環(huán)狀RNA 在皮膚相關疾病中的研究進展

張琛 戴鈺 周美娟

南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學學院放射醫(yī)學系（廣州510080）

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一種在真核和原核細胞中廣泛表達的以共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)為特征的非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA），因缺乏5′和3′游離末端故不易被核酸外切酶R（Ribonuclease R，RNasa R）降解；此外，多數(shù)circRNA 在不同物種間具有高度的保守性。1979年，HSU 首次在真核細胞中證實circRNA 的存在［1］，但circRNA 最近幾年才從RNA 數(shù)據(jù)庫中被重新發(fā)掘出來。

circRNA 是一大類有調(diào)節(jié)功能的ncRNA，包括三種類型：外顯子環(huán)狀RNA（exonic circRNA，ecircRNA）、外顯子-內(nèi)含子環(huán)狀RNA（exonic-intronic circRNA，EIcircRNA）以及內(nèi)含子環(huán)狀RNA（circular intronic RNA，ciRNA）。真核細胞中circRNA 主要由前體mRNA 反向剪接形成，其形成主要通過四條途徑：（1）剪接體依賴性環(huán)化；（2）內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化；（3）套索驅(qū)動環(huán)化；（4）蛋白因子相關性環(huán)化［2］。circRNA 主要發(fā)揮以下功能：作為miRNA 海綿、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、編碼蛋白質(zhì)、產(chǎn)生circRNA 衍生的假基因以及影響可變剪切。circRNA 在皮膚相關疾病中主要是行使miRNA 海綿的作用，如：黑色素瘤中增加的hsa_circ_0084043 通過海綿吸附miR_153_3p 來促進Snail 的表達從而增加其惡性程度［3］；皮膚創(chuàng)傷中增加的circ_Amotl1 海綿吸附miR_17_5p 導致其靶基因Stat3、Dnmt3a 以及fibronectin 的表達增加從而加速創(chuàng)傷愈合［4］；亞砷酸鹽處理的人永生化表皮細胞中增加的hsa_circ_100284 作為hsa_miR_217海綿，上調(diào)miR_217 的靶基因EZH2 的水平導致細胞周期加速并引起惡變［5］，降低的hsa_circ_008913 通過海綿吸附hsa_miR_889 從而間接下調(diào)其靶基因DAB2IP，導致ZEB1 表達增加引起HaCaT 干細胞樣功能獲取從而引起惡變［6］等。

1 circRNA 在皮膚相關疾病中的作用

circRNA 在機體代謝及疾病發(fā)展中發(fā)揮重要作用，比如衰老、胰島素分泌、組織生長、動脈粥樣硬化，高血壓以及肺癌等［7］。越來越多的證據(jù)表明circRNA 在皮膚相關疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。

1.1 circRNA 和皮膚腫瘤

1.1.1 circRNA 和皮膚鱗癌 皮膚鱗狀細胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）是一種惡性的皮膚上皮腫瘤，約20%的病例會發(fā)生轉(zhuǎn)移，其五年生存率約為25%～50%。研究表明：circRNA 和miRNA 參與cSCC 發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子病理學機制中。SAND 等［8］通過基因微陣列研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚鱗癌中，共有322 種circRNAs 差異表達（143 種表達上調(diào)，179 種下調(diào)）。其中上調(diào)最明顯的兩種circRNAs分別是hsa_circ_0070933 和hsa_circ_0070934，均由La 核糖核蛋白域家族成員1B（LARP1B）剪切形成，La 核糖核蛋白域家族成員1（LARP1）與3000 種癌癥通路的mRNA 結(jié)合促進癌癥進程［9］。其他上調(diào)的circRNAs，比如hsa_circ_0032704，由微管蛋白酪氨酸連接酶樣家族成員5（TTLL5）剪切形成，TTLL5 為子宮內(nèi)膜癌中的腫瘤抑制子，可以減緩卵巢癌細胞系的生長；hsa_circ_0009065 是由雙官能凋亡調(diào)節(jié)子（BFAR）剪切形成，已經(jīng)證實BFAR 在結(jié)直腸癌組織中顯著高表達；hsa_circ_0074817 由與惡性血液疾病相關的早B 細胞因子1（EBF1）剪切形成。在下調(diào)的circRNAs 中，下調(diào)最明顯的hsa_circ_0022392 和hsa_circ_0022383 都是由脂肪酸去飽和酶2（FADS2）剪切形成，F(xiàn)ADS2 位于熱點癌基因11q13 上，并且已被證明在乳腺癌中高表達［8］。目前關于皮膚鱗癌中circRNA 的研究僅此一篇且僅限于基因微陣列層面，circRNA 在cSCC 中究竟發(fā)揮何種作用還需進一步研究證實。

1.1.2 惡性黑色素瘤 惡性黑色素瘤是一種起源于生黑色素細胞的癌癥，是導致皮膚癌癥相關性死亡的主要原因之一。LUAN 等［3］通過circRNA 微陣列技術分析了33 例惡性黑色素瘤組織和人表皮黑色素細胞中circRNA 的表達情況，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0084043 在黑色素瘤組織以及人黑色素瘤細胞系（A375、SK_MEL_1、SK_MEL_5 以及A875）中呈現(xiàn)高表達。hsa_circ_0084043 和黑色素瘤臨床分期顯著相關，但和年齡、性別、家族史以及潰瘍無關。作為黑色素瘤的獨立危險因素之一，hsa_circ _0084043 高表達組生存率更低。在分析circRNA_0084043 功能的研究中，發(fā)現(xiàn)在臨床樣本中hsa_circ_0084043 和Snail mRNA 水平呈正相關。在A375 和A875 細胞中，通過沉默或過表達hsa_circ_0084043，證實其在黑色素瘤中是通過海綿吸附miR_153_3p 來促進Snail 的表達。同時采用CCK-8 實驗、劃痕實驗以及侵襲遷移小室實驗證明下調(diào)hsa_circ_0084043 的表達能顯著地抑制黑色素瘤細胞的增殖、侵襲能力以及裸鼠皮下成瘤的能力。這些結(jié)果表明circRNA_0084043 在體內(nèi)外增加了黑色素瘤的惡性程度。

HANNIFORD 等［10］對黑素細胞和黑素瘤細胞系RNAseq數(shù)據(jù)的分析提示黑素瘤細胞中circRNA_CDR1as表達缺失，RT-qPCR 證實黑素瘤細胞系和組織中circRNA_CDR1as低表達。統(tǒng)計學分析顯示circRNA_CDR1as 表達的缺失與黑色素瘤轉(zhuǎn)移以及較差的預后相關。他們用黑素瘤細胞系證實：CDR1as 的缺失增強了黑色素瘤細胞的體外侵襲能力和體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移能力。在circRNA_CDR1as 下游基因的研究方面，circRNA_CDR1as 缺失在黑色素瘤里面不是通過miR_7 發(fā)揮作用，而是通過降低參與氧化磷酸化（OXPHOS）和線粒體功能的蛋白質(zhì)的表達來實現(xiàn)的，這些結(jié)果表明circRNA_CDR1as 缺失可能是通過改變黑素瘤細胞的代謝來發(fā)揮生物學功能。

1.1.3 基底細胞癌 基底細胞癌（basal cell carcinoma，BCC）是來源于皮膚或附件基底細胞的一種中度惡性腫瘤，進展緩慢，呈局部浸潤生長。SAND 等［11］通過circRNA 微陣列分析發(fā)現(xiàn)在基底細胞癌中有23 種circRNAs顯著上調(diào)，48 種circRNAs 顯著下調(diào)。發(fā)現(xiàn)circRNA 和MREs的配對如下：hsa_circ_0022392/hsa_circ_0005085 和hsa_miR_93、hsa_circ_0004777 和hsa_miR_301、hsa_circ_0008732 和hsa_miR_19b_1、hsa_circ_0005912 和hsa _miR_196、hsa_circ_0022392 和hsa_miR_181a_2（hsa_miR_181c/hsa_miR_181d）、hsa_circ_0008732 和hsa_miR_130b、hsa_circ_0005085和hsa_miR_106b、hsa_circ_0086419和hsa_miR_100、hsa_circ_0015449 和hsa_miR _145 、hsa_circ_0075828和hsa_miR_1224 以及hsa_circ_0086419 和hsa_miR_3196。上述差異表達的circRNAs 的線性轉(zhuǎn)錄本在多種癌癥中被證實具有相應的生物學功能，例如上調(diào)處于第三位的circRNA— hsa_circ_0008732 和hsa_circ_0086419 由鋅指蛋白BNC2 剪切形成，BNC2 是卵巢上皮癌的易感基因，與多形性惡性角質(zhì)細胞瘤以及食管上皮細胞腫瘤顯著相關，也是介導持續(xù)性皮膚著色的候選基因［12］。Hsa_circ_0001370 由YEATS2 基因編碼，YEATS2 在軟骨肉瘤中表達異常［13］。hsa_circ_0005795 由LPXN 基因剪切形成，LPXN 編碼前列腺癌細胞中屬于盤尼西林蛋白家族的一種黏著斑蛋白，有報道證實這種黏著斑蛋白在前列腺癌的一個亞型中表達升高。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因SOX13 剪切出hsa_circ_0004777，在少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達上調(diào)［14］。hsa_circ_0080189 由TNS3 剪切形成，TNS3 是一種和多種惡性腫瘤相關的腫瘤蛋白，高分化肺癌、多囊性間皮瘤、乳腺癌、腎透明細胞癌以及黑色素瘤等的發(fā)生發(fā)展都與其相關［15］。兩個下調(diào)最明顯的circRNA—hsa_circ_0022383和hsa_circ_0022392，均由FADS2 剪切而來，已有報道顯示FADS2在胰腺癌中差異表達［16］。hsa_circ_0005085是由ArfGAP 的SH3區(qū)的ASAP2編碼，ASAP2在腎透明細胞癌中表達下調(diào)［17］。hsa_circ_ 0072386、hsa_circ_0072387、hsa_circ_0072389 以及hsa_circ_0088621 均由HMGCS1 剪切形成，四種circRNAs 在基底細胞癌中均表現(xiàn)為下調(diào)。有趣的是，有五種上調(diào)和三種下調(diào)的miRNAs 與上調(diào)前十位的circRNAs 的miRNA 結(jié)合位點一致，有四種上調(diào)和一種下調(diào)的miRNAs 與下調(diào)前十位的circRNAs 的miRANs 結(jié)合位點一致。其中多數(shù)miRNAs 來自miRNA 腫瘤基因簇—oncomiR_1簇（包含hsa_miR_17、hsa_miR_18a、hsa_miR_19a、hsa_miR_19b_1、hsa_miR_20a 以及hsa_miR_92），它們具有增強細胞增殖和抑制凋亡的功能［18］。OncomiR_1 簇家族成員在基底細胞癌中也是過表達的，有研究表明這些miRNAs 參與基底細胞癌的分子發(fā)病機制［19］。但是該研究結(jié)果為描述性的并且數(shù)據(jù)來源樣本較少，還需要大樣本量的深入的機制研究來探索circRNA 在基底細胞癌中所發(fā)揮的作用［11］。

1.2 circRNA 和自身免疫性皮膚病

1.2.1 circRNA 和銀屑病 銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，病程較長，有易復發(fā)傾向，臨床表現(xiàn)以紅斑、鱗屑為主。銀屑病可能的病因包括遺傳因素、感染、免疫異常以及內(nèi)分泌因素等，目前具體的發(fā)病機制尚未明確，T 細胞以及免疫活性分子介導的炎癥反應可能在其中扮演重要的角色。QIAO 等［20］研究發(fā)現(xiàn)：在銀屑病中共有4 956 種circRNAs 差異表達，其中3 016 種表達上調(diào)，1 940 種表達下調(diào)，并識別出4 405 種circRNAs 含有miRNA 反應元件，即推斷它們可通過ceRNA 機制發(fā)揮調(diào)節(jié)miRNA 的作用。在所有差異表達的circRNA 中，hsa_circ_0061012 上調(diào)最顯著，它包含的五種miRNAs 結(jié)合位點對應的miRNAs 分別是hsa_miR_7157_5p、hsa_miR_miR_4769_3p、hsa_miR_6817_5p、hsa_miR_4310 以及hsa_miR_6882_3p。用基因本體論分析（GO 分析）5 種miRNAs 的靶基因，最高的30 項富集分析結(jié)果多數(shù)是與銀屑病相關的，如：T 細胞的分選，對白介素4（IL4）的反應，以及NF_κB 轉(zhuǎn)運到核內(nèi)的調(diào)節(jié)。說明hsa_circ_0061012 的異常表達可能參與到銀屑病的發(fā)病機理中，然而詳細的調(diào)節(jié)機制仍需要進一步的研究。

1.2.2 circRNA 和系統(tǒng)性紅斑狼瘡 系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種多發(fā)于青年女性的累計多臟器的自身免疫性炎癥性結(jié)締組織病，患病率約為0.2‰～1.5‰。研究表明遺傳因素、內(nèi)分泌、感染和環(huán)境因素均會促進SLE 的發(fā)展，但是具體發(fā)病機制尚未明確［21］。ZHANG 等［22］通過circRNA 微陣列的方式檢測到SLE 病人血清中112 種circRNAs 是異常表達的，其中53 種上調(diào)，59 種下調(diào)，并在SLE 患者血漿和外周血單核細胞（PBMC）驗證了hsa_circRNA_407176 和hsa_circRNA_001308 的表達下調(diào)。因此可見circRNA 對SLE 有潛在診斷價值。此外，此項研究還發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA_001308 的表達與血漿中的CRP 和抗SSA 以及PBMC 中的白細胞減少相關；hsa_circRNA_406567 與血漿中的抗RNP 相關，表明hsa_circ_ 001308 和hsa_circ_406567 可能是預測SLE 中全身炎癥或疾病嚴重程度的潛在生物標志物。LI 等［23］也對6 組SLE 患者和正常人血漿中circRNA 表達譜進行分析，發(fā)現(xiàn)207種circRNAs差異表達，其中113種上調(diào)，94種下調(diào)。從中挑選了8 種circRNAs 在另外24 組SLE 患者和正常人中來進一步驗證，最終確認了4 種與微陣列結(jié)果一致的circRNAs：顯著上調(diào)的為hsa_circ_102584、hsa_circ_400011、hsa_circ_101471，顯著下調(diào)的為hsa_circ_100226。兩個研究樣本來源、樣本量大小不同以及前者驗證了circRNA 在PBMC 中的表達情況導致結(jié)果的差異。但是兩者的研究僅是基于小樣本的circRNA 微陣列的結(jié)果，更大樣本量以及深入的機制研究亟待開展。

1.3 circRNA 和皮膚創(chuàng)傷愈合 YANG 等［4］近期研究發(fā)現(xiàn)circ_Amotl1 在小鼠皮膚切口模型中有加速創(chuàng)傷愈合的作用。異常表達的circ_Amotl1 增加了STAT3 和Dnmt3a 的蛋白表達水平，表達增加的Dnmt3a使miR_17的啟動子區(qū)域甲基化，從而降低miR_17_5p 的水平，但其增加了纖連蛋白fibronectin 的表達。隨后他們證實STAT3、Dnmt3a 以及fibronectin 均為miR_17_5p 的靶基因，降低miR_17_5p 會增加以上三者的表達進而導致細胞粘附、遷移、增殖、存活以及傷口修復能力的增加。關于皮膚損傷和circRNA 相互關系的文獻報道目前非常少，筆者的研究主要關注UVB 所致的皮膚損傷，已篩選出部分差異表達的circRNA，目前正在開展相應的機制研究。

1.4 circRNA 和重金屬導致的皮膚病變 砷是已知的致癌物質(zhì)，致癌機制尚不明確。LIU 等［6］通分析亞砷酸鹽處理的人永生化表皮細胞（T-HaCaT）中差異表達的circRNA并選取上調(diào)最為明顯的hsa_circ_100284 來分析其對細胞周期的影響。最終研究表明，在HaCaT 細胞中，亞砷酸鹽增加了hsa_circ_100284 的水平，hsa_circ_100284 作為hsa_miR_217 海綿，繼而上調(diào)miR_217 的靶基因EZH2 的水平，EZH2 結(jié)合CCND1 的啟動子區(qū)域，上調(diào)細胞周期蛋白D1 和CDK4，導致細胞周期加速并引起惡變［5］。隨后他們又選取在T-HaCaT 中下調(diào)最為明顯的hsa_circ_008913 進行研究。結(jié)果證實hsa_circ_008913 可作為hsa_miR_889 海綿，hsa_circ_008913 水平降低間接下調(diào)hsa_miR_889 的靶基因DAB2IP（一種Ras-GTP 酶激活蛋白，可以負向調(diào)控Ras 依賴的有絲分裂信號，在多種癌癥類型中都是下調(diào)的［24］）的表達，上調(diào)ZEB1 的表達。功能學實驗表明，過表達hsa_circ_008913 或者轉(zhuǎn)染hsa_miR_889 抑制劑都降低了T-HaCaT 細胞的克隆形成、侵襲、遷移以及裸鼠成瘤的大小，并且這些效應可以被共轉(zhuǎn)染hsa_miR_889 mimic 所反轉(zhuǎn)。上述結(jié)果同樣也表明hsa_circ_ 008913 作為miR_889的競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）來發(fā)揮作用。他們同時發(fā)現(xiàn)在HaCaT 細胞中，亞砷酸鹽引起皮膚干細胞表面標志物（k5 和CD34）mRNA 水平增加。研究表明miR_889 與癌干細胞（CSCs）的調(diào)節(jié)相關，它的主要功能是調(diào)節(jié)和細胞增殖相關的信號流并且可以阻斷上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）導致的轉(zhuǎn)移；在人PCa 細胞中，DAB2IP 通過調(diào)節(jié)干細胞因子受體來調(diào)節(jié)癌干細胞表型［25］（癌干細胞是一個稀有亞群，擁有腫瘤發(fā)生以及自我更新的能力，維持腫瘤生長，與轉(zhuǎn)移的形成相關；皮膚、乳腺、肝臟以及肺癌均由CSCs 引發(fā)）。因此，亞砷酸鹽引起hsa_circ_008913 水平降低最終是通過增加皮膚干細胞表面標志物mRNA 水平，引起癌干細胞樣功能獲取進而導致惡性轉(zhuǎn)化［6］。關于重金屬離子導致皮膚病變的研究目前只涉及到細胞層次，更深入的研究有待進一步去開展。

2 circRNA 的臨床應用與靶向治療

circRNA 主要具有普遍、保守、特異、穩(wěn)定以及表達水平高的特點，因此circRNA 作為診斷、疾病進程以及治療后反應的生物標志物具有明顯的優(yōu)勢。已有部分circRNA作為診斷標志物的例子，如食管癌中升高的circular RNA ITCH［26］，結(jié)直腸癌中多種降低的circRNAs［27］，胃癌中升高的circ_002059［28］等。但多數(shù)的疾病并沒有發(fā)現(xiàn)特異circRNA 為其診斷標志物。此外，circRNA 在血漿以及其他體液中的循環(huán)尤其是在外泌體一類的微粒體中的代謝將是一個潛在的研究方向。

circRNA 也可能是一個潛在的治療靶點?？梢酝ㄟ^減少功能性轉(zhuǎn)錄本的環(huán)化或使用“mRNA 陷阱”在轉(zhuǎn)錄本中隔離功能失調(diào)的外顯子從而達到降低circRNA 表達的效果。CiRS-7 是一個強力的miR-7 海綿，含有多種miRNA 反應元件可與miR-7 海綿結(jié)合，其可以瞬間結(jié)合或釋放大量miR-7［29］，可見circRNA 具有強大的miRNA 海綿功能，因此可以通過人工構(gòu)建對應的環(huán)狀miRNA 海綿來抑制疾病相關miRNA 從而達到治療疾病的目的［30］。

3 展望

綜上所述，circRNAs在皮膚相關疾病以及損傷中發(fā)揮了重要的生物學功能，但在皮膚相關疾病的研究中，目前主要存在的問題是：（1）研究相對比較表淺，以觀察到上調(diào)或下調(diào)的現(xiàn)象為主，對其機理的探討相對較淺顯。例如，circRNA_0048043 的上調(diào)可增加惡性黑色素瘤的惡性程度，circ_Amotl1上調(diào)可促進皮膚創(chuàng)傷愈合等，但這些circRNA 在誘導不同疾病發(fā)生發(fā)展中的詳細機制還不明確，有待深入研究；（2）皮膚是個免疫器官，但目前有關circRNA和皮膚相關的疾病研究，主要集中在皮膚癌的相關領域，而對系統(tǒng)性紅斑狼瘡等皮膚重要的免疫性疾病的相關研究相對較少；（3）皮膚作為直接接觸外界的組織器官，很容易受到復合損傷因素的作用，比如紫外線和PM2.5 的協(xié)同作用等，這也將是今后研究方向之一。circRNA 和其他ncRNA 相比更加穩(wěn)定，因而其無論作為疾病的生物標志還是治療的靶點都具有明顯的優(yōu)勢，通過沉默促癌的circRNA 或其與腫瘤相關的位點可以達到靶向治療的目的，臨床應用前景廣闊。