腸道緊密連接跨膜蛋白研究進展

婁文靜，劉冬妍

0 引言

腸上皮是機體抵抗內(nèi)源性和外源性有害物質(zhì)的第一道防線，為機體與外界環(huán)境之間提供了一個選擇性可滲透屏障，能夠限制腸腔內(nèi)有害分子如病原體、毒素和抗原的滲透，同時可以適當吸收營養(yǎng)物質(zhì)和水分[1]，腸上皮屏障功能障礙是腸道發(fā)病的主要原因[2]。緊密連接(Tight junction，TJ)在腸道上皮屏障中發(fā)揮著重要作用，其由跨膜蛋白Claudins、Occludin、Tricellulin和JAMs以及外周膜支架蛋白組成[2-3]?？缒さ鞍妆磉_異常可導致屏障功能破壞和細胞旁通透性增加，引起腸腔內(nèi)促炎分子的滲透，誘導黏膜免疫系統(tǒng)的激活，導致持續(xù)的炎癥和腸道組織損傷。本文將闡述與腸道TJ相關的4種跨膜蛋白的基本概況及其在腸道疾病中的作用。

1 Claudins

1.1 Claudins的組成結(jié)構(gòu) Claudins是分子量為21～27 kDa的蛋白質(zhì)家族，在人類和嚙齒動物中至少有27個成員，是TJ的骨架，能夠在沒有任何其他跨膜蛋白的情況下形成TJ，是TJ蛋白中最為重要的一組蛋白，其對維持TJ的滲透性起著至關重要的作用[4]。Claudins含有4個跨膜結(jié)構(gòu)域，2個高度保守的胞外環(huán)和1個胞內(nèi)環(huán)。第1個胞外環(huán)平均含有大約53個氨基酸，是細胞旁路孔道形成的基礎，對跨上皮電阻(Transepithelial electrical resistance，TEER)和細胞旁路的電荷選擇均具有重要作用。第2個胞外環(huán)略小，含有大約24個氨基酸，主要起支持作用，有助于緊密連接束的形成，使細胞旁路的縫隙更加緊密[5]。Claudins還有2個N-末端和C-末端，位于細胞質(zhì)內(nèi)。N-末端通常很短，含4～10個氨基酸；C-末端長度不等，通常含21～63個氨基酸，存在特異性PDZ(PSD-95/DLG/Z01)結(jié)合區(qū)[6]，可與ZO蛋白的第1個PDZ結(jié)構(gòu)域相互作用[7]。而ZO蛋白又與肌動蛋白絲連接，從而使TJ蛋白與細胞內(nèi)骨架結(jié)構(gòu)形成穩(wěn)定的系統(tǒng)，參與細胞的信號傳導[8]。另外，C-末端存在磷酸化位點(YV序列)，能在PKA、PKC等蛋白激酶的作用下發(fā)生磷酸化，磷酸化的Claudins蛋白可影響緊密連接的功能[8]。

1.2 Claudins的分類 按結(jié)構(gòu)分類，Claudins可分為2種：一種是高度同源的，包括Claudin-1～10、14～15、17、19；另一種是非同源的，如Claudin-11～13、16、18、20～27[9]。按功能分類，Claudins可分為：①形成屏障，提供TJ細胞旁密封性的，如Claudin-1、3～5、8、11、14、19；②形成孔道，提供TJ細胞旁通透性的，如Claudin-2、10；③同時具有上述2種功能的，如Claudin-7、12、15～16[10]。按選擇性分類，Claudin-2、10b、15是陽離子選擇性的，Claudin-10a、17是陰離子選擇性的，Claudin-2、8、9是水選擇性的[11]。

1.3 Claudins蛋白在組織中的分布 同一種Claudin蛋白可能廣泛表達于體內(nèi)各種上皮組織；比如在肝臟、腦、肺、腸、脾、骨骼肌、腎臟、睪丸等器官組織均可鑒定出Claudin-1。而同一器官或組織中，也常存在多種Claudin蛋白的表達。例如腎臟中有Claudin-3～5、7、8、10、21、24～27[12]；肝臟中有Claudin-2～3；肺組織中有Claudin-2～5、7、8；腦組織中有Claudin-2～5。有些Claudin蛋白在特定的組織或器官中高表達，如Claudin-14高表達于耳蝸細胞；Claudin-15高表達于小腸黏膜細胞；Claudin-18高表達于破骨細胞[13]。有的Claudin蛋白的表達存在高度特異性，如Claudin-6僅在胚胎干細胞中表達。

即使在同一種組織，不同部位所表達的Claudins亦有差異，如在胃腸道的不同區(qū)段表達水平存在明顯的差異：在人體，Claudin-2、15主要表達在胃腸道的近端[14]；Claudin-1主要在結(jié)腸表達[15]；Claudin-3、4、7、8主要在結(jié)腸、乙狀結(jié)腸和直腸表達；Claudin-12在整個胃腸道均表達[16]。而在小鼠，Claudin-7在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸中大量表達[17]；Claudin-8存在于回腸和結(jié)腸，在空腸和十二指腸中不存在；Claudin-12在回腸高表達，在空腸和結(jié)腸中表達，在十二指腸中幾乎不表達；Claudin-13僅在結(jié)腸中表達，在其余的腸段中不表達；Claudin-15在十二指腸和空腸中高表達，從回腸到結(jié)腸的表達量逐漸減少[18]。胃腸道中Claudins家族成員的差異表達模式可能有助于TEER和細胞旁離子流的局部多樣性。

1.4 Claudins蛋白功能及在腸道疾病中的作用

1.4.1 Claudins蛋白在腸道中的功能 Claudins蛋白能夠維持上皮細胞的完整性，封閉細胞間的間隙，加強細胞間的緊密連接，調(diào)節(jié)細胞間各種離子和分子跨細胞旁路的被動轉(zhuǎn)運。Claudins蛋白的結(jié)構(gòu)異常、功能失調(diào)可導致細胞極性消失、細胞間緊密連接屏障破壞，進而導致內(nèi)環(huán)境紊亂，是很多疾病的病理基礎。

Claudins的含量及分子結(jié)構(gòu)的變化通常可以對腸道產(chǎn)生3種典型的影響：①吸收通道減少；②小溶質(zhì)和水分泌通道增加，導致腹瀉；③大分子的吸收通過增加，可能誘發(fā)炎癥反應。不同Claudins蛋白異常引起腸道疾病的病理生理機制不同，如Claudin-1、3、4、5、7、8減少溶質(zhì)和水的細胞旁轉(zhuǎn)運，即增強屏障作用；而Claudin-2、7、10、12、15增加溶質(zhì)和水的細胞旁轉(zhuǎn)運，即削弱屏障作用[11,19]。

1.4.2 Claudins蛋白與乳糜瀉 乳糜瀉是一種自身免疫性疾病，影響遺傳易感個體的小腸。病理特征是絨毛萎縮，上皮內(nèi)淋巴細胞計數(shù)增加(>30/100腸細胞)，固有層中的慢性炎癥浸潤和隱窩增生。在活動性乳糜瀉中，細胞旁通透性增加，TJ形態(tài)發(fā)生顯著改變。斷裂電子顯微鏡顯示，TJ網(wǎng)變薄且破損，深度減少，TJ鏈數(shù)減少，異常鏈和不連續(xù)鏈的數(shù)量增加，蛋白質(zhì)進入黏膜層，誘導持續(xù)的免疫反應，腸道通透性增加。Schumann等[20]在患有活動性乳糜瀉的患者的十二指腸活檢中證實了通道形成蛋白Claudin-2、15的上調(diào)以及屏障形成蛋白Claudin-3、5、7的下調(diào)。

1.4.3 Claudins蛋白與炎癥性腸病 潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn′s disease，CD)是慢性和復發(fā)性炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)，折磨了全世界數(shù)百萬人，損害了他們的機體健康和生活質(zhì)量。

UC是IBD的一種獨特重要亞型，以慢性炎癥和黏膜損傷為特征[21]，病變多位于乙狀結(jié)腸和直腸，也可延伸至降結(jié)腸，甚至整個結(jié)腸，病理漫長，常反復發(fā)作。雖然發(fā)病機制尚未闡明，但越來越多的證據(jù)表明腸上皮屏障功能障礙在UC發(fā)展中至關重要。研究發(fā)現(xiàn)，在UC患者中Claudin-1、2、4、7的表達和再分布降低[22]，Claudin-2的表達增加[23]；活動性UC患者受損腸段中Claudin-1、3、4、5的表達均降低[24-25]。

CD患者整個腸道都可以被侵染，其病變腸段表現(xiàn)為上皮細胞TJ鏈減少，鏈斷裂，TJ蛋白含量和組成改變，腸滲透性顯著增加。在活動性CD患者的腸道中，冷凍斷裂電子顯微鏡分析顯示，起屏障作用的Claudin-4、5、8均明顯下降并重新分布，而起通道作用的Claudin-2則明顯上調(diào)，這構(gòu)成了TJ變化的分子基礎[26-27]。

1.4.4 Claudins蛋白與腸道易激綜合征 腸道易激綜合征(Irritable bowel syndrome，IBS)是一種慢性功能性疾病，所有患者的腸滲透性均增加。研究顯示，IBS患者腸道的Claudin-4蛋白表達降低[28]，Claudin-1 mRNA和蛋白表達水平均降低[29]，Claudin-2、15的表達上調(diào)，肌球蛋白輕鏈磷酸化增加[30-32]。

2 Occludin

2.1 Occludin蛋白概述 Occludin是第1個鑒定的完整的膜TJ蛋白，沒有發(fā)現(xiàn)同源物[33]，廣泛存在于腦、肝、肺、腎等重要器官的上皮細胞和內(nèi)皮細胞中。Occludin也是一種具有4個跨膜結(jié)構(gòu)域的跨膜連接蛋白，相對分子量是65 kDa，由504個氨基酸構(gòu)成。其除了有4個跨膜結(jié)構(gòu)域，還有2個大的富含絲氨酸(Serine，Ser)、蘇氨酸(Threomine，Thr)和酪氨酸(Tyrosine，Tyr)殘基的細胞外環(huán)，1個由10個氨基酸殘基構(gòu)成的細胞內(nèi)環(huán)，位于細胞質(zhì)內(nèi)的1個短的N-末端和1個長的C-末端[1]。Occludin的C末端尾部的Occludin-ELL結(jié)構(gòu)域負責與ZO蛋白的GUK結(jié)構(gòu)域相互作用[33]，促使細胞間連接更加穩(wěn)定。Occludin一般通過形成同源二倍聚合體連接于兩細胞間，其2個細胞外環(huán)介導同源相互作用和對大分子的滲透性。2個細胞外環(huán)的等電點都接近中性，第1個細胞外環(huán)含近61%的Tyr和甘氨酸(Glycine,Gly)殘基，第2個細胞外環(huán)含有18%的Tyr殘基。相鄰細胞間的第1個外環(huán)相互交錯形成封閉區(qū)域，而研究表明，缺少第2個細胞外環(huán)的Occludin蛋白在TJs中不存在，表明第2個細胞外環(huán)對Occludin蛋白穩(wěn)定地組裝進TJ是必不可少的[34]。研究表明，Occludin的敲低誘導了大分子細胞旁通透性的增加，表明Occludin在TJ的維持和組裝中起作用[2]。

2.2 Occludin蛋白的磷酸化調(diào)節(jié) Occludin蛋白存在磷酸化和去磷酸化2種形式，磷酸化是其活性形式。體外研究表明，Occludin的磷酸化可以調(diào)節(jié)Occludin的定位和TJ通透性，磷酸化增強屏障功能，而去磷酸化導致TJs組裝延遲，屏障功能障礙[1,33]。Occludin的這種磷酸化受激酶和磷酸化酶位點之間平衡的調(diào)節(jié)。在完整的上皮細胞TJs處，Occludin在Ser和Thr殘基上高度磷酸化[35]，而磷酸化殘基較少的Occludin蛋白則多分布在細胞質(zhì)的基底膜側(cè)[34]。Ser或Thr磷酸化的作用是激活蛋白質(zhì)的活性，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的各種生命活動，其對Occludin的調(diào)節(jié)最為重要。在TJ拆卸過程中，Occludin在Ser和Thr殘基上發(fā)生去磷酸化。有報道，蛋白質(zhì)磷酸酶(PP)1和2A直接與Occludin相互作用，在Ser和Thr殘基處使其去磷酸化。PP1優(yōu)先在Ser殘基上去磷酸化Occludin，而PP2A在Thr殘基去磷酸化Occludin方面更具活性。PKC為蛋白激酶C，是C激酶通路的胞內(nèi)效應酶，是一種脂質(zhì)依賴性蛋白激酶，其作用包括調(diào)節(jié)代謝：使膜蛋白和多種酶蛋白Ser/Thr殘基磷酸化。PKC g、PKC f與Occludin的磷酸化有關，其被激活后，作用于Occludin分子，使其磷酸化，從而調(diào)控細胞間的TJs，升高跨上皮電阻，增強細胞間連接的緊密性。PKC g、PKC f的減少或抑制可以誘導Occludin去磷酸化，導致TJ破壞。

其次，Tyr磷酸化也在Occludin的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。Tyr磷酸化發(fā)生在Occludin的羧基端，磷酸化相比于非磷酸化的Tyr羧基端，結(jié)合的ZOs蛋白減少，從而使細胞間的極性和通透性增加，TJs功能減退，屏障功能下降。反之，Tyr去磷酸化則可增強細胞間阻力，降低細胞間通透性，TJ屏障功能上調(diào)。酪蛋白激酶Ⅰ和Ⅱ以及非受體酪氨酸激酶c-Src已被鑒定為與Occludin的磷酸化有關。完整上皮中Tyr磷酸化的Occludin水平非常低，過氧化氫、乙醇的生物代謝產(chǎn)物乙醛,都通過Occludin Tyr磷酸化依賴性方式破壞TJ[36-37]。

2.3 Occludin蛋白的功能及在腸道疾病中的作用 Occludin蛋白是TJs的重要組成部分，通過轉(zhuǎn)染Occludin siRNA，可以減少細胞間緊密連接的形成。阻斷Occludin的N-末端或C-末端的表達，能減少屏障的TEER，提示Occludin對TJ的結(jié)構(gòu)及功能至關重要[2]。

Occludin在多種常見腸道疾病中都有明顯的表達變化，如活動性CD患者腸道通透性顯著增加，Occludin在TJ重新分布并明顯下調(diào)[38]；UC患者Occludin蛋白表達降低和分布改變，用小檗堿(中藥黃連最豐富和主要的活性異喹啉生物堿)治療后Occludin表達顯著上調(diào)，維持了腸黏膜屏障的完整性，減輕了腸道炎癥[39]；活動性乳糜瀉以及IBS患者的Occludin表達亦下調(diào)[20,33,40]。

3 JAM

3.1 JAM蛋白的概述 JAM屬于免疫球蛋白超家族，其特征在于2個胞外Ig結(jié)構(gòu)域，1個單跨膜結(jié)構(gòu)域和1個短的胞內(nèi)C端結(jié)構(gòu)域，因此，在結(jié)構(gòu)上與有4個跨膜結(jié)構(gòu)域的TJ蛋白Occludin和Claudins明顯不同[1]。JAM家族由3個經(jīng)典成員(JAM-1、-2、-3)和4個相關分子(JAM-4、JAM-L、CAR、ESAM)組成，每個約40 kDa[41]，在上皮細胞、內(nèi)皮細胞和免疫細胞等細胞中表達。JAM家族成員的細胞外N-末端結(jié)構(gòu)域通過同嗜性和嗜異性相互作用與各種配體結(jié)合，同嗜性相互作用在TJ和細胞-細胞邊界的形成中起作用，而嗜異性相互作用在細胞-細胞黏附、白細胞和表皮/內(nèi)皮細胞之間的結(jié)合、血小板活化和病毒識別中起作用。JAM蛋白的C-末端尾部還含有PDZ結(jié)合基序，其與ZO-1的第3個PDZ結(jié)構(gòu)域相互作用[7]。

3.2 JAM的功能及在腸道疾病中的作用 作為TJ跨膜蛋白的成員之一，JAM蛋白能夠調(diào)節(jié)細胞旁通透性，改善屏障功能，還能促進Occludin組裝到TJ復合物。此外，體外化學趨化實驗或體內(nèi)炎癥反應模型均證實，JAM能夠限制白細胞通過TJ，表明JAM在白細胞從血管向炎癥部位的遷移而響應炎癥反應中也發(fā)揮重要作用[7,41]。JAM-1、JAM-4和CAR均在腸上皮細胞中表達，并參與TJ的調(diào)節(jié)和維持，影響腸道通透性和炎癥反應[42]。在許多腸道疾病中，JAM均發(fā)生變化，如在CD和UC患者中，JAM-1的表達都減少，腸道通透性增加[1]。用單克隆JAM-1抗體治療腸上皮細胞損傷，檢測到跨上皮電阻(TEER)和屏障組裝逐漸恢復正常[43]。最近的研究表明，JAM-1敲除小鼠的結(jié)腸與野生型小鼠相比，對葡聚糖和髓過氧化物酶有更高的滲透性；此外，在JAM-1基因敲除小鼠中，葡聚糖硫酸鈉(Dextran sodium sulfate，DSS)誘導的結(jié)腸損傷和炎癥比野生型小鼠更嚴重[44]。以上的研究均證明，JAM對腸道屏障功能起著關鍵的作用。

4 Tricellulin

4.1 Tricellulin蛋白的概述 近年來，三細胞間的緊密連接越來越引起人們的重視，Tricellulin蛋白就是其中之一。其于2005年被發(fā)現(xiàn)[45]，稱為MARVELD2，因為其與MARVELD1(Occludin)和MARVELD3 都是含有保守的4個跨膜結(jié)構(gòu)域的MARVEL結(jié)構(gòu)域蛋白，且存在于3個上皮細胞間，因此簡稱為Tric。人類Tric蛋白有4種亞型，即Tric-a、Tric-al、Tric-b、Tric-c，相對分子質(zhì)量為63.5 kDa。Tric在各種上皮細胞中廣泛表達，包括腸上皮細胞、肝細胞、鼻黏膜上皮細胞、耳蝸毛細胞和神經(jīng)束膜細胞[46]。Tric主要分布于3個上皮細胞的交界處，有的也存在于稀疏的雙細胞間[47]。有研究者將TJ 跨膜蛋白劃分為3細胞間緊密連接tTJ (Tricellulin)和雙細胞間緊密連接bTJ (Occludin、Claudins)[48]。tTJ在立體空間上構(gòu)成了1個直徑約10 nm的三細胞間“中央孔道”，與bTJ構(gòu)成的兩細胞間孔道相比，間隙更大，其作用可能與大分子或者細菌的細胞旁運輸有關系[4]。而bTJ 構(gòu)成的兩細胞間隙則與離子和小分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運有關。結(jié)構(gòu)上，Tric由2條長尾組成，N-末端和C-末端位于胞漿內(nèi)，其中C-末端130 個(32%)氨基酸殘基序列與Occludin一致，推測Tric也可受磷酸化的調(diào)節(jié)；其還含有Occludin-ELL結(jié)構(gòu)域，可能與ZO蛋白的GUK結(jié)構(gòu)域相互作用[49]。因此，Tric不僅是緊密連接的重要組成部分，在功能上與Occludin也能形成互補作用，在三細胞和雙細胞TJ的組織和功能中都能起到關鍵作用[50]。

4.2 Tric蛋白的表達調(diào)控及其功能 Tric蛋白的表達受多種因素的影響，如①Occludin：敲除Occludin 的基因能引起Tric的定位異常[51]；②腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)：上調(diào)Tric的蛋白表達水平[52]；③c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)：JNK激動劑可以下調(diào)Tric的表達，而應用JNK抑制劑可逆轉(zhuǎn)此變化[53]。

上皮細胞中過表達Tric能夠有效阻止大分子的滲漏，低表達Tric則會降低TJ的形成及穩(wěn)定性，影響屏障功能[49,54]。研究表明，將小鼠乳腺上皮Eph4細胞中的Tric敲除后，TJ結(jié)構(gòu)遭到破壞，TEER下降，細胞旁通透性顯著增加，而且bTJ的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)也受到了破壞[48]。在CaCo-2細胞內(nèi)敲除Tric蛋白基因，也得到了上述結(jié)果[52]。在另一個敲除Occludin的MDCKlI細胞實驗中，檢測到Tric由tTJ向bTJ移位，這一過程可以被導入并表達Occludin蛋白基因逆轉(zhuǎn)[55]，說明Tric對Occludin的缺失能起到部分代償作用。

在腸道疾病中，Tric發(fā)揮著重要作用，如在UC中可以檢測到Tric蛋白下調(diào)，并且其減少增加了大分子的通過。IL-13是UC的關鍵細胞因子，能夠?qū)е耇ric的下調(diào)和Claudin-2的上調(diào)，造成屏障破壞，腸道滲透性增加。而靶向白細胞介素13受體α2 (Interleukin-13-receptor α2，IL13Rα2)會阻斷UC導致的Tric減少，恢復屏障作用，阻止炎性大分子的滲入。因此，IL13Rα2通路可能在UC的治療中有效，是治療UC的新方法[54]。這些研究結(jié)果都提示，Tric在旁細胞途徑的轉(zhuǎn)運、維持TJ 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及屏障功能以及腸道相關疾病的診療中發(fā)揮重要作用[50]。

5 總結(jié)與展望

腸上皮細胞間的TJ 是構(gòu)成細胞旁物質(zhì)轉(zhuǎn)運途徑的結(jié)構(gòu)和功能基礎。隨著各種TJ跨膜蛋白陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)并研究，TJ跨膜蛋白不僅是細胞旁的選擇性屏障，很多TJ跨膜蛋白還參與調(diào)控細胞的生長、分化和信號轉(zhuǎn)導等過程。在腸道，TJ跨膜蛋白種類繁多、結(jié)構(gòu)復雜、功能不盡相同，其在腸道疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸之間的復雜關系還需要更為細致的觀察、分析和驗證。隨著腸道TJ跨膜蛋白研究的不斷深入，其相關信號通路的激活因子及抑制因子的研究也越來越受到重視，這必將會為人們更好地了解腸道疾病并進行相應的靶向治療提供更好的思路和依據(jù)。