運用生物信息學方法研究四逆湯作用機制的研究進展*

宋 曦,陳 晶,梁麗英,陳 煒

廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院(南寧530023)

四逆湯是漢代張仲景《傷寒論》中所載經方，它由附子、干姜、甘草組成，是治療少陰陽虛陰寒證的主方，具有溫中祛寒、回陽救逆的功效。四逆湯集中體現了中醫(yī)扶陽抑陰、扶正祛邪的治則思想，也因其用藥精煉、效驗卓著，受到歷代眾多醫(yī)家的推崇繼而成為千古名方。

現代臨床中，四逆湯應用廣泛。其中，四逆湯運用于心血管系統(tǒng)疾病效果良好，如運用于心肌梗死可保護心肌細胞，治療心力衰竭可提高心肌收縮力，因此尤為引人矚目[1-3]。除此以外，四逆湯還有廣泛的臨床應用，包括治療急性肝衰竭[4-5]、抗腫瘤[6-7]、抗休克[8-9]等。經過研究者的不懈努力，四逆湯的藥理作用及其作用機制的相關成果頗為豐富，但這些研究成果仍面臨著較大的挑戰(zhàn)。

首先，四逆湯中的君藥附子富含烏頭生物堿，具有心臟毒性，其治療量和中毒量較為接近。中藥組方理論認為四逆湯中的甘草具有解毒增效的作用，但其配伍的科學性及甘草的解毒機制需要現代藥理學的進一步的揭示。其次以四逆湯為代表的中藥組方方劑，具有多成分、多作用靶點的特點，但就目前的藥物作用機制研究結果而言，多數限定于一些信號通路中信號因子的改變，難于在整體上全面的反應四逆湯多成分多作用靶點的特點。在此背景下，對四逆湯這種多成分的組方藥物進行以網絡藥理學為代表的生物信息學的研究分析，成為研究者深入研究中藥組方作用機制的重要策略。以下筆者就近年來關于四逆湯運用網絡藥理學等生物信息分析方法進行分析研究的結果，進行一番綜述。

1通過血清代謝組學結合多元統(tǒng)計分析揭示四逆湯的量效關系及其作用機制四逆湯多年來用于治療心血管疾病[10]。四逆湯組方中的附子富含烏頭生物堿，是附子的主要活性成分，因其毒性作用與治療作用接近，故而治療區(qū)間狹窄。但就四逆湯的組方而言，富含烏頭生物堿的附子實乃君藥，必不可少[11]。且研究也表明，四逆湯保護心肌細胞的作用也有賴于附子的存在[12]。在此情況下，評估四逆湯治療心血管疾病的量效關系就變得迫切而重要了。

為了確定四逆湯的量效關系，Zhou等[13]使用去甲腎上腺素造成SD大鼠心肌梗死模型，后分別給予成模動物高、中、低(四逆湯濃度分別是4.0 g/ml、2.0 g/ml、1.0 g/ml)三個濃度的四逆湯胃飼。動物模型藥物干預完畢后分別收集動物模型的外周血清。對動物模型的外周血清進行四極桿飛行時間質譜聯用超高效液相色譜(Ultraperformance liquid chromatography coupled to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS)。并對因此獲得的代謝組學數據進行包括主成分分析(Principal component analysis,PCA)、偏最小二乘法判別分析(Partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)在內的多元統(tǒng)計分析。結果表明，高劑量組的代謝組學數據更接近于模型組，中劑量組和低劑量組代謝組學數據彼此接近，但低劑量組與正常對照組的代謝組學數據更相近。

隨后對代謝組學數據中確認的潛在生物標記的水平進行方差分析，獲得15個有統(tǒng)計意義的潛在生物標記物。這些潛在生物標記物分別參與氨基酸代謝、葡萄糖代謝、脂質代謝和膽汁酸代謝。其中一些代謝過程已被證實參與了四逆湯保護心肌細胞的過程[14]，但有5類膽汁酸尚屬首次報道，揭示了四逆湯的量效關系，并初步揭示四逆湯治療去甲腎上腺素誘導的心肌梗死的作用機制。

2基于代謝組學和網絡藥理學方法研究四逆湯的藥物作用機制迄今為止，藥學的研究模式已經從以往的單一藥物作用于單一蛋白因子水平，發(fā)展至藥物同時作用于多個蛋白標靶[15-16]。這種研究模式轉變的背景是因為研究者越來越多的認識到，多種疾病其實是在多因素共同作用下產生的。這樣的研究模式的轉變，一方面促使研究者們尋找更多的切合實際的研究、分析方法。另一方面，也引導研究者將目光聚焦于中國傳統(tǒng)醫(yī)學(Traditional Chinese Medicine,TCM)，其內在原因就在于中國傳統(tǒng)醫(yī)學的主要用藥是多種藥物組成的復方方劑，中國傳統(tǒng)醫(yī)學的診療理論著眼于整體的“陰陽平衡”。

在此背景下，以四逆湯為代表的中藥組方方劑理所應當的成為人們研究的對象。Chen等首先就四逆湯及其湯劑中的主要活性成分建立化學結構數據庫，并對其進行詳細的成分注釋。隨后使用阿霉素誘導產生心肌損傷小鼠模型，心肌損傷小鼠模型成模后進行分組，在給予不同的藥物干預，藥物包括四逆湯、四逆湯三個組成藥物的活性成分別組合成的方劑、三種藥物的活性成分的單劑。藥物干預完畢，對各組小鼠的心肌組織處理后進行氣相/液相色譜質譜分析，所獲代謝組數據進行多元統(tǒng)計分析。結合該研究團隊前期的研究結果，Chen等獲得了四逆湯中186種活性成分，及39種四逆湯的蛋白靶標。隨后，對這些藥物活性成分和蛋白靶標進行分子鏈接和網絡藥理學分析，最終獲得四逆湯活性成分與蛋白靶標之間的網絡關系圖。四逆湯的這些蛋白靶標分布于氨基酸代謝、脂質代謝等生物過程，且這些蛋白靶標中已有部分被其他研究者證實參與了四逆湯保護心肌的過程[17]。這個研究結果一方面驗證了四逆湯可保護阿霉素誘導的心肌損傷，更重要的是通過網絡藥理學和代謝組學的結合運用，深入探討了四逆湯保護阿霉素誘導心肌損傷的作用機制，證明了四逆湯組方的科學性可必要性。

運用類似的思路，Chen[18]等對四逆湯的化學組學、血清藥物化學和外源生物代謝組學數據進行了類似的分析研究，從不同側面完善四逆湯藥物作用機制的研究。以血清藥物化學分析為例，研究者通過血清藥物化學分析獲得了四逆湯的48個有效活性成分，接著使用網絡藥理學分析方法獲得這48個有效活性成分的61個潛在蛋白靶標。再使用生物過程和信號通路富集分析(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)獲得這61個潛在蛋白靶標所在的10個生物過程，最終得到四逆湯保護心肌細胞的作用機理[18]。

以上的研究結果表明：網絡藥理學分析成功的關鍵在于藥物活性成分對于特定疾病有清晰的藥物作用，此外也需要對特定疾病的生物靶標有較為深入且全面的了解。在此基礎上，通過網絡藥理學分析，就可將藥物活性成分與疾病的生物靶標鏈接起來，進而分析藥物治療該疾病的作用機制。與四逆湯相關的藥物作用機制研究已進行多年，累積了大量的研究數據，這也是進一步進行網絡藥理學分析的基礎。

3通過數據挖掘和生物信息學分析研究四逆湯的“效-毒網絡”四逆湯作用機制研究的深入，為數據挖掘和生物信息學分析提供了豐富且可靠的數據來源。李志勇等[19]首先從TCM-GeneDIT數據庫中進行數據挖掘，獲得與四逆湯中三個成分(附子、干姜、甘草)相互關聯的基因信息。隨后針對這些關聯基因在Pubmed中進一步進行數據挖掘，獲得確定的基因相互關系，并構建附子、干姜、甘草相互關系的基因生物網絡。接著，使用類似方法進行附子“效-毒網絡”的構建。最后通過篩選共享基因和通路預測的方法，分別預測干姜、甘草調控附子“效-毒網絡”的通路。最終李志勇等認為，干姜和甘草可能通過影響免疫-炎癥反應信號通路、細胞凋亡-自噬信號通路、神經細胞與心肌細胞缺血缺氧保護信號通路等途徑發(fā)揮拮抗附子毒性的作用。盡管這些結果仍需要進一步的實驗驗證，但數據挖掘和生物信息學分析無疑為今后四逆湯的作用機制和毒副作用的研究預測了方向。

吳德坤等[20]則通過文獻檢索的方法，收集四逆湯干預心肌梗死的代謝組學實驗研究，對這些文獻中提及的納入研究的已被證實的代謝產物進行匯總，采用KEGG等生物信息學分析方法，獲得四逆湯干預心肌梗死的代謝產物譜及代謝通路。這些代謝通路同樣涵蓋了糖、蛋白質的最終代謝通路，如三羧酸循環(huán)、氨基酸合成等。研究人員因此認為代謝組學可作為揭示代謝通路的工具，通過選擇適當的生物信息學分析方法，對中醫(yī)藥的作用機制進行預測和發(fā)現。

4總 結多年來，中國傳統(tǒng)醫(yī)學的組方方劑處境尷尬，一方面兩千年的實踐經驗證明其有效性，另一方面研究者們缺乏有效的研究方法和技術手段對其療效和作用機制進行全面的揭示。以四逆湯為例，其回陽救逆的療效顯著，是著名的經方，直至當下，其臨床應用堪稱廣泛。但四逆湯的主要藥物附子富含烏頭生物堿，又被證明具有明確的毒副作用，因此不免為人詬病。

網絡藥理學于2008年提出[15]，主要用于尋找藥物有效成分與靶標蛋白之間的聯系。而代謝組學研究則對于追溯藥物的作用機制有著重要作用，它可以全面展示藥物作用后各器官整體的狀態(tài)。代謝組學研究的興起，與中國傳統(tǒng)醫(yī)學的系統(tǒng)性和完整性有著內在的契合。將網絡藥理學和代謝組學結合，是目前研究中藥組方作用機制的有效策略。隨著這方面研究的進一步拓展，中藥組方的科學性、毒副作用將會得到更加清晰的闡述，也將會使得以四逆湯為代表的中藥組方方劑在臨床的應用更加合理。