環(huán)狀RNA 與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的關(guān)系

李奇 楊俊 楊簡(jiǎn) 楊英

三峽大學(xué)心血管病研究所，三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院心內(nèi)科（湖北宜昌443003）

隨著我國(guó)老齡化進(jìn)程的推進(jìn)，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（簡(jiǎn)稱冠心?。┑陌l(fā)病率逐年上升，已成為危害人類健康與生命的主要疾病之一，尤其是冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊破裂所引起的急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI），是死亡率居高不下的主要病因［1］。近年來(lái)，隨著冠心病的研究不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)某些特殊非編碼RNA 分子（Non-coding RNAs，ncRNAs）—環(huán)狀RNA（circularRNAs，circRNAs）在冠心病的發(fā)展過(guò)程中出現(xiàn)異常表達(dá)并具有一定的調(diào)節(jié)功能，其作為生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)在冠心病的診斷和治療中發(fā)揮重要作用［2］。因此，本文就circRNAs的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、生物學(xué)功能以及circRNAs在冠心病中的作用予以綜述。

1 circRNA 的發(fā)現(xiàn)

早在40 多年前，研究者就已經(jīng)在植物感染的病毒中發(fā)現(xiàn)circRNAs 的存在，然而，由于當(dāng)時(shí)的技術(shù)條件限制，circRNAs 一度被認(rèn)為是剪接過(guò)程中的異常產(chǎn)物或錯(cuò)誤表達(dá)而被忽視［3-4］。直到2012年，DANAN 等［5］發(fā)現(xiàn)circRNAs 大量存在于古生菌中且具有一定的生物學(xué)功能。隨后又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)circRNAs 在人、斑馬魚(yú)、小鼠以及其他動(dòng)植物中廣泛存在，才使得circRNAs 逐漸被重視起來(lái)，成為ncRNAs 分子研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)［6］。隨著高通量測(cè)序以及芯片分析的發(fā)展，研究者在小鼠以及人類心臟組織中發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多circRNAs 的表達(dá)，其中通過(guò)circRNAs 全基因組關(guān)聯(lián)分析，在人類心臟組織中檢測(cè)到的circRNAs 已超 過(guò)15 318 種［7-8］。circRNAs 在 心肌組織與血管中的大量表達(dá)為circRNAs 在冠心病中的研究提供了良好的基礎(chǔ)。

2 circRNA 的結(jié)構(gòu)與分類

circRNAs 主要通過(guò)蛋白質(zhì)編碼基因與RNA 聚合酶Ⅱ（RNA polymerase II ，Pol II）的轉(zhuǎn)錄合成，與典型線性RNA不同，circRNAs 不含有5’端帽子與3’端多聚A 尾結(jié)構(gòu)，而是由前體RNA 以共價(jià)鍵首尾相連形成的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因此不易被核糖核酸酶降解，而且與線性RNA 相比，其結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定［9-10］。迄今為止，研究人員發(fā)現(xiàn)的circRNAs 類型已高達(dá)10 萬(wàn)余種，并具有高度特異性、保守性且含量豐富可廣泛存在于機(jī)體各個(gè)組織以及血液、唾液中［11-12］。關(guān)于circRNAs 的形成機(jī)制目前尚無(wú)定論，JECK 等［11］認(rèn)為circRNAs 的生成可能存在兩種模型：（1）套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化，由外顯子跳躍介導(dǎo)跨域區(qū)域形成circRNAs 中間體，最終經(jīng)套索剪接形成circRNAs 分子；（2）內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化，由外顯子兩側(cè)具有互補(bǔ)序列的內(nèi)含子區(qū)域配對(duì)介導(dǎo)反向剪接從而形成circRNAs 分子。隨后，ZHANG 等［13］提出第三種模型，即通過(guò)內(nèi)含子互補(bǔ)序列（例如重復(fù)元件）的堿基配對(duì)使得插入的剪接位點(diǎn)連接緊密從而促進(jìn)circRNAs 的產(chǎn)生。最新研究還發(fā)現(xiàn)RNA 結(jié)合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）能夠在間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化過(guò)程中與前體mRNA 特點(diǎn)位點(diǎn)結(jié)合，從而促進(jìn)circRNAs 的形成［12］。

基于來(lái)自親本基因的外顯子和內(nèi)含子的組成成分，circRNAs 可以分為三類：外顯子circRNA（exonic circRNAs，ecircRNA），其僅包含反向剪接的外顯子；內(nèi)含子circRNA（circular intronic RNAs，ciRNA），通 常 由 前 體mRNA 中釋放所得；與外顯子和內(nèi)含子共同環(huán)化的外顯子-內(nèi)含子circRNAs（exon-intron circRNAs，EIciRNA）［11，14-15］。此外，前體tRNA也能夠剪接成環(huán)形成tRNA內(nèi)含子circRNAs（tRNA intronic circRNA，tricRNA）［16］。其中多數(shù)circRNAs來(lái)源于ecircRNA，但在生理與病理?xiàng)l件下，不同來(lái)源的circRNAs 在分子水平上以不同的作用方式發(fā)揮著重要生物學(xué)功能。

3 circRNA 的生物學(xué)功能

目前，已發(fā)現(xiàn)的circRNAs 的功能主要有四種類型：（1）miRNA 海綿作用，circRNAs 是一種競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNAs，含有共同的miRNA 反應(yīng)元件，可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地與miRNA 結(jié)合導(dǎo)致miRNA 表達(dá)被抑制，由于circRNAs 具有單個(gè)或多個(gè)miRNA 結(jié)合位點(diǎn)，所以其可以像海綿一樣吸收miRNA 降低其活性，從而間接調(diào)控miRNA 靶基因的表達(dá)［17-18］；（2）調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，存在于細(xì)胞核中ciRNAs 可以與polⅡ相互作用并以順式作用方式調(diào)節(jié)宿主基因轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)含有來(lái)自其親本基因內(nèi)含子序列的EIciRNA，也可以與U1 小核核糖核蛋白相互作用，然后與其親本基因啟動(dòng)子上的polⅡ結(jié)合從而增強(qiáng)基因的表達(dá)［15，19］；（3）調(diào)控轉(zhuǎn)錄與翻譯，circRNAs 可以作為“基因陷阱”通過(guò)隔離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)減少線性RNA 轉(zhuǎn)錄后的翻譯，阻斷終產(chǎn)物的表達(dá)，同時(shí)其還可以作為RBPs 的海綿，與RBPs 結(jié)合影響RNA 的轉(zhuǎn)錄從調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)水平［20-21］；（4）蛋白翻譯作用，實(shí)現(xiàn)circRNAs 翻譯作用的一種方式是通過(guò)其作為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site，IRES）的序列來(lái)促進(jìn)起始因子或核糖體與可翻譯的circRNAs 的直接結(jié)合［22］。因此，circRNAs 能夠從調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、miRNA 海綿以及調(diào)控蛋白的翻譯與表達(dá)等多種途徑來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)功能，并顯示出對(duì)心血管疾病的重要調(diào)控作用，包括動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，As）、心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷等。

4 circRNA 與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病

隨著circRNAs 的更多功能被發(fā)現(xiàn)，研究證實(shí)circRNAs與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病以及腫瘤等多種疾病有關(guān)，而circRNAs 與冠心病之間的潛在關(guān)系也逐漸被揭示［2］。

4.1 circRNA 在冠心病中的診斷作用 circRNAs 具有高度特異性，在血管以及心臟組織中都存在表達(dá)，來(lái)自12 例人類心臟和25 例小鼠心臟標(biāo)本中，研究人員分別發(fā)現(xiàn)了15 318 和3 017 種 在心肌中表達(dá)的circRNAs［7］。而在冠心病發(fā)展過(guò)程中，多種circRNAs 也出現(xiàn)表達(dá)失調(diào)，所以血清中circRNAs 表達(dá)水平的分析已成為冠心病診斷的新方法。ZHAO 等［23］通過(guò)芯片分析篩選出冠心病患者中共22 種出現(xiàn)差異性表達(dá)的circRNAs，其中12 種表達(dá)上調(diào)，10 種表達(dá)下調(diào)，并發(fā)現(xiàn)在這22 種表達(dá)失調(diào)的circRNAs 中，hsa_circ_0124644 在患者外周血中具有較高的敏感性與特異性，提示了hsa_circ_0124644 可能具有作為冠狀動(dòng)脈疾病的診斷標(biāo)志物的潛在價(jià)值。另一方面，鄒天宇等［24］在冠心病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，冠心病患者PBMCs 中circTCF25 的表達(dá)顯著下調(diào)，同時(shí)受試者工作特征曲線分析顯示circTCF25 可能是冠心病診斷的潛在生物標(biāo)志物，并證實(shí)circTCF25 的診斷價(jià)值明顯高于心電圖，約等于Holter 監(jiān)測(cè)。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自鋅指蛋白609（zinc finger protein 609，ZNF609）基因的外顯子1 形成的與AMI 相關(guān)的環(huán)狀RNA（myocardial infarction associated circular RNA，MICRA）可能是AMI 后左心室功能障礙的預(yù)測(cè)因子［25］。VAUSORT 等［25］通過(guò)檢測(cè)642 例AMI 患者外周血中的circRNAs 表達(dá)發(fā)現(xiàn)AMI 患者血液中的MICRA 水平明顯低于健康人，而且MICRA 水平相對(duì)較低的AMI 患者其左心室功能障礙的風(fēng)險(xiǎn)更高，所以circRNAs 也可以作為MI的生物標(biāo)記物對(duì)患者的預(yù)后進(jìn)行有效預(yù)測(cè)。以上結(jié)果表明，circRNAs 在冠心病中的診斷價(jià)值不可小覷。

4.2 circRNA 在As 中的作用 As 是冠心病最常見(jiàn)要的血管病變，主要與脂質(zhì)浸潤(rùn)、內(nèi)皮損傷、血管平滑肌細(xì)胞遷移以及增殖密切相關(guān)。多個(gè)基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，As的易感性與人類染色體9p21 上INK4/ARF 基因簇反義非編碼RNA（antisense non- coding RNA in the INK4 locus，ANRIL）有關(guān)，而ANRIL 又可以自發(fā)剪接成環(huán)狀形成環(huán)狀A(yù)NRIL（circANRIL）［26］。HOLDT 等［27］研究發(fā)現(xiàn)circANRIL可以與60S 核糖體前體組裝因子PES1 結(jié)合，抑制心肌細(xì)胞中核酸外切酶介導(dǎo)的加工和核糖體形成進(jìn)而誘導(dǎo)核仁應(yīng)激與抑癌基因P53 活化，最終促進(jìn)凋亡的同時(shí)平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增殖也被抑制，表明了circANRIL 可以防止As 的發(fā)生。LI 等［28］通過(guò)氧化修飾LDL（oxidative modified LDL，oxLDL）誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）損傷來(lái)建立As 體外模型，結(jié)果顯示總共943個(gè)circRNA 存在異常表達(dá)，其中Hsa_circ_0003575 的表達(dá)顯著上調(diào)，并發(fā)現(xiàn)抑制hsa_circ_0003575表達(dá)可以可以促進(jìn)增殖，提高HUVECs 的血管生成能力以及減少凋亡的發(fā)生。在糖尿病患者中，高濃度的血糖可引起血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的異常增殖和遷移，加重As 的進(jìn)程。CHEN 等［29］在體外實(shí)驗(yàn)中采用高糖誘導(dǎo)VSMCs 過(guò)度增殖和遷移也發(fā)現(xiàn)共983 種circRNAs 出現(xiàn)差異性表達(dá)，其中458 個(gè)表達(dá)上調(diào)，525 種表達(dá)下調(diào)，并確定了一種上調(diào)的circRNA-circWDR77，抑制其表達(dá)顯著抑制VSMCs 的過(guò)度增殖和遷移，其機(jī)制可能是circWDR77 通過(guò)海綿作用靶向調(diào)控其下游靶點(diǎn)miRNA-124 和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2 來(lái)介導(dǎo)VSMCs 的增殖和遷移，從而影響As 的發(fā)展。

4.3 circRNA 在AMI 中的作用 AMI 作為冠心病中的急危重癥，是導(dǎo)致患者死亡的主要危險(xiǎn)因素，具有較高的病死率與致殘率。研究表明，Cdr1as 作為circRNAs 家族成員也可以發(fā)揮miRNA-7a 海綿作用，降低miRNA-7a 的活性，而miRNA-7a 在心肌組織中可以通過(guò)抑制多聚ADP 核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）與轉(zhuǎn)錄因子SP1的表達(dá)來(lái)減少心肌細(xì)胞凋亡從而改善心肌損傷［30］。GENG等［31］在AMI 小鼠心肌或低氧處理的心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，Cdr1as 與miRNA-7 的表達(dá)均上調(diào)并與心肌梗死面積成正比，同時(shí)，過(guò)表達(dá)Cdr1as 可促進(jìn)過(guò)缺氧和AMI 損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，這可能是由于Cdr1as 通過(guò)miRNA 海綿效應(yīng)抑制miRNA-7 的活性，減輕miRNA-7 對(duì)PARP 與SP1 的抑制，進(jìn)而增加心肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致AMI 加重。DENG 等［32］在AMI 患者血液樣本中發(fā)現(xiàn)circRNA_081881 表達(dá)降低近10 倍，生物信息分析預(yù)測(cè)表明circRNA_081881 也可以通過(guò)結(jié)合miRNA-548，其中miRNA-548 可以負(fù)性調(diào)控AMI保護(hù)因子過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferators-activated receptors-γ，PPAR-γ）的抑制，因此，circRNA_081881 與miR-548以及PPAR-γ的相互調(diào)控為AMI 的治療提供了有吸引力的靶點(diǎn)。

5 結(jié)論

總之，不同來(lái)源的circRNAs 可產(chǎn)生不同類型的circRNAs 并分別具有不同的生物學(xué)功能如吸收miRNA、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄以及翻譯蛋白質(zhì)等，促使circRNAs 介導(dǎo)多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。其中在冠心病調(diào)控過(guò)程中，大多數(shù)circRNAs 是通過(guò)miRNA 海綿形成調(diào)節(jié)冠心病相關(guān)蛋白表達(dá)的circRNA-miRNA 信號(hào)軸來(lái)發(fā)揮作用。盡管circRNAs的發(fā)現(xiàn)已有40 余年，但circRNAs 在As、MI 以及其他心血管疾病中的作用研究仍處于起步階段，進(jìn)一步驗(yàn)證circRNAs 的功能來(lái)揭示其在冠心病中的作用及分子機(jī)制是有必要的。首先，需要制定檢測(cè)外周血以及組織中circRNAs 水平的標(biāo)準(zhǔn)化方法；其次，應(yīng)將circRNAs 表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)而建立正常基線來(lái)區(qū)分冠心病患者和健康人。除了miRNA 海綿作用，circRNAs 其他作用機(jī)制如轉(zhuǎn)錄及翻譯的調(diào)節(jié)在冠心病中的作用仍需要進(jìn)一步探索；心肌組織中的circRNAs 是否會(huì)被其他組織吸收產(chǎn)生繼發(fā)效應(yīng)仍待明確。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的出現(xiàn)，疾病的診斷和治療將逐漸聚焦于分子遺傳學(xué)，circRNAs 作為生物標(biāo)志物與治療靶點(diǎn)在冠心病的防治工作中呈現(xiàn)出巨大希望。但由于診斷的局限性以及脫靶效應(yīng)的限制，將circRNAs 應(yīng)用于臨床實(shí)踐中仍任重而道遠(yuǎn)。