Klotho 基因在認(rèn)知功能障礙疾病中的臨床意義及進(jìn)展

劉鑫 崔春愛(ài) 黃學(xué)洙

1延邊大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科（吉林延吉133000）；2延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院（吉林延吉133000）

Klotho 基因是一種與衰老相關(guān)的基因，于1997年被發(fā)現(xiàn)于具有衰老表型的小鼠體內(nèi)，由KURO-O 等［1］學(xué)者以古希臘紡織生命之線的命運(yùn)女神—Klotho 命名，簡(jiǎn)稱為KL，當(dāng)腎臟、心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌與代謝系統(tǒng)出現(xiàn)疾病或有癌癥發(fā)生時(shí)，Klotho 基因表達(dá)異常，會(huì)通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮抗衰老作用［2］。隨著對(duì)KL 基因與腦功能關(guān)系的研究越來(lái)越多，發(fā)現(xiàn)外周注射的α-klotho 蛋白片段雖不能通過(guò)血腦屏障，但可誘導(dǎo)N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）蛋白GluN2B 的裂解，增強(qiáng)NMDAR 依賴的突觸可塑性，以調(diào)控神經(jīng)功能［3］。因此，了解KL 在大腦中的作用，對(duì)于幫助改善人類認(rèn)知功能及其調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

術(shù)后認(rèn)知功能障礙（post operative cognitive dysfunction，POCD）是指患者自身認(rèn)知功能良好，但經(jīng)過(guò)麻醉或手術(shù)的患者在后期恢復(fù)階段會(huì)發(fā)生幾天或者幾個(gè)月的認(rèn)知功能障礙，偶見(jiàn)延長(zhǎng)至術(shù)后幾年甚至終身，嚴(yán)重影響了筆者術(shù)后的生存質(zhì)量、職業(yè)及社會(huì)功能［4］。隨著醫(yī)學(xué)科技的不斷進(jìn)步，越來(lái)越多的老年患者接受手術(shù)治療，而老年患者術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率較高，故POCD 的相關(guān)研究得到了麻醉界學(xué)者的關(guān)注。雖然KL 與POCD 相關(guān)性研究鮮有報(bào)道［5］，但是其發(fā)生機(jī)制尚不清楚，因此，了解KL 在大腦中的作用，對(duì)調(diào)控衰老、拮抗氧化應(yīng)激及各種疾病導(dǎo)致的人類認(rèn)知功能障礙以及腦外傷、術(shù)后并發(fā)癥、神經(jīng)退行性疾病的防治具有重要意義。本文就KL 基因的生物學(xué)活性與認(rèn)知功能及神經(jīng)系統(tǒng)之間的相關(guān)性研究作一簡(jiǎn)要綜述。

1 KL 基因的生物學(xué)活性

運(yùn)用小鼠限制性片段，篩選人腎臟cDNA 文庫(kù)結(jié)果表明，人KL 基因cDNA 編碼了一個(gè)含1 012 個(gè)氨基酸殘基的蛋白，與小鼠有86%的同源性。人類及小鼠KL 基因定位于第13 號(hào)染色體（13q12），全長(zhǎng)50 kb，含5 個(gè)外顯子及4 個(gè)內(nèi)含子，可通過(guò)mRNA 選擇性剪切，產(chǎn)生兩種轉(zhuǎn)錄因子，從而合成兩種蛋白，即跨膜型KL 蛋白和分泌型KL 蛋白。

1.1 跨膜型KL（membrane bound Klotho） 屬于I 型單通道跨膜蛋白，存在于細(xì)胞表面，130 kDa，具有非常短的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，沒(méi)有功能結(jié)構(gòu)域。KL 基因可編碼而獲得α-Klotho、β-Klotho、γ-Klotho 等一系列跨膜蛋白，其中α-Klotho 可表達(dá)在大腦等各種器官發(fā)揮多種生物學(xué)功能［6］，其中α-Klotho 目前被認(rèn)為是一種抗衰老蛋白以及血清中的可溶性因子，可在脈絡(luò)叢中表達(dá)，并釋放到腦脊液［7］，可以增加突觸和認(rèn)知功能，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的成熟和衰老等相關(guān)的結(jié)構(gòu)和功能。β-Klotho 是與β-葡萄糖醛酸苷酶相關(guān)的Ⅰ型膜蛋白，主要表達(dá)在肝臟和脂肪組織，參與代謝調(diào)節(jié)、葡萄糖攝取、膽汁酸合成和脂肪酸代謝。近期研究還表明，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21））通過(guò)FGFR1/β-klotho 通路上調(diào)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPARγ），而保護(hù)顱腦損傷后血腦屏障［8］，而γ-Klotho 與人膀胱癌的腫瘤侵襲和進(jìn)展有關(guān)［9］。

跨膜型KL 蛋白主要由腎臟產(chǎn)生，在大腦中表達(dá)在脈絡(luò)叢及神經(jīng)元中［1］，作為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23（fibroblast growth factor 23，F(xiàn)GF23）的共受體，主要由骨原細(xì)胞和成骨細(xì)胞產(chǎn)生和分泌，N 端片段具有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體結(jié)合位點(diǎn)；C 端片段具有KL 蛋白的結(jié)合位點(diǎn)［10］，從而達(dá)到控制礦物質(zhì)離子及維生素D 在體內(nèi)的穩(wěn)定?？缒ば蚄L 蛋白可通過(guò)ADAM10 及ADAM17 金屬蛋白酶，通過(guò)NMDAR 依賴機(jī)制被內(nèi)化，導(dǎo)致神經(jīng)元活性的增強(qiáng)和神經(jīng)保護(hù)［11］；在體外，可通過(guò)胰島素或低濃度鈣離子的刺激促進(jìn)KL 蛋白的脫落。

1.2 可溶型Klotho（soluble klotho，KL） 指跨膜型KL 的降解片段，廣泛存在于血液、尿液和腦脊液中，發(fā)揮內(nèi)分泌功能。血清sKL 水平與維持性血液透析患者心血管疾病的預(yù)后及2 型糖尿病的發(fā)病密切相關(guān)［12］。目前，對(duì)于體內(nèi)KL 蛋白脫落的調(diào)控機(jī)制，尚未知曉。

1.3 分泌型KL（secreted Klotho） 通過(guò)mRNA 選擇性剪切外顯子3 產(chǎn)生的另一種穩(wěn)定的蛋白，重70 kDa，腦組織中的含量是腎臟的十倍。據(jù)研究，分泌型KL 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可在產(chǎn)生跨膜型KL 蛋白的相同器官上表達(dá)；但在記憶缺陷小鼠研究發(fā)現(xiàn)只有大腦可以產(chǎn)生分泌型KL 蛋白，具有抗衰老等神經(jīng)保護(hù)作用［13］。目前，關(guān)于人類KL 功能的大多數(shù)研究都集中在跨膜蛋白及其對(duì)腎臟的保護(hù)作用，但分泌型KL 被認(rèn)為是最主要的RNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并且是人類血清蛋白的主要存在形式［14］，然而分泌型KL 的功能有待于進(jìn)一步揭曉。

2 KL 水平與氧化應(yīng)激

年齡是中風(fēng)發(fā)生和預(yù)后不良的最大獨(dú)立危險(xiǎn)因素，隨著年齡的增長(zhǎng)，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)逐漸增加。大腦的免疫系統(tǒng)可以保護(hù)大腦不受來(lái)自自身物質(zhì)和細(xì)胞自由流入大腦所造成的危害［15］，故也給研究KL 蛋白在大腦中的活動(dòng)及外周組織中KL 對(duì)大腦的作用機(jī)制研究帶來(lái)了難題。隨著對(duì)小鼠的深入研究表明，KL 蛋白的表達(dá)水平與大腦和身體健康程度密切相關(guān)，這也為KL 作為人類健康和疾病的標(biāo)志物研究提供了依據(jù)。人體血清中KL 水平與慢性應(yīng)激、雙相情感障礙（bipolar disorder，BP）等心理功能疾病有關(guān)［16-17］；KL 通過(guò)抑制腎缺血再灌注腎組織損傷的氧化應(yīng)激，保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞［18］；也可通過(guò)上調(diào)KL 水平，保護(hù)腦缺血導(dǎo)致的小鼠腦組織損傷［19］。SHARDELL 等［20］對(duì)833 例55 歲及以上年齡的志愿者檢測(cè)結(jié)果表明，血漿KL濃度高于669 pg/mL（中位數(shù)）的參與者平均年齡較小，簡(jiǎn)易神經(jīng)狀態(tài)檢查（MMSE）測(cè)量的認(rèn)知評(píng)估得分較高，MMSE 在數(shù)年后顯著下降的風(fēng)險(xiǎn)也越低，平均下降幅度也越??；較低KL 濃度的參與者以女性為主，與之前研究結(jié)果相符合，表明大腦中低水平的KL 與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，而高水平的KL 有利于提高人類認(rèn)知功能，保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的健康。KL 蛋白可通過(guò)激活抗氧化酶系統(tǒng)，從而抑制海馬中淀粉樣蛋白的沉積，并且保護(hù)海馬神經(jīng)元受谷氨酸的毒性刺激。

此外，ZELDICH 等［21］還證實(shí)，分泌性KL 對(duì)暴露于谷氨酸和β-淀粉樣蛋白的海馬神經(jīng)元具有神經(jīng)保護(hù)作用。最近的研究也已證實(shí)，KL 被可溶性淀粉樣前體蛋白激活，并與其相結(jié)合，保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受淀粉樣蛋白的神經(jīng)毒性作用。最近研究報(bào)道［22］，KL 可以抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）的活性，減少炎性細(xì)胞因子TWEAK、TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞黏附分子表達(dá)以及TGF-β誘導(dǎo)的腎纖維化，提示KL 與NF-κB p65 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，但其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

3 KL 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)

KL 基因共含有400 多個(gè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide Polymorphisms，SNPs），其中G395A 多態(tài)性影響了KL啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。60 歲以下的人群沒(méi)有表現(xiàn)出此多態(tài)性對(duì)認(rèn)知功能的影響；但60 歲以上的會(huì)表現(xiàn)出較強(qiáng)的認(rèn)知功能影響，且MMSE 得分更高；對(duì)90 歲以上的人群進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)G395A 多態(tài)性的認(rèn)知功能受損較少，同時(shí)MMSE 評(píng)分也較高［23］。通過(guò)檢測(cè)，研究人員發(fā)現(xiàn)KLVS 多態(tài)性是6個(gè)SNPs的集合，而6個(gè)SNPs處于完全連鎖不平衡。最初KL-VS 雜合子個(gè)體在預(yù)期壽命期間均表現(xiàn)出更好的認(rèn)知功能［24］，部分原因是因?yàn)榍邦~葉背外側(cè)的皮質(zhì)體積增加［25］。然而，當(dāng)使用年齡更大的受試群體時(shí)，卻并未發(fā)現(xiàn)這種關(guān)聯(lián)性，甚至KL-VS 會(huì)在男性癡呆患者或更嚴(yán)重的精神分裂癥患者中出現(xiàn)。這表明KL 對(duì)認(rèn)知的積極影響可能會(huì)受到時(shí)間、性別或其他與年齡相關(guān)疾病因素的限制，而這些因素及原因尚未闡明，均說(shuō)明了KL 的多態(tài)性可能會(huì)改變大腦功能。

KL 在大腦中由脈絡(luò)叢室管膜細(xì)胞、浦肯野細(xì)胞、海馬神經(jīng)元大量產(chǎn)生，也可在腦白質(zhì)中檢測(cè)到［26］。脈絡(luò)叢是維持血腦屏障的重要結(jié)構(gòu)，其基因表達(dá)譜顯示更接近于腎臟組織，這也增加了KL 在脈絡(luò)叢中發(fā)揮作用的可能性。在脈絡(luò)叢中，KL 與Na 離子/K 離子-ATP 酶相互作用，從而調(diào)節(jié)Ca 離子穩(wěn)態(tài)［27］。雖然KL 缺乏的小鼠腦脊液Ca 離子濃度變低，但并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的腦脊液功能變化。KL 可能對(duì)脈絡(luò)叢保持離子穩(wěn)態(tài)具有影響，但脈絡(luò)叢和小腦仍未被充分研究，具有較深的研究?jī)r(jià)值。前期研究表明，被敲除Klotho 基因的小鼠早期就表現(xiàn)出海馬突觸數(shù)量減少、軸突運(yùn)輸障礙和海馬神經(jīng)元變形、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡標(biāo)志物增加，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，出現(xiàn)認(rèn)知障礙［2］，并在8～12 周內(nèi)死亡。相比之下過(guò)度表達(dá)KL 基因的小鼠具有明顯更好的認(rèn)知功能和記憶功能。近期研究也證實(shí)，KL 過(guò)度表達(dá)可以延長(zhǎng)壽命之外，還可增強(qiáng)海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶功能，防止與衰老相關(guān)的認(rèn)知能力下降［28-29］。DUBAL［29］等人證實(shí)，KL 可刺激GluN2B-NMDA 受體，從而使小鼠獲得更好的認(rèn)知功能和記憶功能。此外，KL 升高導(dǎo)致依賴NMDA 受體的基因增加，如Fos，這些基因增強(qiáng)了長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效果，與學(xué)習(xí)和記憶功能有關(guān)。

雖然下丘腦-垂體-腎上腺（the hypothalamic-pituitaryadrenal axis，HPA）的中樞神經(jīng)系統(tǒng)成分不表達(dá)KL［30］，但KL 缺陷小鼠卻表現(xiàn)出HPA 功能障礙，表現(xiàn)為生長(zhǎng)遲緩、性腺萎縮和不孕癥。性腺萎縮和不育并不是由性器官中的KL 表達(dá)缺乏引起的，而是垂體產(chǎn)生性成熟所需的關(guān)鍵激素不足所造成。MISRAHI［31］指出成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1（fibroblast growth factor receptor 1，F(xiàn)GFR1）是酪氨酸激酶受體，負(fù)責(zé)GnRH 神經(jīng)元系統(tǒng)的形成，表明FGF21/FGFR1/Klotho B（KLB）信號(hào)通路介導(dǎo)對(duì)饑餓和其他代謝應(yīng)激的反應(yīng)。當(dāng)前研究KL 會(huì)影響人類的認(rèn)知功能，但其調(diào)控機(jī)制仍無(wú)法知曉。因此，目前主要研究關(guān)注點(diǎn)放在KL 在大腦的定位，從而幫助研究KL 的調(diào)控機(jī)制。

4 KL 與多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）

通過(guò)采集復(fù)發(fā)緩解型MS（relapsing-remitting multiple sclerosis，RRMS）患者和正常人群的腦脊液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示RRMS 組腦脊液KL 含量明顯低于對(duì)照組，此外KL濃度與擴(kuò)充致殘量表評(píng)分呈明顯負(fù)相關(guān)，而KL 濃度與腦脊液中鐵還原抗氧化能力（ferric reducing anti-oxidant power，F(xiàn)RAP）測(cè)定呈顯著正相關(guān)［32］。多巴胺能神經(jīng)元對(duì)于衰老過(guò)程特別敏感，是大多數(shù)神經(jīng)退行性疾病發(fā)展過(guò)程中喪失的關(guān)鍵細(xì)胞群［33］。隨著年齡的增長(zhǎng)，KL 表達(dá)缺陷的小鼠表現(xiàn)出多巴胺能神經(jīng)元及其神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的選擇性喪失，可通過(guò)降低維生素D 的水平而改善。在神經(jīng)退行性疾病模型中顯示出，當(dāng)KL 增加時(shí)，多巴胺能神經(jīng)元的喪失、運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能均得到保護(hù)［34-35］。然而RRMS 患者血清KL 濃度卻較正常人群高，尤其是病程較長(zhǎng)患者，或許是對(duì)神經(jīng)再生或維生素D 的一種補(bǔ)償反應(yīng)?？缒Ｐ蚄L 被裂解釋放到血液，從而維持維生素D-FGF23-KL 蛋白內(nèi)分泌軸，以補(bǔ)償MS 患者維生素D 水平不足。

5 KL 與術(shù)后認(rèn)知功能障礙

術(shù)后認(rèn)知功能障礙是指接受全麻下手術(shù)的患者，在術(shù)后出現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的并發(fā)癥，表現(xiàn)出不同程度認(rèn)知上的障礙。通常在麻醉與手術(shù)之后具有記憶受損、人格改變、精神焦慮、語(yǔ)言表達(dá)能力減退等表現(xiàn)。這些癥狀與AD患者的前期癥狀相似。

本課題組的前期研究表明，七氟烷麻醉以及手術(shù)均對(duì)成年SD 大鼠早期認(rèn)知功能產(chǎn)生一定的影響，而對(duì)遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力沒(méi)有或者影響甚微，POCD 與大鼠血清KL 蛋白變化存在一定的相關(guān)性［36］。小劑量丙泊酚對(duì)成年大鼠KL蛋白和認(rèn)知功能無(wú)影響；大劑量丙泊酚會(huì)引起成年大鼠麻醉后第1 天Klotho 蛋白明顯下降，同時(shí)引起認(rèn)知功能障礙，遠(yuǎn)期則無(wú)影響；POCD 的發(fā)生可能與Klotho 蛋白含量的降低有關(guān)［5］。腹腔鏡下膽囊切除術(shù)的患者30 例，有10 例在術(shù)后第1 天發(fā)生POCD，其POCD 發(fā)生率為33.3%；與術(shù)前基礎(chǔ)值相比較，術(shù)后第1 天MMSE 評(píng)分下降（P＜0.05）［5］。前期研究發(fā)現(xiàn)KL 與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的POCD 密切相關(guān)［5］，KL 通過(guò)降低NF-κBp65 活性抑制炎性介質(zhì)的釋放，且KL顯著抑制巨噬細(xì)胞聚集，進(jìn)而減少誘發(fā)活性氧相關(guān)酶，如iNOS、NOS，從而減少氧化應(yīng)激，拮抗POCD 的發(fā)展。因此，可以通過(guò)探討Klotho 對(duì)腦內(nèi)免疫細(xì)胞及巨噬細(xì)胞侵潤(rùn)的信號(hào)通路調(diào)控，闡明KL 與POCD 的相關(guān)性，將為POCD 的發(fā)生機(jī)制提供新的思路。

6 問(wèn)題與展望

許多研究都已經(jīng)證明，KL 在大腦中高度表達(dá)，具有改善認(rèn)知功能及神經(jīng)保護(hù)作用，同時(shí)KL 在神經(jīng)元活動(dòng)中起到了至關(guān)重要的作用。

從臨床角度看，盡管仍然不確定KL 抑制衰老的機(jī)制，但通過(guò)刺激內(nèi)源性KL 的產(chǎn)生來(lái)提高KL 水平或運(yùn)用外源性KL 蛋白片段誘導(dǎo)并增強(qiáng)NMDA 依賴性突觸可塑性［37］，或許是減緩衰老過(guò)程，預(yù)防年齡相關(guān)疾病發(fā)生的潛在治療靶點(diǎn)；盡管已經(jīng)有研究證實(shí)POCD 的發(fā)生可能與KL 蛋白有關(guān)，然而KL 蛋白所調(diào)節(jié)的信號(hào)通路及其分子機(jī)制尚未可知，可以成為未來(lái)研究方向，從而為POCD 的防治提供理論依據(jù)；KL 的水平或許可以用作判斷認(rèn)知功能及神經(jīng)退行性程度的生物標(biāo)志物，而這也為一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了新的思路。