子宮內(nèi)膜異位癥不孕患者的卵母細(xì)胞形態(tài)及體外受精-胚胎移植結(jié)局觀察

寧艷春，韓寶生，劉秀榮，李宜學(xué)，郭劍，趙銘佳，劉海靜

(唐山市婦幼保健院，063000)

子宮內(nèi)膜異位癥近年來(lái)發(fā)病率逐漸增高，且子宮內(nèi)膜異位癥患者的妊娠結(jié)局較差。不孕癥患者體外受精-胚胎移植(IVF-ET)過(guò)程主要涉及選卵、受精、胚胎培養(yǎng)以及胚胎移入子宮等，其中選卵過(guò)程中卵母細(xì)胞質(zhì)量的準(zhǔn)確評(píng)估是預(yù)測(cè)后期的正常受精、適時(shí)卵裂、最終臨床妊娠的關(guān)鍵。卵母細(xì)胞質(zhì)量的評(píng)估方法主要涉及形態(tài)、細(xì)胞學(xué)以及分子水平上的研究，其中卵母細(xì)胞形態(tài)是指評(píng)估卵母細(xì)胞的胞漿均勻程度是否有顆?；蚩张荨⒙阎芟洞笮?、透明帶形態(tài)以及薄厚是否正常、極體大小形態(tài)等。本研究觀察了子宮內(nèi)膜異位癥不孕患者的卵母細(xì)胞形態(tài)及IVF-ET臨床結(jié)局。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2010年6月～2018年6月在唐山市婦幼保健院接受輔助生殖技術(shù)(ART)助孕的648例子宮內(nèi)膜異位癥不孕患者(共5365個(gè)成熟卵母細(xì)胞)為觀察組，選取同期785例因男性因素致不孕癥患者(共7015個(gè)成熟卵母細(xì)胞)為對(duì)照組。觀察組患者年齡23～38(28.23±6.98)歲，不孕年限1～10(6.12±6.36)年，BMI(21.56±3.26)kg/m2，竇卵泡數(shù)(AFC)(4.52±1.36)個(gè)，促卵泡生成素(FSH)(6.26±2.36)IU/L，促黃體生成素(LH)(6.36±2.10)IU/L，雌二醇(E2)(23.5±3.65)pg/mL；對(duì)照組患者年齡21～42(27.35±5.69)歲，不孕年限1～11(5.36±5.63)年，BMI(20.91±2.35)kg/m2，AFC(5.36±1.98)個(gè)，F(xiàn)SH(5.63±3.26)IU/L，LH(5.69±2.35)IU/L，E2(20.6±4.36)pg/mL；兩組患者基礎(chǔ)資料相比，P均>0.05。納入標(biāo)準(zhǔn)：①觀察組患者均為首次發(fā)現(xiàn)囊腫，經(jīng)腹腔鏡手術(shù)或B超下囊腫穿刺證實(shí)；②對(duì)照組患者均為男方少、弱、畸形精子癥導(dǎo)致的不孕；③基礎(chǔ)內(nèi)分泌正常，月經(jīng)規(guī)律；④排除其他ART的禁忌癥；⑤兩組患者對(duì)應(yīng)的男性精液分析顯示都可以進(jìn)行常規(guī)受精。

1.2 兩組患者的卵母細(xì)胞形態(tài)觀察 觀察組患者采用超長(zhǎng)方案進(jìn)行控制性促排卵：月經(jīng)第5天時(shí)注射第1支長(zhǎng)效促性腺素釋放激素激動(dòng)劑(GnRHa)達(dá)菲林3.75 mg，各間隔28天后分別注射第2、3支達(dá)菲林，最后1只達(dá)菲林注射后第35天進(jìn)行超聲及血清激素檢查，待達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后，加用FSH果納芬和/或尿促性素(HMG)150～375 IU/d進(jìn)行控制性促排卵治療。降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)：內(nèi)膜厚度<6 mm、雙側(cè)卵巢未見卵泡發(fā)育、血清E2濃度30～55 pg/mL(109.8～201.3 pmol/L)。對(duì)照組患者采用長(zhǎng)方案進(jìn)行控制性促排卵：月經(jīng)第5天開始口服媽富隆，每日1片，共21 d，服藥第19天予達(dá)菲林0.1 mg皮下注射，每日1次，待達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后，加用FSH果納芬和/或HMG 150～375 IU/d進(jìn)行控制性促排卵治療。兩組患者進(jìn)行控制性促排卵治療后，當(dāng)有2個(gè)卵泡直徑>18 mm或3個(gè)卵泡直徑>17 mm時(shí)，肌注人絨毛膜促性腺激素(hCG)5 000～10 000 IU，之后36～38 h取卵。所有卵泡的發(fā)育監(jiān)測(cè)都由1位有經(jīng)驗(yàn)醫(yī)師完成。當(dāng)日8：30取卵后培養(yǎng)2～3小時(shí)，然后常規(guī)授精，之后4～6小時(shí)觀察并計(jì)數(shù)成熟卵母細(xì)胞數(shù)；取卵后第1天7：00～8：00，觀察兩組成熟卵母細(xì)胞形態(tài)，計(jì)算正常形態(tài)、胞漿顆粒粗、卵周隙大、透明帶厚、極體碎卵母細(xì)胞所占比例。

1.3 兩組患者的IVF-ET臨床結(jié)局觀察 ①取卵后第1天7：00～8：00，計(jì)數(shù)成熟卵母細(xì)胞的正常受精卵數(shù)，計(jì)算正常受精率，正常受精率=正常受精卵數(shù)/成熟卵母細(xì)胞數(shù)×100%。②胚胎移植當(dāng)天觀察并記錄受精卵的卵裂數(shù)、胚胎總數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)，計(jì)算卵裂率和優(yōu)胚率，卵裂率=卵裂數(shù)/正常受精卵數(shù)×100%，優(yōu)胚率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/胚胎總數(shù)×100%。③移植后第14天檢測(cè)β-hCG，β-hCG>25 IU/L為生化妊娠，計(jì)算生化妊娠率，生化妊娠率=生化妊娠數(shù)/移植周期數(shù)×100%。④移植后第28天進(jìn)行B超檢查，確定是否臨床妊娠，計(jì)算臨床妊娠率，臨床妊娠率=臨床妊娠數(shù)/移植周期數(shù)×100%。⑤后期隨訪流產(chǎn)率，流產(chǎn)率=流產(chǎn)數(shù)/臨床妊娠數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的卵母細(xì)胞形態(tài)比較 觀察組患者正常形態(tài)、胞質(zhì)顆粒粗、卵周隙大、透明帶厚、極體碎的卵母細(xì)胞占比分別為67.23%±28.3%、6.92%±1.31%、10.41%±3.65%、7.91%±2.68%、7.52%±2.13%，對(duì)照組患者正常形態(tài)、胞質(zhì)顆粒粗、卵周隙大、透明帶厚、極體碎的卵母細(xì)胞占比分別為75.01%±20.35%、5.63%±1.73%、6.32%±2.34%、7.22%±2.35%、5.86%±2.03%，兩組患者正常形態(tài)、卵周隙大的卵母細(xì)胞占比相比，P均<0.05。

2.2 兩組患者的IVF-ET臨床結(jié)局比較 觀察組患者的正常受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、生化妊娠率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率分別為75.38%±20.36%、96.32%±30.43%、10.42%±3.24%、34.95%±7.65%、27.54%±7.65%、1.32%±0.35%，對(duì)照組患者的正常受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、生化妊娠率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率分別為89.67%±25.63%、98.86%±32.54%、26.35%±8.36%、57.23%±13.65%、52.81%±15.96%、0.98±0.29%，兩組患者的正常受精率、優(yōu)胚率、生化妊娠率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率相比，P均<0.05。

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥是婦科常見病，發(fā)生率較高，一般在10%～15%左右，且有逐年增加的趨勢(shì)[1]。在人工助孕領(lǐng)域子宮內(nèi)膜異位癥合并的不孕癥患者逐漸增多。由于異位內(nèi)膜影響的卵巢周圍環(huán)境的改變，盆腔巨噬細(xì)胞濃度增高及活化、T淋巴細(xì)胞改變、細(xì)胞因子和前列腺素的分泌等使卵母細(xì)胞發(fā)育受損，影響IVF-ET過(guò)程中的卵母細(xì)胞質(zhì)量、受精情況、胚胎質(zhì)量、著床內(nèi)膜環(huán)境等，從而導(dǎo)致其臨床結(jié)局較差[2～4]。

成熟卵母細(xì)胞形態(tài)學(xué)質(zhì)量評(píng)估是目前簡(jiǎn)單易行的非侵入性的預(yù)測(cè)IVF-ET臨床結(jié)局的方法，其中形態(tài)學(xué)評(píng)估也包括卵冠丘復(fù)合物以及紡錘體的情況，其中形態(tài)學(xué)評(píng)估包括卵母細(xì)胞的胞質(zhì)是否有顆粒、透明帶薄厚、極體大小形態(tài)、卵周隙大小、卵冠丘復(fù)合物以及紡錘體的情況等。本研究未進(jìn)行卵冠丘復(fù)合物以及紡錘體的觀察，是由于選卵的時(shí)候需盡量減少卵子在體外暴露的時(shí)間，而且只能是選卵者在選卵的同時(shí)進(jìn)行卵冠丘復(fù)合物的大致觀察，收集的所有卵冠丘復(fù)合物(包括各階段的不成熟卵、成熟卵，)均集中于一個(gè)皿中，不便于分析觀察，且本研究只是觀察成熟卵母細(xì)胞的形態(tài)學(xué)信息，所以未將卵冠丘復(fù)合物的評(píng)價(jià)列入其中；由于紡錘體對(duì)于胞質(zhì)周圍環(huán)境的改變非常敏感，很容易在體外操作和減數(shù)分裂成熟過(guò)程中遭到破壞，限制了紡錘體觀察的臨床應(yīng)用和分析，所以本研究也未將紡錘體的觀察列入其中。本研究?jī)H選取了培養(yǎng)過(guò)程中比較容易觀察到的卵母細(xì)胞的形態(tài)包括卵胞漿中是否有顆粒、透明帶是否過(guò)厚、卵周隙是否過(guò)大、極體是完整還是碎裂這4種異常情況進(jìn)行觀察。

正常受精后的卵母細(xì)胞為后期胚胎的正常發(fā)育提供絕大部分的營(yíng)養(yǎng)支持，為胚胎的適時(shí)卵裂、分化、著床做好準(zhǔn)備，因此卵母細(xì)胞質(zhì)量在IVF-ET過(guò)程中是非常關(guān)鍵的因素之一[5]。關(guān)于卵母細(xì)胞的形態(tài)異常有兩種對(duì)立的觀點(diǎn)，一種觀點(diǎn)認(rèn)為卵母細(xì)胞形態(tài)跟IVF-ET臨床結(jié)局關(guān)系不大[6～8]，另一種觀點(diǎn)認(rèn)為卵母細(xì)胞形態(tài)跟IVF-ET臨床結(jié)局有一定的關(guān)系。正常的成熟卵母細(xì)胞形態(tài)主要包括形態(tài)大小合適的第一極體、看似均勻正常的胞漿、薄厚合適的透明帶以及大小恰當(dāng)?shù)穆阎芟丁Ｔ贗VF-ET助孕促排卵過(guò)程中由于大量促卵泡激素的應(yīng)用，卵母細(xì)胞的胞漿與胞核的同步成熟發(fā)育是關(guān)鍵[9，10]。形態(tài)正常的卵母細(xì)胞不一定是胞漿和胞核同步發(fā)育，那么形態(tài)異常的卵母細(xì)胞是不是有可能是胞漿與胞核未同步發(fā)育的一種外在表現(xiàn)呢？本研究分析了評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞形態(tài)質(zhì)量中較常見的幾類卵母細(xì)胞，包括顆粒粗、周隙大、透明帶厚、極體碎等4種常見異常形態(tài)在子宮內(nèi)膜異位癥不孕患者和男性因素致不孕癥患者中發(fā)生的比例，結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜異位癥不孕患者的卵母細(xì)胞正常形態(tài)比例較低，形態(tài)異常的卵母細(xì)胞周隙大的所占的比例較高。

卵周隙是卵細(xì)胞膜和透明帶之間的空隙，其內(nèi)含第一極體。在卵母細(xì)胞發(fā)育的過(guò)程中，成熟前卵母細(xì)胞的形態(tài)就是極體剛剛從卵胞膜中排出來(lái)，極體扁平，卵周隙很小。那么卵周隙大的卵母細(xì)胞是怎樣形成的呢？目前研究[11]發(fā)現(xiàn)，卵周隙大的卵母細(xì)胞有可能是卵子過(guò)熟導(dǎo)致胞漿皺縮，造成了卵周隙變大，另一種說(shuō)法是排出第一極體時(shí)伴隨釋放了大量的糖蛋白，造成了卵周隙變大。有研究發(fā)現(xiàn)，卵周隙的大小與卵母細(xì)胞的受精率、后期卵裂率以及發(fā)育潛能，著床潛力有一定的聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，觀察組患者卵周隙大的形態(tài)異常卵母細(xì)胞的比例顯著升高，而正常受精率、優(yōu)胚率、生化妊娠率以及臨床妊娠率顯著下降。那么是否有可能是子宮內(nèi)膜異位癥不孕患者卵周隙大的卵母細(xì)胞增多導(dǎo)致卵母細(xì)胞總體質(zhì)量下降，最終導(dǎo)致IVF-ET臨床結(jié)局較差呢？這有待于我們進(jìn)一步研究。與對(duì)照組相比，觀察組的流產(chǎn)率也是顯著增高的，我們認(rèn)為這可能與其特殊的卵巢、盆腔微環(huán)境和較差的胚胎質(zhì)量有關(guān)。

綜上所述，與男性因素致不孕癥患者相比，子宮內(nèi)膜異位癥不孕患者的正常形態(tài)卵母細(xì)胞占比降低、卵周隙大的卵母細(xì)胞占比升高，正常受精率、優(yōu)胚率、生化妊娠率以及臨床妊娠率下降，流產(chǎn)率顯著增加，IVF-ET臨床結(jié)局較差，提示子宮內(nèi)膜異位癥不孕患者卵巢局部微環(huán)境的改變有可能影響卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程，使卵母細(xì)胞質(zhì)量發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致臨床指標(biāo)的改變，有待于深入研究。