卵巢癌組織中l(wèi)ncRNA-PVT1、miR-31的表達(dá)變化及其臨床意義

劉晶晶，陸娟，張彬彬，李丹

(本溪市中心醫(yī)院，遼寧本溪117000)

卵巢癌是臨床上較為常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在所有女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中位居第3位，其中上皮性卵巢癌在卵巢癌中是最常見(jiàn)的病理類(lèi)型。由于卵巢癌在發(fā)病早期具有較強(qiáng)的隱匿性，且易出現(xiàn)多臟器的癌細(xì)胞增殖、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，患者5年生存率僅為30%左右，病死率在所有婦科惡性腫瘤中位居首位[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)介導(dǎo)機(jī)體多種復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，在染色質(zhì)調(diào)控、重塑以及組蛋白修飾、基因組印跡等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。研究[3]顯示，長(zhǎng)鏈非編碼RNA漿細(xì)胞瘤移位基因1(lncRNA-PVT1)位于染色體8q24.21上，在鼻咽癌、前列腺癌以及乳腺癌等多種腫瘤中表達(dá)升高,其可在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平及蛋白質(zhì)水平影響下游癌基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等行為。微小RNA(miR)是細(xì)胞內(nèi)小的非編碼RNA分子，長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸，可結(jié)合靶基因mRNA的3′端非翻譯區(qū)，降低mRNA的穩(wěn)定性，調(diào)控基因表達(dá)，影響細(xì)胞的發(fā)育、分化、增殖和凋亡等生物學(xué)行為。研究[4]發(fā)現(xiàn)，miR-31在乳腺癌、胃癌等多種腫瘤中呈明顯低表達(dá)，miR-31通過(guò)結(jié)合并抑制Ras同源基因家族成員A(RhoA)等基因的mRNA的表達(dá)，抑制下游信號(hào)傳導(dǎo)通路的傳導(dǎo)，發(fā)揮抑制增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的作用。有研究[5，6]表明，lncRNA-PVT1能夠作為分子海綿結(jié)合并抑制miR-31的表達(dá)，導(dǎo)致miR-31失去對(duì)下游周期素依賴(lài)性激酶1(CDK1)的表達(dá)抑制作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。本研究觀察了卵巢癌組織中l(wèi)ncRNA-PVT1、miR-31的表達(dá)情況，分析兩者間的相關(guān)性及與卵巢癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年2月～2017年2月本溪市中心醫(yī)院收治的卵巢癌患者93例，年齡41～77歲，平均年齡(58.23±10.73)歲，其中FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期61例、Ⅲ～Ⅳ期32例，高分化26例、中分化34例、低分化33例，腹膜轉(zhuǎn)移59例、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例，組織學(xué)類(lèi)型為漿液性53例、非漿液性40例，腫瘤直徑<2 cm者31例、腫瘤直徑≥2 cm者62例?；颊呔邮苁中g(shù)治療，術(shù)中留取癌組織及癌旁組織，迅速置于凍存管內(nèi)，液氮速凍后，置于-80 ℃冰箱保存。納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究對(duì)象均經(jīng)手術(shù)病理組織活檢確診為卵巢癌,均符合2009年國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②既往無(wú)放化療及免疫治療病史；③無(wú)臨床病歷資料缺失。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤疾病者；②伴有心、肝、腎等重要臟器功能障礙者；③交流溝通障礙或伴有精神疾病者。本研究獲得研究對(duì)象同意，并得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 卵巢癌組織及癌旁組織中l(wèi)ncRNA-PVT1、miR-31檢測(cè)方法 取50 mg組織標(biāo)本，采用TRIzol法提取癌組織及癌旁組織總RNA。取1 μg總RNA，采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并采用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下：lncRNA-PVT1上游引物為5′-TGAGAACTGTCCTTACGTGACC-3′，下游引物為5′-AGAGCACCAAGACTCGCTCT-3′；GAPDH的上游引物為5′-TGAGAACTGTCCTTACGTGACC-3′，下游引物為5′-AGAGCACCAAGACTGGCTCT-3′；miR-31上游引物為5′-GTTGGAGACGACGCAAGAT-3′，下游引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，循環(huán)37次。將GAPDH作為lncRNA-PVT1的內(nèi)參，以U6作為miR-31的內(nèi)參，以2-ΔCt表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組織與癌旁組織中l(wèi)ncRNA-PVT1、miR-31表達(dá)比較 卵巢癌組織中l(wèi)ncRNA-PVT1、miR-31的相對(duì)表達(dá)量分別為3.10±0.24、0.53±0.12，癌旁組織中l(wèi)ncRNA-PVT1、miR-31的相對(duì)表達(dá)量分別為1.02±0.17、0.94±0.14，兩者相比，P均<0.05。

2.2 卵巢癌組織中l(wèi)ncRNA-PVT1、miR-31表達(dá)的相關(guān)性 卵巢癌組織中l(wèi)ncRNA-PVT1、miR-31表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.672，P=0.012)。

2.3 癌組織中l(wèi)ncRNA-PVT1、miR-31表達(dá)與卵巢癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 癌組織中l(wèi)ncRNA-PVT1、miR-31表達(dá)與卵巢癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系見(jiàn)表1。表1顯示，lncRNA-PVT1、miR-31表達(dá)與卵巢癌患者腫瘤FIGO分期、腹膜轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。

3 討論

卵巢癌是女性較為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性的生命。由于該病早期缺乏明顯的臨床表現(xiàn)，因此約70%的卵巢癌患者一經(jīng)確診便已是中晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，喪失手術(shù)根治的最佳時(shí)機(jī)，預(yù)后較差[7]。因此，尋找卵巢癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子并確定其作用機(jī)制，對(duì)卵巢癌的臨床診斷和治療具有重要的價(jià)值。非編碼RNA(ncRNA)是近年發(fā)現(xiàn)的調(diào)控基因表達(dá)的重要分子，包括lncRNA、miRNA及環(huán)狀RNA等，能夠在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯及蛋白水平調(diào)控靶基因的功能，參與細(xì)胞發(fā)育、分化等過(guò)程[8],在腫瘤、自身免疫性疾病及神經(jīng)退行性疾病中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用，有望成為疾病診斷、治療的重要靶點(diǎn)[9]。

表1 癌組織中l(wèi)ncRNA-PVT1、miR-31表達(dá)量與卵巢癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

lncRNA屬于近年來(lái)所發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)長(zhǎng)度≥200核苷酸的新型RNA分子，其不具有編碼蛋白質(zhì)的功能，但廣泛參與了機(jī)體的基因表達(dá)調(diào)控、蛋白復(fù)合體啟動(dòng)、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)構(gòu)建以及腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等多種復(fù)雜的生物學(xué)行為過(guò)程[10]。研究[11]顯示，lncRNA-PVT1在多種腫瘤中表達(dá)增高，可通過(guò)參與DNA重排、編碼miRNA以及與MYC蛋白相互作用參與細(xì)胞表達(dá)調(diào)控，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，卵巢癌組織中l(wèi)ncRNA-PVT1表達(dá)明顯高于癌旁組織，其機(jī)制可能是腫瘤發(fā)生時(shí)原癌基因MYC表達(dá)增加，而MYC蛋白能夠結(jié)合PVT1基因啟動(dòng)子區(qū)域的E盒區(qū)，促進(jìn)PVT1基因的表達(dá)[12]。此外，本研究結(jié)果顯示，卵巢癌患者lncRNA-PVT1表達(dá)還與FIGO分期、腹膜轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其機(jī)制可能是lncRNA-PVT1通過(guò)影響癌基因及抑癌基因重排，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤增殖作用。研究[13]發(fā)現(xiàn)，lncRNA-PVT1能夠促進(jìn)含WW結(jié)構(gòu)域的氧化還原酶(WWOX)等抑癌基因的基因重排，導(dǎo)致WWOX基因失活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致分期增高。研究[14]顯示，lncRNA-PVT1可直接結(jié)合并抑制miR-200a和miR-200b，而miR-200a和miR-200b抑制MMP9表達(dá)，lncRNA-PVT1以轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的方式上調(diào)MMP9表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的發(fā)生，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

miRNA是一類(lèi)廣泛表達(dá)于真核生物內(nèi)的小分子單鏈非編碼RNA，成熟的miRNA參與構(gòu)成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)，通過(guò)堿基配對(duì)的方式結(jié)合靶基因mRNA的3′端非翻譯區(qū)，改變mRNA的穩(wěn)定性，調(diào)控基因表達(dá)[15]。miR-31作為miRNA的一員，能夠抑制磷脂酰肌醇3激酶/絲蘇氨酸激酶1(PI3K/AKT)信號(hào)通路中PI3K等多種關(guān)鍵癌基因表達(dá)，發(fā)揮抑癌基因的作用。多項(xiàng)研究[16]證實(shí)，miR-31在肝癌、肺癌等多種腫瘤中均存在表達(dá)下降的現(xiàn)象，miR-31表達(dá)降低導(dǎo)致配對(duì)盒基因9(PAX9)表達(dá)增加，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程。本研究中，miR-31在卵巢癌組織中的表達(dá)水平明顯較癌旁正常組織低，其表達(dá)降低的機(jī)制可能與miR-31基因啟動(dòng)子區(qū)表觀遺傳學(xué)修飾后導(dǎo)致基因表達(dá)沉默有關(guān)。有研究[17]報(bào)道，腫瘤細(xì)胞中miR-31基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化導(dǎo)致miR-31表達(dá)降低，進(jìn)而導(dǎo)致下游轉(zhuǎn)錄因子1(E2F1)表達(dá)增高，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。此外，本研究結(jié)果顯示，miR-31表達(dá)與卵巢癌患者的FIGO分期以及腹膜轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在密切相關(guān)，可能是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞中miR-31可通過(guò)直接抑制大腫瘤抑制基因2(LATS2)的表達(dá)，促進(jìn)調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞向間質(zhì)性表型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移。

有研究[6]報(bào)道，腫瘤細(xì)胞中的lncRNA-PVT1能夠作為分子海綿結(jié)合并抑制miR-31的表達(dá)，從而發(fā)揮對(duì)miR-31下游增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)癌基因的表達(dá)調(diào)控作用。本研究進(jìn)行相關(guān)性分析可得，卵巢癌組織中l(wèi)ncRNA-PVT1表達(dá)與miR-31表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系，與相關(guān)研究結(jié)果一致，但目前兩者相互作用的機(jī)制尚不清楚。

綜上所述，卵巢癌組織中l(wèi)ncRNA-PVT1高表達(dá)，而miR-31低表達(dá)，兩者負(fù)相關(guān)，兩者表達(dá)與卵巢癌患者腫瘤FIGO分期、腹膜轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，有可能成為新的卵巢癌診斷標(biāo)志物，可用于輔助判斷卵巢癌的進(jìn)展情況，但兩者在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制有待深入研究。