精子發(fā)生障礙導(dǎo)致男性不育的基礎(chǔ)研究及其臨床應(yīng)用

李 錚 何祖平 張 鋒 夏術(shù)階 姚晨成 袁青青 田汝輝 朱子玨 智二磊 李 朋

精子發(fā)生障礙導(dǎo)致嚴(yán)重精子畸形與無精子癥，由此引起的不育癥與出生缺陷至少影響500萬家庭。目前人類對生精障礙發(fā)病機制的認(rèn)識有限，僅認(rèn)識到Klinefelter綜合征、Y染色體微缺失、隱睪、腮腺炎性睪丸炎影響精子發(fā)生。由遺傳、環(huán)境、生活方式導(dǎo)致精子發(fā)生障礙的研究，多集中于嚙齒類動物，缺乏對人類精原干細(xì)胞增殖分化的研究，尤其對調(diào)控信號的分子通路所知不多。人類精子發(fā)生障礙研究的重點和難點在于：缺乏基于臨床家系的致病基因研究，缺少充足組織樣本量支持的應(yīng)用研究，尚無精子無創(chuàng)評估技術(shù)和規(guī)范化診療體系。本項目針對生精障礙，建立多學(xué)科研究團隊，指導(dǎo)規(guī)范化樣本收集，深入開展轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究，建立體內(nèi)體外向精子分化的研究模型。以此為基礎(chǔ)，解析精子形成障礙的遺傳學(xué)因素，建立精原干細(xì)胞向精子定向分化新體系，構(gòu)建拉曼評估精子與生精小管無創(chuàng)平臺并將其用于臨床，制訂精子發(fā)生障礙診療路徑與診療新體系。本項目主要創(chuàng)新和研究成果如下。

1 解析精子發(fā)生障礙診療新靶點

精子形成障礙是精子發(fā)生障礙的嚴(yán)重類型之一。精子鞭毛或尾部畸形是導(dǎo)致男性不育的重要原因。精子多發(fā)鞭毛畸形表現(xiàn)為精子斷尾、缺失、卷尾(MMAF)，目前已知DNAH1突變可以解釋其45%的發(fā)病原因。本項目組織多學(xué)科研究團隊，臨床收集MMAF家系，建立我國精子發(fā)生障礙臨床大數(shù)據(jù)庫，探索精子形成障礙導(dǎo)致精子畸形的致病新基因，將多發(fā)鞭毛畸形的病因?qū)W診斷提高到60%以上。分離生精障礙患者的精原干細(xì)胞，揭示3個信號通路與生精障礙密切相關(guān)，發(fā)現(xiàn)396種微RAN(miRNA)參與表觀遺傳調(diào)控。

2 建立精子發(fā)生障礙體外體內(nèi)分化新體系

對于治療精子發(fā)生障礙或預(yù)防出生缺陷，從患者睪丸中獲取干細(xì)胞，經(jīng)體外誘導(dǎo)分化獲取具有受精功能的精子，一直是人類的夢想。本項目從隱睪患者睪丸中獲取干細(xì)胞，經(jīng)視黃酸(RA)與干細(xì)胞生長因子(SCF)等條件培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，分選獲取精子細(xì)胞，在國際上首次報道從隱睪患者的精原干細(xì)胞誘導(dǎo)定向分化為精子細(xì)胞，并證明其有受精潛能。將干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為有生育能力的精子是治療無精子癥的夢想與挑戰(zhàn)。本項目組基于生精障礙睪丸組織庫，建立干細(xì)胞與支持細(xì)胞相互影響研究平臺，致力于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)向雄性生殖細(xì)胞分化，揭示了一系列影響生精細(xì)胞增殖分化的新基因，為精子發(fā)生研究和不育癥治療提供了新的方向。

3 建立無創(chuàng)評估生精小管與精子新技術(shù)

顯微外科取精技術(shù)是近年男性不育治療的里程碑。判斷生精小管是否有精子，以提高取精的成功率，主要依靠術(shù)者的個人經(jīng)驗，目前尚無好的無創(chuàng)評估方法用于臨床。本項目組在國際上首創(chuàng)拉曼光譜無創(chuàng)掃描生精小管與精子技術(shù)，對生精障礙患者的生精小管與不育者的精子進(jìn)行激光掃描，獲取精子發(fā)生障礙者特征性“分子圖譜”。該技術(shù)的靈敏度高達(dá)90%，而判斷生精小管是否有精子的特異度高達(dá)86%，減少盲目地破壞生精小管。該項目研究被同行認(rèn)為是一種無創(chuàng)辨別生精小管的方法，將在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。

4 提出生精障礙診療新路徑

本項目總結(jié)男性不育臨床診療經(jīng)驗，提出男性不育三分法診療體系，建立精索靜脈曲張與Y染色體微缺失篩查體系，對射精管梗阻性無精子癥進(jìn)行激光治療，為男性不育提供診療培訓(xùn)教材、診療指南與共識。在臨床大力推廣顯微男科與微創(chuàng)男科技術(shù)。嚴(yán)重稀少精子的冷凍保存是一個世界性的難題，對于嚴(yán)重少精子癥患者極其重要，成功保存該類患者的精子，將使患者生育健康子代，拯救一個幸福家庭。本項目組潛心研究精子冷凍保存的方法和精子冷凍損傷機制，探索出適合精子冷凍保存的方法，指導(dǎo)臨床建立超細(xì)管凍融稀少精子新體系，為不育癥患者提供了更好的生育力保存方法。

5 成 果

基于以上研究，本研究團隊先后發(fā)表論文20篇，其中在TheAmericanJournalofHumanGenetics、StemCellReports和FertilityandSterility等被SCI收錄的期刊上發(fā)表18篇。影響因子共77.885，被NautureReviewsUrology、Development、HumanReproductionUpdate等期刊他引149次。獲得專利9項，其中發(fā)明專利4項，一種分離人精原干細(xì)胞的方法、液氮熏蒸冷凍及儲運配子一體化裝置、一種稀少精子體外培養(yǎng)液3項發(fā)明專利具有高度指導(dǎo)意義和應(yīng)用價值。主編高等教育教材《生殖系統(tǒng)》；主譯專著《精子細(xì)胞(生成、成熟、受精、再生)》，獲得第28屆華東地區(qū)科技出版社優(yōu)秀科技圖書一等獎；主編《2016中國男科疾病診療指南》(精索靜脈曲張診療專家共識、男性不育相關(guān)Y染色體微缺失篩查指南)、《射精管梗阻與精道內(nèi)鏡技術(shù)專家共識》，為國內(nèi)單位開展此類項目提供了規(guī)范化診療流程。本項目已培養(yǎng)泌尿男科學(xué)術(shù)帶頭人2名，青年長江學(xué)者1名，東方學(xué)者與浦江人才2名，上海領(lǐng)軍人才1人，領(lǐng)軍候選人才1名，碩士、博士研究生20余名，中青年男性生殖醫(yī)學(xué)骨干5名，亞洲男科學(xué)協(xié)會與上海市醫(yī)學(xué)會男科專科分會青年委員1名，并向國內(nèi)其他中心(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院、廣東省人民醫(yī)院等)輸送男科人才5名，取得了良好的社會效益。連續(xù)10年舉辦中國醫(yī)師協(xié)會男科醫(yī)師學(xué)術(shù)年會、上海國際男性健康論壇等國家級繼續(xù)教育學(xué)習(xí)班，建立“顯微外科治療男性不育”培訓(xùn)基地，培養(yǎng)全國各省市進(jìn)修醫(yī)師500余人次，多次在國際和國內(nèi)學(xué)術(shù)會議上作大會發(fā)言。

6 完成單位介紹

上海市第一人民醫(yī)院泌尿外科臨床醫(yī)學(xué)中心總體臨床服務(wù)能力與技術(shù)水平居全國綜合性醫(yī)院領(lǐng)先水平，為國家臨床重點?？?、上海市重中之重學(xué)科。中心近年每年門診診治國內(nèi)外男性不育患者超過2萬人次，完成男性不育顯微外科手術(shù)1 000余臺，有豐富的臨床資源。設(shè)立在上海市第一人民醫(yī)院的上海交通大學(xué)泌尿外科研究所，在上海交通大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)平臺的框架下，成立了男性健康評估中心；作為上海市生殖醫(yī)學(xué)重點實驗室臨床基地，有完備的基礎(chǔ)研究平臺。本項目組申請獲得國家重大課題子課題3項、參與3項，承擔(dān)國家自然科學(xué)基金課題4項，上海申康醫(yī)院發(fā)展中心和上海交通大學(xué)重點項目各1項。

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院設(shè)有干細(xì)胞臨床研究中心與上海市男科學(xué)研究所，在男性生殖領(lǐng)域享有盛譽。

復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院是國內(nèi)婦產(chǎn)科領(lǐng)域醫(yī)教研領(lǐng)先醫(yī)院，近年增設(shè)人類精子庫項目，對男性不育開展多項生殖遺傳研究，受到國內(nèi)外生殖領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。