即均具有親水和疏水兩部分，這樣的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其在水相中會(huì)形成團(tuán)粒或片狀雙層結(jié)構(gòu)。脂類的極性頭部通過(guò)靜電引力對(duì)水有親和力，因而面向水；而疏水的尾部則互相聚集，避開水相，游離的兩端有自動(dòng)閉合趨勢(shì)。脂質(zhì)本身的理化特性和熱力學(xué)特點(diǎn)使其在水溶液中能夠保持穩(wěn)定，可作為疏水性化療藥物的理想載體。目前臨床上應(yīng)用最廣泛的是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體作為載體具有細(xì)胞樣膜結(jié)構(gòu)，能夠保護(hù)藥物或活性基團(tuán)，延長(zhǎng)藥物半衰期，載藥脂質(zhì)體可以通過(guò)滯留效應(yīng)在腫瘤組織中積累。在健康組織中，小分子藥物很容易從血管外滲出來(lái)，載藥脂質(zhì)體由于直徑較大而無(wú)法排出。腫瘤血管中存在異常寬的裂孔，可允許脂質(zhì)體的外滲，最終使化療藥物在腫瘤組織富集。但是由于脂質(zhì)體表現(xiàn)為正電荷，進(jìn)入體循環(huán)后易與負(fù)電性的血漿蛋白相互作用，并被單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(MPS)攝取，最終蓄積于肝臟和脾臟等器官中。顯然，這一現(xiàn)象不僅減少了藥物在靶組織(非MPS相關(guān)組織)的分布，而且還會(huì)對(duì)肝、脾等臟器造成損傷。為了解決這一問(wèn)題，一些學(xué)者考慮屏蔽脂質(zhì)體的正電荷，由此改良后的聚乙二醇化脂質(zhì)體阿霉素于1994年11月被FDA批準(zhǔn)用于臨床應(yīng)用，成為第一個(gè)納米級(jí)抗癌藥物[27]。在此基礎(chǔ)上，Sesarma等[28]將長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體阿霉素進(jìn)一步包封Cur，改良后的脂質(zhì)體制劑具有良好的抗腫瘤作用。

為了獲得更好的脂質(zhì)體傳遞系統(tǒng)，許多學(xué)者在經(jīng)典脂質(zhì)體分子的基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和表面修飾，生成具有特定生物效應(yīng)的新型脂質(zhì)體，包括特異性靶向脂質(zhì)體、環(huán)境敏感脂質(zhì)體、多功能脂質(zhì)體等，大大擴(kuò)展了脂質(zhì)體在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。在癌癥治療中，化療藥物經(jīng)常會(huì)遇到藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如P-糖蛋白(P-gp)過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的多重耐藥現(xiàn)象。Chen等[29]開發(fā)了一種新型脂質(zhì)體系統(tǒng)，該系統(tǒng)在生理?xiàng)l件(pH 7.4)下帶負(fù)電荷，可顯著延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間；在腫瘤微環(huán)境(pH 6.5)中,該脂質(zhì)體系統(tǒng)可反轉(zhuǎn)為正電荷，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞攝取和細(xì)胞內(nèi)藥物積累。還有一部分學(xué)者構(gòu)建溫敏性脂質(zhì)體[30]，該脂質(zhì)體通過(guò)激光加熱裝置、提高孵育溫度及磁共振引導(dǎo)的高強(qiáng)度聚焦超聲等提高局部溫度，控制藥物釋放，從而減少化療藥物對(duì)正常組織的毒性作用，并增強(qiáng)腫瘤內(nèi)化療藥物的峰值濃度。自1985年第一種脂質(zhì)體包囊藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段以來(lái)，已有40多種脂質(zhì)體包囊藥物成功上市,或處于不同的臨床研究階段。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，相信越來(lái)越多的高效脂質(zhì)體載體將被廣泛應(yīng)用于臨床，在各種腫瘤疾病的治療中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，生物大分子作為生物體內(nèi)的天然活性成分，具有良好的生物相容性、易降解、血漿半衰期長(zhǎng)、低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，是理想的藥物載體。研究人員利用共價(jià)、非共價(jià)結(jié)合(包埋封裝、疏水作用、靜電吸附)和表面修飾活性基團(tuán)等方法[31]，開發(fā)了基于生物大分子為載體的多功能納米載藥系統(tǒng)，并取得了滿意進(jìn)展。兩種或兩種以上生物大分子的聯(lián)合應(yīng)用也越來(lái)越受到人們的關(guān)注，但是利用其進(jìn)行藥物傳遞并不能與體外保持完全相同的特性，且各類結(jié)合方式的引入可能會(huì)對(duì)生物大分子固有的理化特性造成影響。目前為止，只有少數(shù)幾種以生物大分子為載體的納米靶向藥物被批準(zhǔn)用于臨床。未來(lái)仍需通過(guò)合理設(shè)計(jì)構(gòu)建更加完善的生物載藥系統(tǒng)，加快研究成果從實(shí)驗(yàn)室到臨床的轉(zhuǎn)化，以滿足臨床需求。