槐耳清膏對(duì)乳腺癌細(xì)胞microRNA表達(dá)譜的影響

魯明騫，陸海燕，馮雪松，高嫣，李莉娥，李薇，張蓉，孔慶志

(1三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 宜昌市中心人民醫(yī)院，湖北宜昌443000；2宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司；3武漢市中心醫(yī)院 武漢市腫瘤研究所)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，2015年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，女性因乳腺癌而死亡占各種腫瘤死亡的首位[1]。在我國(guó)，乳腺癌發(fā)病率占女性惡性腫瘤的第一位。手術(shù)聯(lián)合放療、化療、內(nèi)分泌、靶向藥物、免疫和中醫(yī)中藥等綜合治療是乳腺癌的主要治療方式，經(jīng)過(guò)規(guī)范的治療，大部分乳腺癌患者是可以治愈的，但部分患者在初診時(shí)即為中晚期，不能完全根治[2]。因此，進(jìn)一步了解乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的藥物和新的靶點(diǎn)，對(duì)提高乳腺癌的治愈率和生存率、改善生活質(zhì)量有重要意義。目前研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(microRNA)與多種惡性腫瘤密切相關(guān)[3～7]，在腫瘤診斷、治療與預(yù)后中發(fā)揮著重要作用。因此，microRNA有可能成為腫瘤診斷、治療和預(yù)后的一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物。既往研究發(fā)現(xiàn)，槐耳清膏在乳腺癌中可發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、降低放化療毒副反應(yīng)、提高乳腺癌術(shù)后化療患者的免疫功能等作用[8～11]，但其機(jī)制尚不明確。2013年5月～2015年8月，我們對(duì)槐耳清膏作用于乳腺癌雌激素受體陽(yáng)性(ER+)的MCF-7細(xì)胞及雌激素受體陰性(ER-)的MDA-MB-231細(xì)胞中microRNA表達(dá)譜的影響進(jìn)行研究，初步探討乳腺癌細(xì)胞中microRNA的表達(dá)譜變化，為研究槐耳清膏治療乳腺癌的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與材料 乳腺癌細(xì)胞(MCF-7及MDA-MB-231)購(gòu)自美國(guó)Amercian Type Culture Collection(ATCC)。PRM-1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；0.25%胰蛋白酶購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜購(gòu)自Amersco公司；TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；熒光素報(bào)告基因檢測(cè)試劑購(gòu)自美國(guó)Promega公司；TaqMan microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、mirVana TmmicroRNA Isolation Kit試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞于5×105/孔平鋪于六孔板中，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h，分別加入濃度為9 mg/mL槐耳清膏(槐耳清膏組)和相同體積的PBS(對(duì)照組)，5% CO2、37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待提取RNA。

1.3 microRNA的篩選 利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法。根據(jù)mirVana TmmicroRNA Isolation Kit試劑盒要求提取兩種細(xì)胞的RNA，分光光度計(jì)測(cè)定260 nm及280 nm的吸收值，評(píng)估RNA的純度和濃度，并采用Agilent Bioanalyzer 2100評(píng)價(jià)總RNA質(zhì)量。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。microRNA測(cè)定由博奧生物技術(shù)有限公司完成。將3次實(shí)驗(yàn)提取的RNA混合，加入100 ng總的RNA去磷酸，用pCp-Cy3標(biāo)記，標(biāo)記后的microRNA與Agilent人類(lèi)microRNA雜交，經(jīng)清洗、掃描，由Feature Extraction10.7軟件提取。用TRIzol提取總的RNA，異丙醇沉淀濃縮RNA，分光光度計(jì)定量。microRNA分離，芯片篩選出乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞中上調(diào)和下調(diào)的microRNA。以熒光信號(hào)強(qiáng)度的比值log2(ratio)<-1或>1為顯著性差異表達(dá)microRNA。

2 結(jié)果

2.1 MCF-7細(xì)胞microRNA表達(dá)譜變化 槐耳清膏作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞后，表達(dá)上調(diào)的有miR-7-5p、miR-21-5p、miR-100-5p、miR-125b-5p、miR-126-3p、miR-328-5p，表達(dá)下調(diào)的有miR-10b-5p、miR-31-5p、miR-127-3p、miR-128-3p、miR-145-5p、miR-146-5p、miR-199a-5p、miR-200b-5p、miR-205-3p、miR-206、miR-210-5p、miR-218-5p、miR-221-3p、miR-326、miR-340-5p、miR-335-5p、miR-345-5p、miR-375、miR-373-3p、miR-451a、miR-520a-3p。miR-7-5p、miR-21-5p、miR-126-3p在MCF-7細(xì)胞系中上調(diào)最明顯。

2.2 MDA-MB-231細(xì)胞microRNA表達(dá)譜變化 槐耳清膏作用于MDA-MB-231細(xì)胞后，表達(dá)上調(diào)的有miR-10b-5p、miR-21-5p和miR-127-3p，表達(dá)下調(diào)的有miR-7-5p、miR-31-5p、miR-100-5p、miR-125b-5p、miR-126-3p、miR-128-3p、miR-145-5p、miR-146-5p、miR-199a-5p、miR-200b-5p、miR-205-3p、miR-206、miR-210-5p、miR-218-5p、miR-221-3p、miR-326、miR-328-5p、miR-340-5p、miR-335-5p、miR-345-5p、miR-375、miR-373-3p、miR-451a、miR-520a-3p。miR-10b-5p、miR-21-5p在MDA-MB-231細(xì)胞系中上調(diào)顯著。

2.3 兩種細(xì)胞中共同變化的microRNA 在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，表達(dá)共同上調(diào)的是miR-21-5p，共同下調(diào)的有miR-31-5p、miR-128-3p、miR-145-5p、miR-146-5p、miR-199a-5p、miR-200b-5p、miR-205-3p、miR-206、miR-210-5p、miR-218-5p、miR-221-3p、miR-326、miR-328-5p、miR-340-5p、miR-335-5p、miR-345-5p、miR-375、miR-373-3p、miR-451a、miR-520a-3p。

3 討論

癌癥的發(fā)生和發(fā)展是多因素參與、多基因改變及多階段發(fā)展的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，其分子調(diào)控機(jī)制目前仍未完全明確。microRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度18～25 nt的非編碼RNA，能影響蛋白質(zhì)的表達(dá)，是一類(lèi)十分重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，參與并調(diào)控人類(lèi)約30%的編碼基因。microRNA具有高度的保守性和器官組織特異性，通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化和凋亡等有一定作用。microRNA是基因調(diào)控中的核心成分，在癌癥發(fā)生中有些具有癌基因作用，可促使腫瘤的發(fā)生；有些則具有抑癌基因的作用，能抑制腫瘤的生長(zhǎng)，同時(shí)也參與癌癥的增殖、浸潤(rùn)、血管生成、凋亡及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等環(huán)節(jié)[12,13]。目前研究發(fā)現(xiàn)2 000多個(gè)microRNA能調(diào)控大約1/3的人類(lèi)基因表達(dá)[14]。隨著基因芯片和高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)以及研究的進(jìn)一步深入，microRNA的特點(diǎn)和功能被進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，不同的腫瘤甚至組織分類(lèi)及分子分型都具有特異相關(guān)的microRNA表達(dá)譜[15,16]。因此可通過(guò)基因芯片和高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用篩選腫瘤特異相關(guān)的microRNA表達(dá)譜，從而為腫瘤的早期診斷及靶向治療提供特異有效的靶點(diǎn)。

劉冬冬等[17]對(duì)乳腺癌患者血清中差異表達(dá)的microRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)篩選出28個(gè)差異性表達(dá)的microRNA，認(rèn)為血清中hsa-miR-374a-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-320a這4種microRNA有可能作為乳腺癌診斷的潛在標(biāo)志物。而Sochor等[18]研究發(fā)現(xiàn)，早期乳腺癌患者治療后血清miR-155、miR-181b、miR-19a、miR-24 的表達(dá)水平下調(diào)，其表達(dá)水平與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)程度及治療效果相關(guān)。對(duì)于三陰性乳腺癌中差異表達(dá)的microRNA表達(dá)譜，Sylwia等[19]認(rèn)為miR-190a、miR-136-5p、miR-126-5p、miR-135b-5p和miR-182-5p可能與三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

槐耳用于治療惡性腫瘤已有1 000多年的歷史，其主要抗癌成分為槐耳蛋白多糖(PS-T)，功能是抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、減少細(xì)胞遷移和侵襲、逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥、提高患者免疫功能和生活質(zhì)量[20,21]。本課題組前期結(jié)果表明，槐耳清膏能抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，降低MCF-7細(xì)胞成瘤能力和細(xì)胞生長(zhǎng)成瘤性，抑制細(xì)胞增殖[22]?；倍甯鄬?duì)乳腺癌細(xì)胞增殖抑制與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性等因素密切相關(guān)，表明槐耳清膏對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制和抗腫瘤機(jī)制有賴于其它諸多基因的相互調(diào)控，是一個(gè)多步驟、多階段的發(fā)展過(guò)程。本研究通過(guò)基因芯片篩查經(jīng)槐耳清膏和PBS處理的乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系中差異表達(dá)的microRNA，發(fā)現(xiàn)槐耳清膏在有效抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的同時(shí)，對(duì)乳腺癌細(xì)胞的microRNA表達(dá)也有影響，使MCF-7細(xì)胞中6個(gè)microRNA表達(dá)上調(diào)，21個(gè)表達(dá)下調(diào)，表達(dá)上調(diào)顯著的microRNA有miR-7-5p、miR-21-5p、miR-126-3p；使MDA-MB-231細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的microRNA有3個(gè)，表達(dá)下調(diào)的有24個(gè)，表達(dá)上調(diào)顯著的有miR-10b-5p和miR-21-5p?；倍甯嘧饔糜谌橄侔┘?xì)胞后，通過(guò)異常表達(dá)的microRNA，直接或間接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到抗腫瘤的作用。

既往研究表明，miR-7-5p和miR-126-3p作為抑癌基因具有抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，槐耳清膏作用于乳腺癌細(xì)胞后，使miR-7-5p表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[23]；而miR-126-3p表達(dá)上調(diào)，其增殖、遷移和侵襲等能力顯著抑制，細(xì)胞凋亡明顯增強(qiáng)[24]，從而達(dá)到抗腫瘤的作用。miR-21-5p和miR-10b-5p在腫瘤組織中呈高表達(dá)[25,26]，具有促癌作用，槐耳清膏作用于乳腺癌細(xì)胞后，其表達(dá)應(yīng)較低。但本研究發(fā)現(xiàn)其表達(dá)仍較高，其機(jī)制可能是在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中，miR-21-5p和miR-10b-5p通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制乳腺癌的作用[27,28]，但機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。因此，miR-7-5p、miR-10b-5p、miR-126-3p與miR-21-5p有可能作為藥物治療乳腺癌潛在的新的靶點(diǎn)，通過(guò)影響乳腺癌細(xì)胞增殖與發(fā)展過(guò)程，并可能作為乳腺癌診斷、治療和預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

綜上所述，槐耳清膏可影響乳腺癌細(xì)胞中microRNA表達(dá)水平，在抑制乳腺癌細(xì)胞增殖過(guò)程中可能通過(guò)microRNA及其調(diào)控的靶基因相關(guān)信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這些差異表達(dá)的microRNA可作為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)，但其具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究明確。