補(bǔ)腎活血中藥對成骨細(xì)胞增殖、分化作用的研究進(jìn)展*

李凱明，李玲慧，朱立國，王尚全，謝 瑞，張 清△

1.中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院脊柱二科(北京100102)；2.中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院骨傷綜合科(北京 100102)

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“腎主封藏，受五臟六腑之精而藏之”，腎藏精，精生髓，髓居于骨中，以滋養(yǎng)骨骼。所以骨骼強(qiáng)勁，形體矯健，髓的生成，為“腎主骨”提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，故“腎主骨充髓”。補(bǔ)腎活血方源自《傷科大成》，具有補(bǔ)腎壯骨，活血止痛之功效。通過補(bǔ)腎壯骨以治本，活血化瘀以治標(biāo)，為臨床應(yīng)用中藥治療各類骨退行性疾病提供了科學(xué)依據(jù)。成骨細(xì)胞骨形成與破骨細(xì)胞骨吸收之間的平衡是維持正常骨量的關(guān)鍵，是維持骨代謝正常過程的重要核心細(xì)胞。成骨細(xì)胞在不同階段釋放重要的活性標(biāo)志物，像堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素等及各種細(xì)胞因子，如胰島素樣生長因子(IGF)、腫瘤壞死因子(TNF)、骨鈣蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子β等促進(jìn)新骨形成。同時對破骨細(xì)胞骨吸收的調(diào)控，維持骨的代謝平衡方面起到重要作用[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血方藥在調(diào)控成骨細(xì)胞增殖、分化和功能作用方面具有一定的積極作用。本文將通過細(xì)胞、動物、臨床個體水平三個方面進(jìn)行簡要綜述。

1 細(xì)胞水平研究

1.1 補(bǔ)腎活血中藥對成骨細(xì)胞增殖、分化作用 生物體最重要的生命活動是從細(xì)胞增殖、分化開始的，通過促進(jìn)生物生長、發(fā)育、遺傳和繁殖，完成創(chuàng)傷修復(fù)的基礎(chǔ)生命活動。近年來,大量研究開始從分子生物學(xué)角度出發(fā)，探究中醫(yī)中藥對成骨細(xì)胞(OB)影響的作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血中藥對骨形成和骨折愈合至關(guān)重要。林舉擇等[2]通過分離和培養(yǎng)大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞,采用實驗MTT法觀察成骨細(xì)胞存活和增殖能力，證實補(bǔ)骨脂有效成分在一定程度上對大鼠成骨細(xì)胞的增殖、分化方面具有明顯促進(jìn)作用。王永東等[3]通過觀察發(fā)現(xiàn),不同濃度黃芪水提液ALP活性顯著高于NS對照組(P<0.01)；礦化結(jié)節(jié)計數(shù)亦顯著高于NS對照組(P<0.01)。發(fā)現(xiàn)黃芪有效成分對成骨細(xì)胞體外增殖、分化及成骨能力受藥物濃度的影響較大，并且具有雙向調(diào)節(jié)作用。中藥地龍?zhí)崛∥镏泻休^高活性的促成骨細(xì)胞增殖、分化和基質(zhì)礦化的有效成分。通過對實驗性牙槽骨吸收模型的治療發(fā)現(xiàn)，其可抑制骨吸收，使破骨細(xì)胞數(shù)目減少，骨密度增高，促進(jìn)成骨活動使其修復(fù)重建[4]。舒曉春等[5]通過制備骨碎補(bǔ)總黃酮含藥血清，運用二次酶消化法，從新生SD大鼠顱骨中取得成骨細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其可以引起新生SD大鼠成骨細(xì)胞增殖,促進(jìn)成骨細(xì)胞合成分泌ALP,且能增加成骨細(xì)胞骨鈣素的分泌,促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的形成。牛膝為莧科牛膝屬植物干燥根，有散淤血、消腫痛、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之功效，為臨床常用藥物。研究發(fā)現(xiàn)，牛膝的醇提物及醇提物的乙酸乙酯萃取物脫皮甾酮對成骨樣細(xì)胞UMR106有顯著的促進(jìn)增殖作用[6]。郭輝等[7]綜合運用MTT法，RT-PCR法以及對硝基苯磷酸鹽法，探究葛根素對成骨細(xì)胞的增殖、分化的作用機(jī)制。發(fā)現(xiàn)在不同濃度作用下，葛根素都可以提高成骨細(xì)胞增殖率，增強(qiáng)ALP活性，推動骨保護(hù)素mRNA的功能表達(dá)，從而抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟。

1.2 補(bǔ)腎活血中藥對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞增殖、分化作用 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenehyal stem cells，BMSCs)在組織細(xì)胞修復(fù)過程中扮演著重要角色，可以在不同條件誘導(dǎo)下向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成骨軟細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等方面轉(zhuǎn)化，是一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞[8]?，F(xiàn)代研究表明補(bǔ)腎活血中藥調(diào)控BMSCs向成骨分化的機(jī)制，與《素問·陰陽應(yīng)象大論》提出“腎主骨，生髓”具有相通性。所以臨床上可以通過補(bǔ)腎活血來有效促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化。劉琳等[9]采用密度梯度離心法分離多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MM-BMSC)及正常人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(ND-BMSC)，觀察黃芪多糖對BMSCs增殖與細(xì)胞因子表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)黃芪多糖促BMSCs增殖的作用明顯。為臨床治療MM患者減少其骨質(zhì)破壞提供了一定的實驗依據(jù)。另有相關(guān)研究表明[10]，采用龜板含藥血清對BMSCs進(jìn)行體外干預(yù)，同時使用流式細(xì)胞術(shù)檢測MSCs表面抗原CD44細(xì)胞標(biāo)志,通過免疫化學(xué)染色、Western blotting、原位雜交、RT-PCR等方法，詳細(xì)記錄成骨分化標(biāo)記分子堿性磷酸酶(ALP)、骨橋蛋白(OPN)及VDR陽性表達(dá)及VDR mRNA的表達(dá)情況，從而探究龜板提取物對原代培養(yǎng)的MSCs向成骨分化的作用機(jī)制。發(fā)現(xiàn)龜板提取物誘導(dǎo)MSCs向成骨分化過程可明顯促進(jìn)VDR mRNA的表達(dá)，其機(jī)制可能與VDR的上調(diào)有關(guān)。Li等[11]通過發(fā)現(xiàn)女貞子提取物可以改善BMSCs堿性磷酸酶(ALP)活性，增加礦化結(jié)節(jié)數(shù)目，對BMSCs成骨分化具有重要促進(jìn)作用。鄧展生等[12]對骨碎補(bǔ)的有效成分柚皮甙對BMSCs增殖、分化的影響進(jìn)行實驗研究，發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶(ALP)活性、von kossa鈣結(jié)節(jié)染色與空白對照組比較有明顯差異(P<0.05)。說明柚皮甙能有效促進(jìn)BMSCs增殖、分化，增強(qiáng)堿性磷酸酶的生物活性，從而加速礦化結(jié)節(jié)的形成。張賢等[13]觀察杜仲誘導(dǎo)BMSCs成骨分化過程中Wnt通路相關(guān)信號分子表達(dá)，采用RT-qPCR法測定Wnt信號途徑中Fzd和LRP受體系列、β-catenin、核內(nèi)Wnt調(diào)控靶基因系列及Wnt抑制因子(WIF1)等變化。發(fā)現(xiàn)Wnt信號途徑可能參與了杜仲促BMSCs的成骨分化過程。

2 動物水平研究

目前，研究使用最普遍的實驗動物模型是SD大鼠模型，廣泛用于藥理、毒理、藥效及GLP實驗。通過胎鼠顱骨成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)實驗,觀察補(bǔ)腎活血復(fù)方含藥血清及原藥液在成骨細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化及礦化的作用，從而探究骨代謝的過程。

2.1 補(bǔ)腎活血復(fù)方對SD大鼠成骨細(xì)胞增殖、分化及功能作用 取SD大鼠的顱骨，徹底剝離骨膜等軟組織，對成骨細(xì)胞進(jìn)行分離與培養(yǎng)。觀察補(bǔ)腎活血復(fù)方對成骨細(xì)胞增殖、分化(ALP活性測定)、礦化功能測定。胡冰等[14]用補(bǔ)腎健脾活血方含藥血清對SD大鼠成骨細(xì)胞進(jìn)行治療干預(yù)，發(fā)現(xiàn)其能明顯增加成骨細(xì)胞增殖率和礦化結(jié)節(jié)形成數(shù)，明顯改善骨密度和骨強(qiáng)度的作用，還可改善骨的顯微結(jié)構(gòu)，從而減少骨折的發(fā)生率。并且與含藥血清濃度呈正相關(guān)。鞠大宏等[15]通過原位雜交法檢測左歸丸含藥血清對成骨細(xì)胞OPG、RANKL mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)左歸丸含藥血清可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌OPG，直接抑制RANKL的分泌，降低破骨細(xì)胞活性，從而維持骨骼的生物學(xué)性能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。林煜[16]等從成骨細(xì)胞整合素的功能狀態(tài)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的研究對成骨細(xì)胞黏附的角度切入，探究健骨顆粒含藥血清有效成分對成骨細(xì)胞的意義，實時熒光定量PCR法檢測成骨細(xì)胞纖連蛋白、Ⅰ型膠原、玻連蛋白、黏著斑激酶mRNA的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)健骨顆?？梢哉{(diào)節(jié)成骨細(xì)胞整合素和各種相關(guān)因子。使成骨細(xì)胞進(jìn)入“分泌、黏附增加、功能增強(qiáng)、分裂增殖、分泌增加”的良性循環(huán)，促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成。張榮華等[17]探究補(bǔ)腎活血液對新生SD大鼠成骨細(xì)胞增殖、分化、礦化的作用,分別用MTT法、對硝基苯基磷酸二鈉(PNPP)法、放免分析方法和茜素紅染色法測定細(xì)胞增殖功能、堿性磷酸酶(ALP)活性以及骨鈣素(BGP)含量和礦化結(jié)節(jié)計數(shù)。進(jìn)一步證實了中藥復(fù)方補(bǔ)腎活血液對體外培養(yǎng)的新生SD大鼠成骨細(xì)胞的促進(jìn)作用，可以提高骨量和改善骨質(zhì)量。

2.2 補(bǔ)腎活血復(fù)方對SD大鼠成骨細(xì)胞增殖、分化作用機(jī)理 通過補(bǔ)腎活血復(fù)方對SD大鼠成骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)，可從動物水平探討補(bǔ)腎中藥防治骨質(zhì)退化機(jī)制，不僅能為中醫(yī)“腎主骨髓，其充在骨”理論提供客觀理論依據(jù)，而且能更好地篩選出有效的臨床方藥。多數(shù)補(bǔ)腎活血方劑都是來源于臨床實踐，在此基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)，通過補(bǔ)腎活血方劑的含藥血清或者提取物的干預(yù)，觀察成骨細(xì)胞增殖、分化等指標(biāo)的變化。通常將堿性磷酸酶(ALP)活性、骨鈣素(BGP)含量及礦化結(jié)節(jié)計數(shù)作為重要觀察指標(biāo)，進(jìn)行深入探究成骨細(xì)胞和分子機(jī)制[18]。堿性磷酸酶(ALP)是成骨細(xì)胞產(chǎn)生的一種重要酶蛋白，ALP活性表達(dá)是成骨細(xì)胞增殖、分化能力的特異性指標(biāo)，其活性高低與成骨細(xì)胞分化能力呈明顯的正相關(guān),是評價骨形成的最常見指標(biāo)。骨鈣素可以在一定程度上反映成骨細(xì)胞活動分化狀態(tài)，也是體現(xiàn)成骨細(xì)胞分化作用的重要指標(biāo)。閻德文等[19]通過觀察補(bǔ)腎填精中藥復(fù)方對大鼠BMSCs成骨增殖、分化作用的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其可以增加骨鈣素的分泌含量，推動ALP的表達(dá)活性情況，增強(qiáng)BMSCs向成骨細(xì)胞分化、成熟的能力。礦化結(jié)節(jié)計數(shù)的高表達(dá)作為細(xì)胞分化成熟的最后階段，是成骨功能的形態(tài)表現(xiàn)，是骨形成的重要標(biāo)志。相關(guān)研究[20]通過研究不同濃度(5%、10%、20%)的強(qiáng)骨寶方糖尿病模型鼠含藥血清促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、礦化的影響，進(jìn)一步探討其產(chǎn)生影響的最佳時相與量效。發(fā)現(xiàn)以20%濃度的含藥血清在以灌藥3d 或5d、末次灌胃后1 h取得，對體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的分化及礦化功能促進(jìn)作用最明顯。探究桂皮醛對成骨細(xì)胞增殖及成骨功能的影響與濃度相關(guān)性，通過堿性磷酸酶活性、鈣含量的測定及礦化結(jié)節(jié)的觀察等檢測五種濃度的桂皮醛對成骨細(xì)胞成骨功能的影響。發(fā)現(xiàn)較低濃度(16,8 μg/ml-1)的桂皮醛對成骨的增殖無明顯的抑制作用，對堿性磷酸酶ALP活力、鈣含量以及鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量有明顯的促進(jìn)作用[21]。相關(guān)實驗研究從動物水平分析了補(bǔ)腎活血復(fù)方對成骨細(xì)胞的直接作用，證實其對成骨細(xì)胞的增殖、分化及礦化的促進(jìn)作用，為日后補(bǔ)腎活血復(fù)方更好地應(yīng)用于臨床提供了理論依據(jù)和實驗支持。

3 臨床水平研究

臨床根據(jù)“腎主骨、“肝腎同源”的原理結(jié)合中醫(yī)辨證論治原則選用補(bǔ)腎活血復(fù)方治療骨和骨代謝疾病，主要通過成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間、骨形成和骨吸收方面的作用機(jī)制，多靶點、多環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。后期實驗研究方面，存在有一定的難度，對于其相關(guān)作用機(jī)制，目前尚不能完全明確。

牛維等[22]認(rèn)為補(bǔ)益肝腎及活血化瘀等中藥可提高超氧化物歧化酶(SOD)活性,從而達(dá)到降低骨內(nèi)壓,刺激細(xì)胞代償性增生作用,能改善關(guān)節(jié)軟骨的退行性變。根據(jù)中西醫(yī)結(jié)合治療原則，臨床上對于骨折手術(shù)患者，補(bǔ)腎活血復(fù)方通常作為首選方劑之一，注重藥物用量和配伍原則，達(dá)到補(bǔ)腎壯骨、活血通絡(luò)之效，從而促進(jìn)機(jī)體修復(fù)，加速血液循環(huán)，實現(xiàn)骨折愈合的目的?，F(xiàn)代藥理研究指出，益氣補(bǔ)腎活血方一方面可以有效分泌成骨細(xì)胞生長因子，豐富骨折斷段周圍毛細(xì)血管[23]，使局部血流通暢。另一方面有效改善機(jī)體骨代謝狀態(tài)，提高骨密度，優(yōu)化關(guān)節(jié)功能，完善骨生物力學(xué)指標(biāo)，從而進(jìn)一步促進(jìn)骨折愈合[24]。

4 展望與不足

近年來,補(bǔ)腎活血中藥對成骨細(xì)胞的研究方面已經(jīng)取得了重大進(jìn)展,不少驗方已得到臨床驗證,相關(guān)中藥制劑也已通過國家新藥審批，充分肯定了其對骨關(guān)節(jié)相關(guān)疾病的治療效果。大多數(shù)研究選擇補(bǔ)腎活血中藥，采用體內(nèi)外同步研究的方法，明確了補(bǔ)腎活血方藥對成骨細(xì)胞的增殖、分化作用的相關(guān)機(jī)制，從分子生物學(xué)角度為臨床應(yīng)用中藥預(yù)防和治療骨代謝疾病提供了理論依據(jù)[25]。但是補(bǔ)腎活血中藥對于成骨細(xì)胞領(lǐng)域的研究和應(yīng)用仍存在不少問題亟待解決，筆者認(rèn)為未來應(yīng)加強(qiáng)以下幾個方面的研究：①成骨細(xì)胞取材、培養(yǎng)困難，加之倫理限制，是其在短時間內(nèi)無法很好的解決。②與單味中藥相比，臨床多以補(bǔ)腎活血復(fù)方為主，其作用機(jī)制和有效成分也更為復(fù)雜，今后還需要進(jìn)行深入探究，以期更好地應(yīng)用于治療。③中藥血清制備方面，含藥血清的處理與保存，血清濃度的調(diào)控以及給藥的劑量和次數(shù)等需要統(tǒng)一規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)。④補(bǔ)腎活血中藥產(chǎn)生作用的生物學(xué)機(jī)制和有效成分的具體分析不夠全面。須進(jìn)一步明確調(diào)控機(jī)制，分析中藥有效成分，研究不同細(xì)胞因子和信號通路在中藥調(diào)控成骨細(xì)胞分化中的作用。