外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞監(jiān)測(cè)在乳腺癌術(shù)后轉(zhuǎn)移早期診斷中的應(yīng)用

華紅，郝貴亮，王清玲，於晶，解童玲，姚魯璐

(1青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)，山東青島266033；2青島市婦女兒童醫(yī)院)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，我國(guó)每年有近7萬(wàn)人死于此疾病[1,2]。研究表明，30%～40%的早期乳腺癌患者會(huì)發(fā)展為轉(zhuǎn)移性乳腺癌(MBC)，死亡風(fēng)險(xiǎn)極高[3,4]。目前，臨床上除了影像學(xué)診斷外，血清標(biāo)志物中使用最普遍的檢測(cè)指標(biāo)是糖類抗原15-3(CA15-3)和癌胚抗原(CEA)，但此指標(biāo)特異性差、靈敏度不高[5,6]。因此，尋找創(chuàng)傷小、靈敏度高的血清分子標(biāo)志物，對(duì)乳腺癌患者術(shù)后轉(zhuǎn)移的早期診斷具有重要意義。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)是利用現(xiàn)代技術(shù)，在腫瘤患者血液中檢測(cè)到的一種微轉(zhuǎn)移細(xì)胞。它是實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移灶中的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入外周血循環(huán)，在循環(huán)中腫瘤細(xì)胞相互聚集形成的微小癌栓，是乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的重要環(huán)節(jié)[7]。我們猜測(cè)，乳腺癌患者術(shù)后血液中出現(xiàn)CTC的時(shí)間要早于臨床確診轉(zhuǎn)移的時(shí)間。因此，我們對(duì)96例乳腺癌患者術(shù)前至術(shù)后3年內(nèi)外周血CTC的變化進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，并記錄其術(shù)后臨床轉(zhuǎn)移情況，探討監(jiān)測(cè)外周血CTC對(duì)臨床早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌術(shù)后轉(zhuǎn)移的意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年8月～2014年8月我院收治的乳腺癌患者96例作為乳腺癌組，均為女性，年齡25～73歲、中位年齡46.5歲，右側(cè)54例、左側(cè)42例。經(jīng)免疫組織化學(xué)分型：Luminal A型42例、Luminal B型33例、HER-2過(guò)表達(dá)型16例、三陰性型乳腺癌5例。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者病理組織切片證實(shí)原發(fā)性病灶為浸潤(rùn)性乳腺癌；均行乳腺癌改良根治術(shù)治療；術(shù)前均行乳腺超聲及鉬靶檢查；術(shù)前、術(shù)后按本研究隨訪時(shí)間進(jìn)行CTC監(jiān)測(cè)及全身CT、MRI掃描；發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)移灶經(jīng)病理組織學(xué)確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：非原發(fā)性病灶；非經(jīng)過(guò)改良根治術(shù)治療；有嚴(yán)重的并發(fā)癥。將同期在我院確診的乳腺纖維瘤患者30例作為對(duì)照組?；颊呔炇鹬橥鈺?shū)，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器 CK8/18鼠抗人單克隆抗體(美國(guó)CST公司)；人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊锕?；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)；低溫超速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)。

1.3 外周血CTC監(jiān)測(cè)方法

1.3.1 監(jiān)測(cè)時(shí)間 乳腺癌組患者于術(shù)前24 h內(nèi)、術(shù)后每隔3個(gè)月定期監(jiān)測(cè)外周血CTC，截止時(shí)間為術(shù)后檢測(cè)出CTC陽(yáng)性，如未檢測(cè)出陽(yáng)性則隨訪至術(shù)后3年。記錄術(shù)前24 h內(nèi)CTC陽(yáng)性例數(shù)及術(shù)后檢測(cè)到CTC陽(yáng)性的時(shí)間。

1.3.2 外周血CTC檢測(cè)方法

1.3.2.1 標(biāo)本收集 用真空ACD抗凝管抽取乳腺癌組患者術(shù)前24 h內(nèi)及術(shù)后各隨訪時(shí)間(見(jiàn)1.4)獲得的肘靜脈血10 mL，以及對(duì)照組肘靜脈血10 mL，立即輕柔充分混勻抗凝管8次，防止血塊形成，室溫存放，在24 h之內(nèi)行外周血CTC檢測(cè)。

1.3.2.2 富集CTC 采用密度梯度離心法。首先準(zhǔn)確吸取7.5 mL人淋巴細(xì)胞分離液于干凈的試管內(nèi)，取患者7.5 mL全血與等量的Hank′s液混勻，離心后取環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層，向其中加入5 mL Hank′s液，再次離心后，吸取試管底部細(xì)胞沉積，重復(fù)一次后吸取試管底部細(xì)胞。

1.3.2.3 CTC檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)。以CK8/18陽(yáng)性細(xì)胞為CTC待測(cè)細(xì)胞，向其中先加入500 μL預(yù)冷(4 ℃)固定液，室溫下孵育離心后棄上清加入1.5 mL破膜劑，充分混勻后室溫下孵育離心后加入2 mL PBS液，混勻后分成兩管，一管為試驗(yàn)管，一管為陰性對(duì)照管。將試驗(yàn)管加入CK8/18鼠抗人單克隆抗體5 μL，低速混勻，室溫孵育后加入PBS液2 mL，離心后棄去上清液。試驗(yàn)管和對(duì)照管分別加入熒光二抗5 mL，低速混勻，5 min后棄去上清液，再加入1%多聚甲醛0.5 mL，低速混勻后放置4 ℃冰箱避光保存，備上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2.4 CTC陽(yáng)性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 以7.5 mL外周血單核細(xì)胞中CK8/18陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)來(lái)表示外周血 CTC含量，當(dāng)外周血CTC≥5個(gè)/7.5 mL時(shí)判定為陽(yáng)性。

1.4 術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移情況隨訪 對(duì)乳腺癌組患者于術(shù)后的第3個(gè)月起隨訪至術(shù)后3年，每隔3個(gè)月行全身CT及MRI掃描；如發(fā)現(xiàn)外周血CTC呈陽(yáng)性，則調(diào)整為每隔1個(gè)月進(jìn)行全身CT及MRI掃描。發(fā)現(xiàn)影像學(xué)轉(zhuǎn)移后，經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診臨床轉(zhuǎn)移，記錄術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移例數(shù)及部位。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。臨床資料的描述采用百分比，頻數(shù)資料組間的比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組CTC檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 術(shù)前及對(duì)照組CTC檢測(cè)結(jié)果 術(shù)前患者CTC總陽(yáng)性率為43.7%(42/96)，其中Luminal A型、Luminal B型、HER-2過(guò)表達(dá)型、三陰性型患者的CTC陽(yáng)性率分別為33.3%(14/42)、51.5%(17/33)、56.3%(9/16)、40.0%(2/5)；對(duì)照組陽(yáng)性率為0(0/30)。術(shù)前患者CTC總陽(yáng)性率高于對(duì)照組(P<0.01)，各病理分型CTC陽(yáng)性率均高于對(duì)照組(P均<0.01)，不同病理分型的乳腺癌患者CTC陽(yáng)性率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.1.2 乳腺癌組患者術(shù)后CTC監(jiān)測(cè)結(jié)果 術(shù)后第3個(gè)月時(shí)，患者外周血CTC均為陰性。隨訪至3年時(shí)，CTC陽(yáng)性患者為31例。

2.2 術(shù)后腫瘤臨床轉(zhuǎn)移情況 隨訪3年期間，經(jīng)病理組織學(xué)確診發(fā)生臨床轉(zhuǎn)移42例，其中腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例、肺胸膜轉(zhuǎn)移13例、顱腦轉(zhuǎn)移6例、肝轉(zhuǎn)移5例、骨轉(zhuǎn)移7例。

2.3 術(shù)后發(fā)生臨床轉(zhuǎn)移患者的CTC陽(yáng)性率情況 術(shù)后3年內(nèi)，42例發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移患者的外周血CTC總陽(yáng)性率為73.8%(31/42)，其中腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肺胸膜轉(zhuǎn)移、顱腦轉(zhuǎn)移、肝臟轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移患者的CTC陽(yáng)性率分別為81.8%(9/11)、69.2%(9/13)、66.7%(4/6)、100%(5/5)、57.1%(4/7)。各部位轉(zhuǎn)移患者間的CTC陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.4 術(shù)后出現(xiàn)CTC陽(yáng)性至臨床確診轉(zhuǎn)移時(shí)間的分析 31例CTC陽(yáng)性患者中，術(shù)后出現(xiàn)CTC陽(yáng)性至臨床確診轉(zhuǎn)移的時(shí)間，最短為檢測(cè)到CTC陽(yáng)性后第12周、最長(zhǎng)為第44周，其中檢測(cè)到CTC陽(yáng)性后第12周發(fā)現(xiàn)1例、第16周發(fā)現(xiàn)6例、第20周發(fā)現(xiàn)9例、第24周發(fā)現(xiàn)7例、第28周發(fā)現(xiàn)4例、第32周發(fā)現(xiàn)2例、第36周發(fā)現(xiàn)1例、第44周發(fā)現(xiàn)1例，在檢測(cè)到CTC陽(yáng)性后第16～28周有26例CTC陽(yáng)性患者發(fā)生轉(zhuǎn)移，占83.8%，是臨床確診乳腺癌轉(zhuǎn)移的高峰時(shí)段。

3 討論

乳腺癌是一種高度異質(zhì)性腫瘤，其基因異質(zhì)性決定了其復(fù)雜的生物學(xué)行為和臨床病理特點(diǎn)。研究表明，30%～40%的早期乳腺癌患者即使接受了手術(shù)治療，仍會(huì)發(fā)展為MBC，而MBC患者死亡風(fēng)險(xiǎn)極高，治療以緩解臨床癥狀、改善生活質(zhì)量及提高生存率為主。因此，越早發(fā)現(xiàn)乳腺癌術(shù)后轉(zhuǎn)移，可以更及時(shí)有效地選擇合適的治療方案，大大提高患者的生活質(zhì)量及存活率。但是，目前MBC常用的血清學(xué)標(biāo)志物靈敏性和特異性均較低，不能滿足臨床需求。

CTC是利用現(xiàn)代免疫學(xué)和分子分析技術(shù)，在患者血液中能檢測(cè)到的一種微轉(zhuǎn)移細(xì)胞，它是實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移灶中的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入外周血循環(huán)，在循環(huán)中腫瘤細(xì)胞通過(guò)遷移、黏附、相互聚集形成的微小癌栓，是乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的重要環(huán)節(jié)。與淋巴骨髓相比，外周血標(biāo)本具有易獲得、創(chuàng)傷小且可以反復(fù)采集，患者依從性較強(qiáng)，是臨床上常規(guī)檢測(cè)CTC較為理想的標(biāo)本來(lái)源。隨著現(xiàn)代化檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)設(shè)備的不斷發(fā)展進(jìn)步，CTC檢測(cè)方法的敏感性和特異性將不斷提高。本研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)前患者CTC總陽(yáng)性率高于對(duì)照組，表明乳腺癌患者術(shù)前外周血CTC陽(yáng)性明顯增高。

作為一種全身性疾病，在早期就有腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散到全身[8]。盡管早期根治性手術(shù)和手術(shù)后放化療已大大提高了乳腺癌患者的生存期，但仍有大部分患者死于乳腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。1989年，Ashworth等[9]發(fā)現(xiàn)癌癥患者血液中存在CTC，認(rèn)為在乳腺癌早期即有CTC進(jìn)入血液循環(huán)并發(fā)生全身播散[10,11]。CTC的出現(xiàn)是腫瘤患者不良結(jié)果的一個(gè)獨(dú)立預(yù)示指標(biāo)[12,13]。2007版美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)乳腺癌生物學(xué)標(biāo)記物臨床應(yīng)用指南就將CTC列為新的腫瘤標(biāo)志物[14]。Budd等[15]比較了CTC與傳統(tǒng)影像學(xué)檢測(cè)評(píng)估治療結(jié)果的預(yù)測(cè)價(jià)值，發(fā)現(xiàn)影像學(xué)緩解且持續(xù)高水平者與影像學(xué)緩解且CTC低水平者相比，中位總生存期(OS)顯著降低，而影像學(xué)進(jìn)展且CTC低水平者其OS明顯比影像學(xué)進(jìn)展且CTC高水平者長(zhǎng)，認(rèn)為外周血CTC含量的變化對(duì)于MBC的診斷和預(yù)后評(píng)估較影像學(xué)檢測(cè)更敏感。因此，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CTC變化，有利于及時(shí)了解患者病情，并且可為其制定個(gè)體化綜合治療方案提供依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后第3個(gè)月時(shí)，患者血清中CTC均為陰性，CT及MRI均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶；之后則檢測(cè)出CTC陽(yáng)性患者31例，確診臨床轉(zhuǎn)移患者42例，分析從術(shù)后檢測(cè)到CTC陽(yáng)性到臨床病理組織學(xué)確診的時(shí)間，最短為檢測(cè)到CTC陽(yáng)性后第12周、最長(zhǎng)為第44周，表明外周血CTC比影像學(xué)檢查至少可以提前12周預(yù)測(cè)到乳腺癌轉(zhuǎn)移；其中檢測(cè)到CTC陽(yáng)性后的第16～28周，83.8%的患者被確診發(fā)生臨床轉(zhuǎn)移，表明術(shù)后檢測(cè)到CTC陽(yáng)性后的第16～28周是臨床確診乳腺癌轉(zhuǎn)移的高峰時(shí)段。

綜上所述，乳腺癌患者具有較高的外周血CTC陽(yáng)性率，行改良型根治術(shù)后CTC的再次出現(xiàn)是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶形成的表現(xiàn)；乳腺癌外周血CTC檢測(cè)陽(yáng)性時(shí)間明顯早于臨床確診時(shí)間，可以更早地預(yù)測(cè)MBC發(fā)生，對(duì)患者的診治和評(píng)價(jià)預(yù)后具有重要的臨床意義。因此乳腺癌患者外周血CTC監(jiān)測(cè)在乳腺癌患者術(shù)后轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)方面有著良好的應(yīng)用前景。