外源性鋅離子培養(yǎng)/低氧環(huán)境下大鼠Müller細胞活力、鋅離子濃度變化及促紅細胞生成素的調節(jié)作用觀察

康道歡，史彩平

(浙江大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學研究中心，杭州310003)

鋅離子在視網(wǎng)膜上的含量較高，主要分布于視網(wǎng)膜色素上皮細胞和膠質細胞，并且在調節(jié)突觸傳遞、抗氧化應激反應中起重要作用。研究[1]表明，暗適應的破壞、黃斑變性等與人體內鋅離子缺乏導致的視網(wǎng)膜抗氧化劑減少有關。鋅離子同樣可以降低糖尿病患者中脂質過氧化反應和谷胱甘肽水平[2]。研究[3]表明，促紅細胞生成素(EPO)具有保護缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜神經(jīng)和血管的作用，EPO可以通過抑制HIF-1α的表達起抗VEGF的作用[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，EPO及其受體在視網(wǎng)膜中表達，并且EPO對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的保護存在劑量關系。在低氧誘導的視網(wǎng)膜中，EPO通過抗凋亡途徑來保護一過性缺血缺氧和再灌注損傷，同時EPO還可以通過降低炎性因子(TNF-α、IL-1β)的表達改善缺氧性視網(wǎng)膜病變中的炎性反應[6]。鋅離子轉運體8(ZnT8)在視網(wǎng)膜上表達，主要表達于視網(wǎng)膜色素上皮細胞、Müller細胞。已有文獻報道ZnT8在糖尿病患者靜脈血[7]及糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達下降，并且抑制HIF-1α的表達可以增加ZnT8的表達。本研究通過在大鼠Müller細胞系rMC-1中加入氯化鋅(ZnCl2)及EPO，觀察外源性鋅離子、EPO對大鼠Müller細胞系rMC-1細胞活力、細胞凋亡率影響，并在此基礎上，通過在rMC-1細胞中加入氯化鈷(CoCl2)誘導低氧環(huán)境[8]，觀察低氧環(huán)境、EPO對rMC-1細胞中鋅離子濃度、ZnT8表達的影響。現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 加入外源性鋅離子培養(yǎng)的大鼠Müller細胞系rMC-1細胞活力及EPO調節(jié)作用觀察

1.1.1 細胞培養(yǎng)、分組及鋅離子和EPO的給予 取凍存于液氮中的rMC-1細胞置于37 ℃水浴鍋中解凍1 min后，轉移到含9 mL DMEM+10%血清+1% P/S培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)3～4代。取生長狀態(tài)良好的rMC-1細胞，按1 000個/孔接種于96孔板中，分成3組，分別記為ZnCl2組、ZnCl2+EPO組、正常對照組，分別加入ZnCl2、ZnCl2+EPO、等量培養(yǎng)基，每組設6個復孔。ZnCl2組ZnCl2終濃度為125 μmol/L，ZnCl2+EPO組ZnCl2終濃度為125 μmol/L、EPO的終濃度為40 U/mL。

1.1.2 ZnCl2組、ZnCl2+EPO組、正常對照組細胞活力觀察 采用MTT法。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，PBS清洗一次，加入0.5 mg/mL的MTT溶液孵育4 h，移去上清液，保留結晶體，每孔加入100 uL DMSO，37 ℃搖床低速振蕩10 min，選擇490 nm為主波長，570 nm為參比波長，在酶標儀上測定各孔的光密度值(OD值)，計算細胞活力。細胞活力=OD值(490 nm)/OD值(570 nm)。實驗重復3次，取平均值。

1.1.3 ZnCl2組、ZnCl2+EPO組、正常對照組細胞凋亡率觀察 采用TUNEL法。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，PBS漂洗細胞2次，蛋白酶K(20 μg/mL)室溫孵育5 min，PBS漂洗2次；加入50 μL TUNEL反應混合液于標本上，在37 ℃暗濕盒中孵育1 h；PBS漂洗2次，DAPI(2 μg/mL)室溫下孵育5 min染核，熒光顯微鏡下觀察，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=熒光細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2 低氧環(huán)境下大鼠Müller細胞系rMC-1細胞內鋅離子濃度變化及EPO的調節(jié)作用觀察

1.2.1 細胞培養(yǎng)、分組及CoCl2和EPO的給予 取凍存于液氮中的rMC-1細胞置于37 ℃水浴鍋中解凍1 min，解凍后轉移到含9 mL DMEM+10%血清+1% P/S培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)3～4代。取生長狀態(tài)良好的rMC-1細胞接種于蓋玻片上，分成3組，分別記為CoCl2組、CoCl2+EPO組、正常對照組，分別加入CoCl2(誘導低氧環(huán)境)、CoCl2+EPO、等量培養(yǎng)基。CoCl2組CoCl2終濃度為200 μmol/L，CoCl2+EPO組CoCl2終濃度為200 μmol/L、EPO的終濃度為40 U/mL。

1.2.2 CoCl2組、CoCl2+EPO組、正常對照組鋅離子濃度觀察 采用鋅離子探針FluoZin-3 AM檢測低氧環(huán)境及EPO對rMC-1細胞內鋅離子濃度的影響。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，在37 ℃條件下加入FluoZin-3 AM(5 μmol/L)孵育1 h，PBS清洗1次，然后將蓋玻片換成新鮮培養(yǎng)基，37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)30 min，DAPI染核5 min，PBS清洗3次，每次5 min，DAKO封片，熒光顯微鏡下觀察各組細胞的熒光情況。取1×105個rMC-1細胞于熒光比色杯中，用熒光分光光度計檢測在激發(fā)波長為365/490 nm處的熒光強度，以熒光強度表示細胞內鋅離子濃度。

1.2.3 CoCl2組、CoCl2+EPO組、正常對照組rMC-1細胞內ZnT8表達影響觀察 ①采用qRT-PCR法檢測各組rMC-1細胞內ZnT8 mRNA。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基后用蛋白酶溶解收集細胞，TRIzol試劑提取RNA，取500 ng RNA逆轉錄成cDNA，逆轉錄條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。以cDNA作為模板，進行PCR擴增，PCR總反應體積20 μL。引物序列如下：ZnT8正向引物為5′-AAGTGGAGACTCTGTGCTGCTTCA-3′,反向引物為5′-GGCCTCGATGACAACCACAAAGAA-3′,β-actin正向引物為5′-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′,反向引物為5′-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3′。PCR擴增條件：95 ℃預變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃繼續(xù)延伸40 s，共39循環(huán)。以2-ΔΔCt表示細胞中ZnT8 mRNA的相對表達量。②采用Western blotting法檢測各組rMC-1細胞內ZnT8 蛋白。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基后用蛋白酶溶解收集細胞，加入組織蛋白抽提液提取蛋白，BCA法測蛋白濃度；取配制好的10%的膠，以每泳道40 mg蛋白進行電泳分離，電泳條件為80 V 30 min，120 V 1 h，4 ℃下300 mA 2 h轉至PVDF膜上，5% PBS脫脂牛奶封閉30 min，加入一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，Odyssey Infrared Imaging系統(tǒng)計算細胞中ZnT8蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 ZnCl2組、ZnCl2+EPO組、正常對照組rMC-1細胞活力及凋亡率比較 ZnCl2組、ZnCl2+EPO組、正常對照組rMC-1細胞活力分別為0.252±0.034、0.342±0.031、0.513±0.040，組間相比，P均<0.05，說明rMC-1細胞在外源性鋅離子處理后活力下降，EPO治療具有保護作用。

ZnCl2組、ZnCl2+EPO組、正常對照組rMC-1細胞凋亡率分別為60.326%±5.230%、28.268%±3.756%、15.124%±3.521%，組間相比，P均<0.01。

2.2 CoCl2組、CoCl2+EPO組、正常對照組rMC-1細胞中鋅離子濃度、ZnT8表達比較 CoCl2組、CoCl2+EPO組、正常對照組rMC-1細胞內鋅離子濃度分別為6.712%±1.251%、4.723%±0.892%、3.428%±0.522%，組間相比，P均<0.05。

CoCl2組rMC-1細胞中ZnT8 mRNA和蛋白的相對表達量分別為0.224±0.038、2.436±0.187，CoCl2+EPO組rMC-1細胞中ZnT8 mRNA和蛋白的相對表達量分別為0.314±0.030、3.082±0.247，正常對照組rMC-1細胞中ZnT8 mRNA和蛋白的相對表達量分別為0.385±0.025、3.583±0.256，組間相比，P均<0.01，說明rMC-1細胞中ZnT8 mRNA和蛋白的表達在CoCl2處理后表達下降，在EPO治療后表達升高。

3 討論

鋅是人體內第2豐富的微量元素，并且是維持細胞正常功能的必須元素，在人體代謝中起重要作用，比如酶的合成、胰島素的合成和釋放等，同樣在免疫反應、氧化應激、老化過程中起重要作用。鋅離子豐富表達于視網(wǎng)膜色素上皮、脈絡膜和神經(jīng)視網(wǎng)膜，在視網(wǎng)膜中鋅離子參與維持正常的視覺功能、調節(jié)突觸傳遞和抗氧化應激作用，同時在視網(wǎng)膜生理、病理過程中起重要作用[9]。研究[7]表明，人體鋅離子缺乏會導致的視網(wǎng)膜中抗氧化劑的減少進而導致暗適應的破壞、黃斑變性和白內障等。同時實驗[10]表明，口服補鋅治療對早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變具有保護作用，然而在糖尿病視網(wǎng)膜病變晚期，視網(wǎng)膜缺氧條件下，鋅離子的缺乏或超載，均對視網(wǎng)膜細胞具有毒害作用。同時已有許多研究[11,12]表明，細胞內鋅離子蓄積對神經(jīng)元、膠質細胞和其他細胞有毒害作用。我們實驗也證實了鋅離子蓄積對細胞的毒性作用，即在外源性鋅離子處理后，rMC-1細胞活力下降、細胞凋亡率增加。同時EPO對外源性鋅離子蓄積誘導的細胞毒性具有保護作用，即EPO治療后細胞活力提高、細胞凋亡率顯著減少。

本研究結果表明，低氧環(huán)境下rMC-1細胞內的鋅離子濃度增加，同時缺氧狀態(tài)下細胞內鋅離子蓄積可能對細胞產(chǎn)生毒性作用，因此缺氧狀態(tài)下鋅離子蓄積產(chǎn)生的細胞毒害作用可能為缺氧性視網(wǎng)膜損傷的一個機制。此結果還需進一步實驗驗證。已有研究[3]表明，EPO具有保護缺氧狀態(tài)下視網(wǎng)膜神經(jīng)和血管的作用，EPO可以通過抑制HIF-1α的表達起到抗VEGF的作用、EPO可以通過降低缺氧條件下一些炎癥因子(IL-2、TNF-α等)的表達發(fā)揮視網(wǎng)膜保護作用。EPO及其受體表達于Müller細胞上。為此，我們研究低氧狀態(tài)下EPO對Müller細胞內鋅離子是否有調控作用。我們的研究表明，EPO治療可顯著性減少低氧狀態(tài)下細胞內鋅離子的蓄積，即在低氧狀態(tài)下細胞內鋅離子濃度顯著性增加，在EPO治療后細胞內鋅離子顯著降低。綜上，EPO通過降低缺氧狀態(tài)下鋅離子蓄積產(chǎn)生的細胞毒性作用，可能為EPO保護缺氧性視網(wǎng)膜病變的其中一個機制。

研究[2]表明，細胞內鋅離子穩(wěn)態(tài)是靠鋅離子轉運蛋白及鋅結合蛋白維持的。鋅離子轉運蛋白主要分為ZnT(SLC30A)和ZIP(SLC39A)兩大家族，ZnT的作用為轉運細胞質內的鋅離子到細胞外，ZIP的作用與ZnT正好相反，轉運細胞外或細胞核內的鋅離子到細胞質,這些轉運蛋白在鋅離子的調節(jié)過程中起重要作用。ZnT8廣泛分布于視網(wǎng)膜中，主要表達于視網(wǎng)膜色素上皮細胞和Müller細胞中，其在調節(jié)細胞內鋅離子的動態(tài)平衡中起著重要的作用。ZnT8豐富表達于Müller細胞中，其對鋅離子的調控作用是把鋅離子轉移到細胞外或細胞核中，從而降低胞漿內鋅離子濃度，且已有研究[2]表明低氧狀態(tài)下Müller細胞內ZnT8表達降低。因此，我們檢測EPO對低氧狀態(tài)下ZnT8 mRNA及蛋白水平表達的影響。本研究結果表明，在CoCl2處理后，ZnT8 mRNA及蛋白水平的表達均顯著降低，并且在EPO治療后其表達顯著增加。因此，EPO可以增加低氧狀態(tài)下Müller細胞內ZnT8的表達。

綜上所述，EPO對鋅離子蓄積產(chǎn)生的細胞毒害作用如細胞活力降低、細胞凋亡率增加具有保護作用，EPO可減少低氧狀態(tài)下rMC-1細胞內鋅離子濃度，其機制可能與增加ZnT8表達有關。本細胞研究結果還需動物體內實驗進一步驗證，其它鋅離子轉運體ZnT3、ZnT6、Zip1、Zip2、Zip3等在低氧模型中是否改變及EPO調節(jié)ZnT8的信號通路也需進一步研究。