調(diào)控核因子E2相關(guān)因子2信號(hào)干預(yù)足細(xì)胞損傷的體外研究

徐 成 徐孝東 翟修文 王 剛 侯 慶 陳朝紅 劉志紅

足細(xì)胞是維系腎小球?yàn)V過屏障結(jié)構(gòu)和功能完整性的重要結(jié)構(gòu)，足細(xì)胞損傷與蛋白尿和腎小球硬化的發(fā)生密切相關(guān)[1]。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)參與多種疾病狀態(tài)下足細(xì)胞損傷[2-3]。轉(zhuǎn)錄因子核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)是機(jī)體維持氧化還原穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子，并在抗炎，抗凋亡和DNA損傷修復(fù)等病理生理過程中發(fā)揮作用。Nrf2激活劑甲基巴多索隆(CDDO-Me)用于治療慢性腎病患者，包括糖尿病腎病的多項(xiàng)臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中(未發(fā)表資料)。初步臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CDDO-Me可有效增加估算的腎小球?yàn)V過率(eGFR)，改善慢性腎臟病(CKD)患者腎功能[4]。但Nrf2活化劑CDDO-Me對(duì)腎臟固有細(xì)胞的影響報(bào)道較少。本研究借助嘌呤霉素氨基核苷(PAN)誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷模型，體外觀察Nrf2激活劑CDDO-Me是否對(duì)足細(xì)胞損傷有直接保護(hù)作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究。

材料與方法

主要試劑與儀器CDDO-Me(APExBio公司),PAN(Sigma公司),RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司),γ干擾素(IFN-γ)(美國(guó)Sigma),Nrf2抗體(美國(guó)Santa Cruz),AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司),流式細(xì)胞儀(型號(hào) FACS ARIA) 。

足細(xì)胞培養(yǎng)和分組永生化的人足細(xì)胞株(HPC) 由英國(guó) Bristol 大學(xué)Moin.A.Saleem 教授惠贈(zèng)。足細(xì)胞于33℃,在IFN-γ(150 U/ml)條件下誘導(dǎo)增殖,而在37℃不含IFN-γ的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～14d,足細(xì)胞停止增殖,獲得分化表型。

實(shí)驗(yàn)分組 采用PAN 導(dǎo)致足細(xì)胞損傷的模型。方法為PAN以100 μg/ml濃度加入培養(yǎng)的足細(xì)胞,作用24h，在觀察CDDO-Me對(duì)足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究中,CDDO-Me(100 nmol/L) 單獨(dú)或與PAN聯(lián)合與足細(xì)胞預(yù)孵育24h,因此實(shí)驗(yàn)分為四組,分別為正常對(duì)照組,PAN損傷組(PAN 100 μg/ml)，CDDO-Me對(duì)照組(CDDO-Me 100 nmol/L),CDDO-Me治療組(PAN 100 μg/ml+CDDO-Me 100 nmol/L)。

免疫熒光染色檢測(cè)足細(xì)胞Nrf2入核情況接種于chamber slides中的各組細(xì)胞,PBS洗三次。用4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.5%Triton-x室溫破膜5 min和5% BSA室溫封閉30 min;加一抗后室溫孵育2h,然后加相應(yīng)的二抗室溫反應(yīng)30 min，加入DAPI室溫孵育10 min，PBS洗滌,吹干,甘油封片。

WesternBlot檢測(cè)足細(xì)胞Nrf2的表達(dá)細(xì)胞處理完成后，以預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞5 min,加入適量含蛋白酶抑制劑的裂解液冰上充分裂解細(xì)胞,4℃下12 000 r/min離心5 min,收集上清液,即為總蛋白。細(xì)胞核蛋白提取試劑盒購(gòu)自恩晶生物有限公司，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行：收集細(xì)胞后依次加入試劑盒中的裂解液A和B液，裂解液加入后均需劇烈震蕩，冰上孵育以充分裂解細(xì)胞；離心收集沉淀，加入C液，劇烈震蕩裂解后，離心收集上清，即為核蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度，取上述測(cè)量濃度的提取蛋白20 μg,在經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,以5%脫脂奶粉封閉1h,TBST洗膜3次,每次5 min;加入濃度1∶ 400 Nrf2一抗,4℃孵育過夜。TBST洗膜3次,每次5 min。加入濃度為1∶ 5 000的IgG-HRP的二抗室溫孵育1h,TBST洗膜3次,每次5min。ECL檢測(cè)樣本免疫活性,凝膠成像系統(tǒng)分析,Image J軟件得出灰度值。

qRT-PCR檢測(cè)NQO1、HO-1、TNF-a、IL-1的表達(dá)水平收集足細(xì)胞，總RNA按TaKaRa試劑盒方法提取并用Nanodrop 測(cè)定純度和濃度，再使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行cDNA 合成，PCR引物為人血紅素氧化酶1(Heme Oxygenase 1,HO-1):5′-C-A-G-G-A-G-C-T-G-C-T-G-A-C-C-C-A-T-G-A-3′和5′-A-G-C-A-A-C-T-G-T-C-G-C-C-A-C-C-A-G-A-A-3′。醌氧化還原酶1(NAD(P)H Quinone Dehydrogenase 1,NOQ1):5′-G-G-A-T-T-G-G-A-C-C-G-A-G-C-T-G-G-A-A-3′和5′-A-A-T-T-G-C-A-G-T-G-A-A-G-A-T-G-A-A-G-G-C-A-A-C-3′。腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor，TNF-α):5′-C-C-G-T-G-A-C-A-A-T-T-A-C-C-T-G-G-C-C-T-T-C-3′和5′-C-A-G-G-G-C-C-T-T-C-A-G-C-T-G-G-T-T-T-C-3′。白細(xì)胞介素-1(Interleukin-1，IL-1):5′-T-C-A-C-T-T-A-A-A-G-C-C-C-G-C-C-T-G-A-3′和5′-C-C-C-C-T-T-T-G-A-A-T-A-A-A-T-T-A-G-A-C-C-A-3′。參照物 GADPH:5′-G-G-A-G-C-G-A-G-A-T-C-C-C-T-C-C-A-A-A-A-T-3′和5′-G-G-C-T-G-T-T-G-T-C-A-T-A-C-T-T-C-T-C-A-T-G-G-3′。qPCR使用SYBR Green法，PCR熱循環(huán)條件:95℃ 30s 預(yù)變性后，進(jìn)行 95℃ 5s、 60℃ 1 min的熱循環(huán)，共 40次;使用儀器為 ABI 7900HT Fast Real time System。讀取臨界循環(huán)數(shù)(CT)進(jìn)行記錄分析。以正常對(duì)照細(xì)胞為矯正樣本，用比較閾值法計(jì)算目的基因的相對(duì)含量(2-△△ct)。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞足細(xì)胞凋亡足細(xì)胞以4×108/L的密度接種于六孔板，每孔2 ml，分化7～14d后，將細(xì)胞分組，各組給予相應(yīng)藥物刺激，繼續(xù)培養(yǎng)24h。按照Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明步驟進(jìn)行操作。以不含EDTA的0.5 g/L胰酶消化細(xì)胞,輕輕吹打收集細(xì)胞,室溫下1 500 r/min離心4 min,棄上清,將細(xì)胞重懸于500 μL結(jié)合緩沖液,加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，避光室溫反應(yīng)10 min,1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

Nrf2干擾對(duì)足細(xì)胞損傷的影響使用LiPofectamine RNA iMax將 si-Nrf2 和對(duì)照siRNA-NC轉(zhuǎn)染足細(xì)胞(密度約 80%)，si-RNA轉(zhuǎn)染按產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行；轉(zhuǎn)染24～48h 后加入PAN處理24h，收集細(xì)胞分別用于qRT-PCR，Western Blot 印跡，流式細(xì)胞分析。si-Nrf2的具體序列如下：si -Nrf2:5′-G-C-C-U-G-U-A-A-G-U-C-C-U-G-G-U-C-A-U-T-T-3′和5′-A-U-G-A-C-C-A-G-G-A-C-U-U-A-C-A-G-G-C-T-T-3′，si-NC:5′-U-U-C-U-C-C-G-A-A-C-G-U-G-U-C-A-C-G-U-T-T-3′和5′-A-C-G-U-G-A-C-A-C-G-U-U-C-G-G-A-G-A-A-T-T-3′。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用《SPSS 17.0》軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

CDDO-Me促進(jìn)Nrf2的表達(dá)和入核免疫熒光結(jié)果顯示，正常足細(xì)胞Nrf2大部分位于胞質(zhì)當(dāng)中，當(dāng)給予Nrf2激活劑后，Nrf2移位進(jìn)入細(xì)胞核中，100 nmol/L CDDO-Me 處理組Nrf2入核最為顯著(圖1A)，故選用100 nmol/L濃度CDDO-Me進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Western blot結(jié)果顯示，給予PAN刺激足細(xì)胞24h，可顯著降低總Nrf2和核內(nèi)Nrf2表達(dá)。CCDO-Me顯著促進(jìn)Nrf2入核。與PAN 損傷組相比，CCDO-Me保護(hù)組可使總Nrf2和核內(nèi)Nrf2水平基本恢復(fù)到正常水平(圖1B)(P<0.0001)。

圖1 CDDO-Me 促進(jìn)Nrf2的表達(dá)和入核A:免疫熒光觀察Nrf2 核轉(zhuǎn)位；B:Western blot檢測(cè)Nrf2總的表達(dá)和細(xì)胞核的表達(dá)；Nrf2:核因子E2相關(guān)因子2；CDDO-Me:甲基巴多索隆；PAN：嘌呤霉素氨基核苷；Normal:對(duì)照組；**:P<0.01,****:P<0.000 1

CDDO-Me促進(jìn)Nrf2下游基因表達(dá)與正常組相比，CDDO-Me組明顯激活Nrf2的下游靶基因HO-1和NOQ1的表達(dá)(P<0.001)，而PAN組Nrf2的下游靶基因HO-1和NOQ1mRNA 表達(dá)均明顯降低(P<0.05)；PAN+CDDO組HO-1和NOQ1mRNA高于PAN組(P<0.01)，進(jìn)一步證實(shí)CDDO-Me促進(jìn)Nrf2通路活化(圖2)。

Nrf2激活抑制PAN誘導(dǎo)的炎癥因子的表達(dá)與正常對(duì)照組比較，PAN處理足細(xì)胞24h,可顯著誘導(dǎo)炎癥因子TNF-α mRNA和IL-1 mRNA表達(dá)，分別上調(diào)6.4倍(6.40±0.242)和7.2倍(7.19±0.44)，與正常組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P<0.001)。相較于正常對(duì)照組，CDDO-Me單獨(dú)處理對(duì)足細(xì)胞TNF-α mRNA和IL-1 mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響，但CDDO-Me可顯著抑制PAN誘導(dǎo)的炎癥因子，與單獨(dú) PAN 組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)(圖3)。

圖2 CDDO-Me促進(jìn)Nrf2下游基因HO-1和NOQ1表達(dá)Nrf2:核因子E2相關(guān)因子2；CDDO-Me:甲基巴多索??；HO-1:人血紅素氧化酶1；NQO1:醌氧化還原酶1；PAN：嘌呤霉素氨基核苷；*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001,****:P<0.000 1

圖3 CDDO-Me 抑制PAN誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α 和IL-1表達(dá)CDDO-Me：甲基巴多索??；PAN：嘌呤霉素氨基核苷；TNF-α：腫瘤壞死因子-α； IL-1：白細(xì)胞介素1；**:P<0.01,***:P<0.001,****:P<0.000 1

Nrf2激活抑制PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡正常對(duì)照組足細(xì)胞凋亡率為(6.48±0.16)，PAN作用足細(xì)胞24h可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(22.6±0.77)，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.000 1)，CDDD單獨(dú)處理對(duì)細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯影響(P=0.92)，但CDDD-Me可顯著抑制PAN誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(P<0.000 1),同時(shí)si-Nrf2抑制足細(xì)胞Nrf2,達(dá)能顯著減弱CDDD-Me對(duì)PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，和CDDD-Me+PAN組相比si-Nrf2+CDDD-Me+PAN足細(xì)胞凋亡率顯著升高(圖4)。

圖4 CDDO-Me抑制PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡CDDO-Me：甲基巴多索隆，PAN：嘌呤霉素氨基核苷；*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001，****:P<0.000 1

Nrf2介導(dǎo)CDDO-Me對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用為進(jìn)一步明確Nrf2信號(hào)介導(dǎo)CDDO-Me對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用，將足細(xì)胞轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA(si-Nrf2)，抑制足細(xì)胞Nrf2表達(dá)，無(wú)義siRNA作為陰性對(duì)照(si-NC)，qRT-PCR和western blot結(jié)果顯示,Nrf2 siRNA可顯著抑制足細(xì)胞Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)水平(P<0.05,圖5A，B)，顯著抑制Nrf2下游靶基因HO-1和NOQ1的mRNA表達(dá)(圖5C)。si-Nrf2抑制足細(xì)胞Nrf2表達(dá)能顯著減弱CDDO-Me對(duì) PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，與CDDO-Me+PAN組相比，si-Nrf2+CDDO-Me+PAN炎癥因子表達(dá)(圖5D)。

圖5 Nrf2介導(dǎo)的CDDO-Me 對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用A：qRT-PCR顯示si-Nrf2轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后Nrf2 mRNA的變化；B:Western印記顯示si-Nrf2轉(zhuǎn)染48h后Nrf2蛋白的變化；C:qRT-PCR顯示si-Nrf2轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后HO-1和NOQ1 mRNA的變化；D:qRT-PCR顯示si-Nrf2轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后TNF-α和IL-1mRNA的變化；CDDO-Me：甲基巴多索?。籒rf2:核因子E2相關(guān)因子2；HO-1:人血紅素氧化酶1；NQO1:醌氧化還原酶1；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-1：白細(xì)胞介素1；PAN：嘌呤霉素氨基核苷；**:P<0.01,***:P<0.001,****:P<0.000 1

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞Nrf2活化后，可抑制PAN誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生和凋亡，發(fā)揮足細(xì)胞保護(hù)作用。

足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過膜的重要組成部分，腎小球足細(xì)胞病變是膜性腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化和糖尿病腎病等疾病共同的病理生理基礎(chǔ)，足細(xì)胞損傷導(dǎo)致的大量蛋白尿也是上述腎病患者腎功能進(jìn)行性惡化的重要因素。尋找保護(hù)足細(xì)胞的藥物，實(shí)現(xiàn)足細(xì)胞靶向性治療是臨床的迫切需求[5-6]。

氧化應(yīng)激可觸發(fā)足細(xì)胞損傷，引起蛋白尿[7-8]。Tan等[9]發(fā)現(xiàn)，敲除細(xì)胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD,一種在正常成年腎臟中高水平表達(dá)的抗氧化酶)小鼠對(duì)阿霉素，血管緊張素和蛋白超載等多種腎小球損傷因素更為敏感，蛋白尿，血清肌酐，組織學(xué)損傷和氧化應(yīng)激較受到刺激的野生型小鼠更為嚴(yán)重[9]。

Nrf2是機(jī)體抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要的轉(zhuǎn)錄因子[10]。生理狀態(tài)下，Nrf2主要位于細(xì)胞漿中，與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap-1)緊密結(jié)合，Keap1含有泛素連接酶Cullin3(Cul3)結(jié)合位點(diǎn)，介導(dǎo)Nrf2泛素化降解[11-12]。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，Nrf2和Keap1解偶聯(lián)，Nrf2轉(zhuǎn)移入核，結(jié)合靶基因啟動(dòng)子區(qū)域氧化應(yīng)激反應(yīng)元件(ARE)，激活多種抗氧化基因，如血紅素氧化酶1(HO-1)、苯醌還原酶(NQO1)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)等基因的表達(dá)，提高機(jī)體抗氧化能力。

大量研究表明Nrf2與腎臟疾病密切有關(guān)，在CKD動(dòng)物中，氧化應(yīng)激和炎癥與Nrf2的表達(dá)降低有關(guān)[13-15]。Nrf2下游基因的激活可以提高機(jī)體的抗氧化能力，減少炎癥，減緩腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展。

五環(huán)三萜類化合物類化合物CDDO-Me是Nrf2信號(hào)通路激動(dòng)劑,具有抗炎和抗氧化應(yīng)激作用[16]，

Hong等[17]應(yīng)用CDDO-Me治療晚期實(shí)體瘤和淋巴瘤患者時(shí)發(fā)現(xiàn)，CDDO-Me可改善患者eGFR，使人們認(rèn)識(shí)到Nrf2信號(hào)增強(qiáng)可能對(duì)CKD有益[17]。CDDO-Me共價(jià)修飾Keap1蛋白中的半胱氨酸殘基，使Keap1和Nrf2解偶聯(lián)，Nrf2得以入核。臨床試驗(yàn)表明，CDDO-Me可有效改善糖尿病腎病CKD患者的腎臟功能[18]。

Nrf2激活劑CDDO-Me是否能夠改善腎臟病患者的蛋白尿目前尚有爭(zhēng)議[14,19-20]，但多項(xiàng)CDDO-Me治療CKD，包括局灶性節(jié)段性腎小球硬化患者的臨床實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中(未發(fā)表資料)。我們觀察了CDDO-Me活化Nrf2對(duì)足細(xì)胞的影響。

借助經(jīng)典的PAN誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷模型[21-22]，我們發(fā)現(xiàn)CDDO-Me可有效活化Nrf2，表現(xiàn)為促進(jìn)基礎(chǔ)狀態(tài)和應(yīng)激狀態(tài)下足細(xì)胞Nrf2入核和表達(dá)，Nrf2下游靶分子HO-1和NQO1轉(zhuǎn)錄水平升高進(jìn)一步證實(shí)了CDDO-Me激活足細(xì)胞Nrf2。Nrf2活化后顯著抑制PAN誘導(dǎo)的炎癥因子IL-1β和TNF-α上調(diào)。Innamorato等[23]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2缺失與炎癥增強(qiáng)有關(guān)。Nrf2敲除小鼠對(duì)細(xì)菌脂多糖(LPS)誘發(fā)的炎癥表現(xiàn)出超敏性，而Nrf2誘導(dǎo)劑蘿卜硫烷則可顯著減弱LPS誘導(dǎo)的海馬組織中炎癥標(biāo)記物(誘導(dǎo)型NO合酶，IL-6和TNF-α)。研究已經(jīng)證實(shí)在壓力和多種病理生理?xiàng)l件下Nrf2和炎癥通路重要分子NF-κB信號(hào)通路之間的串?dāng)_[24-25]。最新研究則發(fā)現(xiàn)Nrf2直接下調(diào)炎癥因子轉(zhuǎn)錄[26]。足細(xì)胞Nrf2信號(hào)調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)的機(jī)制需要進(jìn)一步探索。

Nrf2活化還可拮抗PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，Nrf2 siRNA實(shí)驗(yàn)證實(shí)CDDO-Me對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用依賴于Nrf2通路的活化。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)均與凋亡密切相關(guān)。但Nrf2抗凋亡作用并不完全依賴于其抗氧化的效應(yīng)。Merchant等[2]在干細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，Nrf2缺陷型(Nrf2-/-)骨髓中活性氧水平并未升高。但Nrf2-/-造血干祖細(xì)胞(HPCs)的自發(fā)凋亡率增加，抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸不能挽救HPCs的凋亡，推測(cè)Nrf2可能促進(jìn)干細(xì)胞保護(hù)性因子，如粒細(xì)胞集落刺激因子的合成[27]。因此，足細(xì)胞中Nrf2抗凋亡作用的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。