EMS 誘變技術(shù)及其在小麥研究中的應(yīng)用進(jìn)展

李 雪，裴自友，溫輝芹，程天靈，張立生，朱 玫，王宏兵

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031；2.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031）

化學(xué)誘變技術(shù)是利用化學(xué)物質(zhì)使物種發(fā)生基因突變，這些化學(xué)物質(zhì)即為化學(xué)誘變劑。化學(xué)誘變劑分為烷化劑、堿基類似物及嵌入劑。烷化劑甲基磺酸乙酯（EMS）是目前應(yīng)用最廣泛、效果最好的一種誘變劑，其產(chǎn)生點(diǎn)突變的頻率較高，染色體畸變相對(duì)較少，對(duì)生物破壞性小，是目前最為有效的植物化學(xué)誘變技術(shù)方法之一。EMS 可以對(duì)作物的某一種特殊性狀進(jìn)行改良，對(duì)培育作物新品種和獲得特異種質(zhì)資源具有重要意義。目前，EMS 誘變技術(shù)的應(yīng)用主要集中在小麥、玉米等作物育種上。

筆者就我國在小麥EMS 誘變與鑒定、突變體庫構(gòu)建及其利用等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為今后的誘變育種提供參考。

1 小麥EMS 誘變與鑒定

通常利用植物干種子進(jìn)行EMS 誘變，也可對(duì)愈傷組織等進(jìn)行誘變處理。采用的誘變方法主要有浸泡法、滴液法、共培養(yǎng)法[1]。不同EMS 處理濃度對(duì)植物誘變影響不同，從而可以得到誘導(dǎo)不同部位、不同農(nóng)藝性狀突變的最佳EMS 濃度。薛芳等[2]在對(duì)新春11 小麥的抗性淀粉誘變研究中發(fā)現(xiàn)，0.3%是最適宜新春11 小麥的農(nóng)藝性狀突變的濃度。張維宏等[3]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)EMS 濃度為0.8%或1.0%時(shí)，處理8 h 后，幼苗接近半致死，為突變體篩選的最佳劑量。王國芬等[4]研究發(fā)現(xiàn)，pH 值為7.0，使用0.3 mol/L的EMS 處理小麥條銹菌條中27 號(hào)小種夏孢子6～8 min，達(dá)到微生物誘變最佳劑量。丁延慶等[5]分別用0.4%，0.6%，0.8%濃度的EMS 處理小麥品種貴協(xié)9 號(hào)發(fā)現(xiàn)，誘變的最適宜濃度為0.4%，濃度越高種子和幼苗的致死或畸變率越高。李曉等[6]以京411突變?nèi)后w為材料，用TILLING 技術(shù)檢測(cè)創(chuàng)建突變體，結(jié)果顯示，8，4 h 處理最佳誘變效率的EMS 濃度分別為0.9%和1.5%。程志鋒等[7]利用復(fù)合誘變技術(shù)對(duì)小麥抗葉銹近等基因系利用60Co γ 射線照射和EMS 處理，結(jié)果表明突變體最佳誘變組合是0.4%的EMS 和0.15 KGy 的60Co γ 照射。

小麥EMS 突變體的鑒定方法有表型、生理生化、分子標(biāo)記，其中，基因組靶向定位誘導(dǎo)損傷技術(shù)（Targeting Induced Local Lesions in Genomes，TILLING）是在化學(xué)誘變和PCR 定向篩選基礎(chǔ)上發(fā)展起來的檢測(cè)點(diǎn)突變的反向遺傳學(xué)研究方法，具有高通量、低成本、不依賴于基因型等特點(diǎn)，已在多種植物中得到了應(yīng)用，促進(jìn)了誘變育種的發(fā)展[8]。

2 突變體庫構(gòu)建與關(guān)鍵性狀突變體篩選

2.1 產(chǎn)量性狀突變體

通過EMS 化學(xué)誘變盛農(nóng)1 號(hào)[9]、山農(nóng)666-2[10]、山農(nóng)861[10]、山農(nóng)1186[11]、京411[6]、國麥301[12-13]、偃展1 號(hào)[14]、新春11 號(hào)[2]、豫農(nóng)201[15]、偃展4110[16]、河農(nóng)822[17]和煙農(nóng)15[18]等品種（系），分別獲得了分蘗、株高、穗部、葉部、莖部、育性、成熟期、籽粒等性狀的突變系。突變頻率因品種和處理的不同而不同，上述各性狀的突變率依次為0.18%～0.63%，0.9%～46.2%，0.2%～25.17%，0.89%～2.2%，0.49%～17.48%，0.27%～2.25%，0.27%～9.09%和0.04%～10.49%，其中，株高和葉部突變較易發(fā)生。有利性狀突變有矮稈、早熟、大粒、多蘗等性狀，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳研究所利用EMS 處理蘇麥3 號(hào)和南農(nóng)9918 干種子，獲得矮稈蘇麥3 號(hào)和矮稈寧麥9 號(hào)突變系，并將其矮稈基因分別定名為Rht23[19]和Rht_NM9[20]。

2.2 品質(zhì)性狀突變體

李曉等[6]通過TILLING 技術(shù)檢測(cè)Wx-A1 基因突變，在M2獲得了4 個(gè)可穩(wěn)定遺傳的WX-A1 突變系，其直鏈淀粉含量下降2.8%～7.4%。張紀(jì)元等[21]創(chuàng)建了寧麥9 號(hào)不同高分子量谷蛋白亞突變系，發(fā)現(xiàn)在M1HMW-GS 缺失突變頻率為4.65%，缺失亞基涉及Ax1，Bx7，By8，Dx2 和Dy12，突變頻率為0.24%～3.28%；在M3獲得Ax1，Dx2，Bx7，By8 和Dy12 缺失突變體，及Ax1＋By8 雙缺失突變體。同樣，在豫農(nóng)201 和河農(nóng)822 突變體中，篩選到缺失不同類型亞基的突變體。EMS 誘變對(duì)小麥淀粉理化特性的影響研究表明，EMS 處理后濟(jì)麥20、濟(jì)麥22 誘變材料糊化黏變異度系數(shù)分別為12.25%～25.48%和30.92%～40.61%；濟(jì)麥22 誘變材料直鏈淀粉含量較未誘變材料明顯有所下降，而濟(jì)麥20 無明顯變化；濟(jì)麥22 誘變材料抗性淀粉含量明顯高于濟(jì)麥20[22]。在經(jīng)0.7%EMS 處理獲得新春11 誘變后代中，也獲得豐富的高抗性淀粉含量的突變體[2]。柳學(xué)余等[23]利用γ 射線、微波與EMS 復(fù)合處理改良小麥品質(zhì)，獲得了高蛋白、高面筋和高賴氨酸突變體。

2.3 抗逆性突變體

在抗旱性篩選試驗(yàn)中，王瑾等[24]分別對(duì)抗旱性差的小麥品種溫麥6 號(hào)和周麥17 進(jìn)行花藥愈傷組織及幼胚愈傷組織EMS 處理，將再生植株接種到PEG 濃度為80 g/L 的生根培養(yǎng)基中，經(jīng)過抗旱篩選，抗旱植株有13 株，平均變異率為5.8%。

2.4 感病突變體

利用EMS 處理攜帶Pm21 基因的高抗白粉病小麥品種南農(nóng)9918，經(jīng)多代白粉病鑒定，獲得了一個(gè)遺傳穩(wěn)定、全生育期感白粉病的單位點(diǎn)隱性突變材料NM14，其對(duì)所有檢測(cè)的23 個(gè)生理小種都表現(xiàn)感病性，其中，18 個(gè)達(dá)到最高感病級(jí)別[25]。張維宏等[3]用EMS 處理小麥抗葉銹病近等基因系TcLr19種子，獲得M36-2，M333-8，M333-9，M333-11，M344-4，M396-8 等6 個(gè)M3感葉銹病突變材料。李韜等[26]從高抗赤霉病小麥地方品種黃方柱和海鹽種的突變后代中，篩選到F6，F(xiàn)9，F(xiàn)12，Y6，Y7 和Y9 等6 個(gè)突變體，其病小穗率均顯著高于相應(yīng)野生型，均達(dá)到中感及高感水平，這6 個(gè)突變體材料成為日后研究赤霉病擴(kuò)展抗性的理想材料。通過對(duì)抗黃矮病的小麥- 中間偃麥草易位系YW642 的誘變，陳洋等[27]篩選到18 個(gè)可以遺傳的感黃矮病突變體，為抗黃矮病基因Bdv2 的克隆和功能基因組學(xué)研究奠定了材料基礎(chǔ)。

2.5 抗病突變體

施巾幗等[28]研究表明，EMS 為小麥白粉病抗性基因的有效誘變劑，EMS 的適宜處理濃度為0.3%左右，試驗(yàn)中3 個(gè)小麥品種（原冬3 號(hào)、京冬6 號(hào)及農(nóng)大142）平均抗白粉病突變體出現(xiàn)頻率為0.33%，高于γ 射線（0.27%），低于電子束（0.46%）和NaN3（0.56%）處理的突變頻率。

2.6 誘導(dǎo)小麥條銹菌毒性突變

王國芬等[4]根據(jù)不同處理緩沖液的pH 值，對(duì)小麥條銹菌夏孢子萌發(fā)率的誘變條件進(jìn)行優(yōu)化，確定其最佳誘變劑量。利用EMS 處理小麥條銹菌CY17和CY31 的夏孢子誘發(fā)其毒性突變，用抗條銹Yr 近等基因系篩選毒性突變體，獲得了4 個(gè)CY17 突變菌株和1 個(gè)CY31 突變菌株，突變率在2.14×10-6～3.68×10-5，各品種病菌突變頻率差異顯著。對(duì)突變菌株毒性測(cè)定結(jié)果表明，CY17 的所有突變菌株對(duì)Yr12 抗病基因表現(xiàn)出毒性增強(qiáng)，而CY17 和CY31 的所有突變菌株對(duì)Yr5，Yr10，Yr15 和Yr24等4 個(gè)抗病基因表現(xiàn)無毒性。研究證實(shí)，毒性突變是小麥條銹病菌毒性變異的重要途徑[29]。

2.7 創(chuàng)育小麥異源易位系

向普通小麥導(dǎo)入外源物種有益基因的最好方式是導(dǎo)入攜有目的基因的外源染色體片段（易位系），而且外源染色體片段越小越好。易位系可在遠(yuǎn)緣雜交、回交等過程中自發(fā)產(chǎn)生，但頻率很低，也可通過組織培養(yǎng)、物理和化學(xué)誘變等方法來創(chuàng)制易位系[30]。敬樊等[31]通過EMS 處理高抗條銹病的小麥-華山新麥草二體異附加系種子，利用基因組原位雜交方法在930 個(gè)M2單株中共檢測(cè)出了61 個(gè)含有小麥- 華山新麥草易位染色體的單株，其中，20 個(gè)單株為小麥- 華山新麥草易位系，26 個(gè)單株為小麥- 華山新麥草易位- 易位附加系，易位頻率達(dá)6.56%；并確立1.0%EMS 處理為誘導(dǎo)小麥- 華山新麥草染色體易位的最適濃度。

3 突變庫的利用

WANG 等[32]對(duì)ms1e 突變體和野生型進(jìn)行了全基因組重測(cè)序，各測(cè)了大概520 Gbp 的數(shù)據(jù)，然后mapping 至w7984 以及TGAC 基因組上，使用重測(cè)序獲得的標(biāo)記最終將基因鎖定在198 kb 的物理區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間預(yù)測(cè)有9 個(gè)基因。進(jìn)一步利用其他EMS突變體完成了MS1 基因的圖位克隆（PNAS-MS1）。小麥持綠突變體在衰老后期葉綠素基本不降解或降解很慢，且仍然保持較強(qiáng)的光合作用，能夠大幅提高生物量，WANG等[33]利用持綠性小麥突變體tasg1為材料的研究表明，細(xì)胞分裂素代謝改變?cè)谕蛔凅wtasg1 持綠變異過程中起著重要作用。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素與氮代謝相互作用、調(diào)控蔗糖代謝，進(jìn)而調(diào)控突變體tasg1 生育后期延緩衰老的過程。特別是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所賈繼增等研究團(tuán)隊(duì)在克隆與解析我國特有小麥太谷核不育基因Ms2 方面獲得突破性進(jìn)展[34]，研究發(fā)現(xiàn)，該基因沒有保守的功能結(jié)構(gòu)域，是僅存在于小麥族物種中的“孤兒”基因；Ms2 的產(chǎn)生經(jīng)歷了一個(gè)比較復(fù)雜的進(jìn)化過程；一個(gè)新的非自主型的TRIM反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入到Ms2 基因的啟動(dòng)子區(qū)，激活了該基因并使其在花藥中特異表達(dá)，導(dǎo)致不育表型的產(chǎn)生。ZHANG 等[35]明確晚抽穗突變體m605（來自小麥偃展4110EMS 突變體庫）的抽穗期表型是由1 對(duì)隱性基因控制的，命名為TaHdm605，并將花期調(diào)控基因TaHdm605 精細(xì)定位于3DL 染色體1.86 Mb 的物理區(qū)間內(nèi)。ZHANG 等[36]以高稈大粒突變體M8008 為材料，進(jìn)行小麥籽粒大小和產(chǎn)量性狀的QTL 分析，籽粒性狀的QTL 在染色體2D 上分別形成1 個(gè)QTL 簇，SSR標(biāo)記wmc41 主要與粒度性狀相關(guān)；wmc25-barc168區(qū)間的簇是與產(chǎn)量性狀相關(guān)。

研究人員利用RNAi，RNA-Seq 及TILLING 突變體篩選相結(jié)合的策略，對(duì)Psy1 調(diào)控面粉顏色的分子機(jī)制進(jìn)行探索。ZHAI 等[37]研究表明，RNAi 轉(zhuǎn)基因植株籽粒Psy1 表達(dá)降低54%～76%，黃色素含量下降26%～35%，證明Psy1 對(duì)小麥籽粒黃色素合成有重要影響。次級(jí)代謝途徑和核心代謝途徑上的45 個(gè)候選基因構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，協(xié)同響應(yīng)Psy1 表達(dá)下調(diào)。天冬氨酸富集區(qū)（DXXXD）是Psy1重要功能結(jié)構(gòu)域，其附近保守核苷酸通過調(diào)控基因表達(dá)、酶活性及選擇性剪接等影響黃色素合成?；ê?4 d 是小麥籽粒Psy1 表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵時(shí)期。

4 EMS 誘變技術(shù)研究利用展望

隨著小麥基因組的不斷完善，定位基因變得相對(duì)容易，小麥基因功能和調(diào)控機(jī)制研究越來越重要。目前來看，小麥遺傳轉(zhuǎn)化效率較低，因此，除了轉(zhuǎn)基因技術(shù)之外，利用突變體研究基因功能也是重要的手段之一。

反向遺傳學(xué)資源庫在二倍體模式生物的功能基因組研究中發(fā)揮著重要作用，但相關(guān)資源在多倍體材料中相對(duì)匱乏。普通小麥屬于異源六倍體，進(jìn)化時(shí)間很短，A，B，D 三套亞基因組之間具有很高的相似性，存在功能冗余。很多有利的隱性突變性狀不容易表現(xiàn)出來，從而不能夠被自然或人工選擇[38]。六倍體小麥要想獲得目標(biāo)基因在A，B，D 基因組中全部突變的材料，則需要進(jìn)一步雜交和自交。同時(shí)，由于單個(gè)突變單株在整個(gè)基因組水平上均含有大量的突變位點(diǎn)，還必須將突變體與野生型材料進(jìn)行雜交并連續(xù)回交，用來純化遺傳背景，以消除其他突變位點(diǎn)對(duì)目標(biāo)性狀造成的影響。

小麥- 黑麥易位系T1BL·1RS 和小麥簇毛麥易位系T6AL·6VS 是小麥染色體變異的成功案例之一，由于這些易位系導(dǎo)致的重組率降低，在轉(zhuǎn)移親緣植物外源基因的同時(shí)，可以將小麥染色體上的有利組合傳遞下去，為育種家提供便捷的選擇途徑，加快育種進(jìn)程[39]。隨著研究者的不斷深入探索，創(chuàng)建的小麥反向遺傳學(xué)資源庫-EMS 突變體將為小麥功能基因組學(xué)提供一個(gè)寶貴的遺傳資源，同時(shí)也為解析在人工或自然選擇中被忽略掉的隱性突變提供幫助，有利于改善小麥的營養(yǎng)品質(zhì)、提高小麥籽粒大小或者用來尋找開花基因新的等位變異以提高小麥對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)性等方面的研究。