中藥促凋亡機(jī)制干預(yù)甲狀腺癌的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展＊

李 俊，魏軍平，柏力萄，李 菲，吳芳瑩

（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院 北京 100053）

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)和頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤，超過(guò)90%為分化型甲狀腺癌[1]。近年來(lái)發(fā)病率在全球都呈上升的趨勢(shì)，據(jù)報(bào)道，在我國(guó)女性中，甲狀腺癌是30歲以前最常診斷的癌癥[2]。目前甲狀腺癌的治療方法主要包括手術(shù)治療、術(shù)后131I治療和促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）抑制治療，如手術(shù)禁忌、患者不接受手術(shù)或腫瘤不攝碘，可采取化學(xué)療法，但化療療效欠佳且毒副反應(yīng)大。細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)是一種有效的抗腫瘤治療方法，這可以通過(guò)抑制正常組織中的細(xì)胞凋亡反應(yīng)或增加對(duì)癌組織的凋亡反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。分子靶向藥物治療可以在細(xì)胞分子水平上針對(duì)包括參與腫瘤細(xì)胞分化、凋亡、細(xì)胞遷移、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等過(guò)程的致癌位點(diǎn)而發(fā)揮作用，已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。根據(jù)現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)研究，中藥及其活性成分對(duì)甲狀腺癌具有多方面的干預(yù)作用，其作用分子和基因靶點(diǎn)層面變化密切相關(guān)。本文旨在從促凋亡機(jī)制方面對(duì)中藥干預(yù)甲狀腺癌的實(shí)驗(yàn)研究作一總結(jié)。

1 細(xì)胞凋亡與甲狀腺癌

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞經(jīng)歷死亡以控制細(xì)胞增殖或響應(yīng)DNA損傷的機(jī)制，其特點(diǎn)是激活效應(yīng)半胱天冬酶（Caspase）和切割對(duì)細(xì)胞活力至關(guān)重要的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致DNA片段化，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞皺縮和膜起泡。由于內(nèi)部或外部刺激而被誘導(dǎo)進(jìn)行程序自殺的細(xì)胞會(huì)發(fā)生細(xì)胞凋亡，盡管對(duì)觸發(fā)細(xì)胞凋亡的詳細(xì)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的理解是不完整的，但是該過(guò)程由許多復(fù)雜蛋白質(zhì)控制，這些蛋白質(zhì)通過(guò)各種信號(hào)分子激活并排列在順序信號(hào)傳導(dǎo)模塊中[3]。細(xì)胞凋亡主要通過(guò)兩個(gè)途徑發(fā)生，第一為外在或細(xì)胞質(zhì)途徑，是通過(guò)Fas死亡受體，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）受體超家族成員觸發(fā)的。Fas在甲狀腺癌中過(guò)度表達(dá)，表明其可能刺激增殖并賦予甲狀腺癌細(xì)胞生存優(yōu)勢(shì)。第二是內(nèi)在或線粒體途徑,當(dāng)受到刺激時(shí)，細(xì)胞色素C從線粒體釋放并激活凋亡信號(hào)。這兩種途徑具有共同的最終途徑，即涉及激活一系列Caspase，裂解調(diào)節(jié)和結(jié)構(gòu)分子，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4]。凋亡異常是許多惡性腫瘤的明顯特征，主要是促進(jìn)凋亡基因與抑制凋亡基因表達(dá)失衡，使細(xì)胞存在持續(xù)惡性增殖的可能[5]。有研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌組織中有較高水平細(xì)胞凋亡，F(xiàn)as、FasL、Bcl-2及Bax的表達(dá)均明顯增強(qiáng)，提示在甲狀腺癌組織中也存在高水平的細(xì)胞凋亡，可能與腫瘤細(xì)胞增殖快而凋亡率相應(yīng)增加有關(guān)[6]。因此，從細(xì)胞凋亡角度來(lái)看，恢復(fù)腫瘤細(xì)胞的凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)，利用細(xì)胞凋亡可以將受到抑制的細(xì)胞凋亡機(jī)制重新激活，從而做到調(diào)控腫瘤細(xì)胞的程序性死亡，達(dá)到抑制癌癥細(xì)胞的目的。因此針對(duì)細(xì)胞凋亡通路的研究，對(duì)于腫瘤的抑制以及相關(guān)靶標(biāo)藥物的研究具有重要意義。一些藥物可通過(guò)抑制或下調(diào)抗凋亡活性，或通過(guò)細(xì)胞凋亡效應(yīng)物或啟動(dòng)子的刺激或上調(diào)，更直接地靶向操縱細(xì)胞凋亡，具有治療細(xì)胞凋亡途徑異常的癌細(xì)胞的潛力。

2 中藥促凋亡機(jī)制與甲狀腺癌

2.1 下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2

Bcl-2蛋白家族是內(nèi)在或線粒體凋亡途徑最重要的調(diào)節(jié)因子之一，包括促凋亡成員，如Bax，Bak，Bad，Bcl-Xs，Bid，Bik，Bim和Hrk，以及抗細(xì)胞凋亡成員如Bcl-2，Bcl-XL，Bcl-W，Bfl-1和Mcl-1[7]。Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子并在許多惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)，Bcl-2的表達(dá)增加導(dǎo)致對(duì)化學(xué)治療藥物和放射療法的抗性，而降低Bcl-2表達(dá)可促進(jìn)對(duì)抗癌藥物的凋亡反應(yīng)。此外，過(guò)表達(dá)Bcl-2可能導(dǎo)致細(xì)胞在細(xì)胞周期分裂的G0期積累，并導(dǎo)致化學(xué)抗性[8]。響應(yīng)細(xì)胞凋亡刺激，外部線粒體膜變得可滲透，導(dǎo)致細(xì)胞色素C和第二個(gè)線粒體衍生的半胱天冬酶活化劑的釋放。細(xì)胞色素C（Cytochrome C,Cyto C）從在細(xì)胞質(zhì)中釋放，即與凋亡酶激活因子1（Apaf-1）相互作用，募集并激活Caspase-9，導(dǎo)致Caspase-9酶原的活化并激活Caspase-3，激活的Caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞核裂解和細(xì)胞核破裂[8]。Apaf-1，Caspase-9和Cyto C的復(fù)合物稱(chēng)為凋亡小體?？辜?xì)胞凋亡Bcl-2成員可通過(guò)阻斷Cyto C的釋放起到細(xì)胞凋亡的抑制作用。夏枯草能抑制TT細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與活化線粒體凋亡通路有關(guān)：夏枯草作用TT細(xì)胞24 h后線粒體膜的通透性增加，Bcl-2蛋白表達(dá)水平減少，Cyto C從線粒體釋放，引起活化的Caspase-3蛋白表達(dá)增加[9]。山慈姑也能通過(guò)下調(diào)抗凋亡基因BCL—2的途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的凋亡的作用[10]。

2.2 調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax平衡

Bax是最為典型的促凋亡蛋白，自身能夠形成二聚體或者與抑凋亡蛋白Bcl-2形成異二聚體，促使凋亡信號(hào)傳遞給Caspase家族，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但這種作用更多地取決于Bcl-2和Bax之間的平衡，Bcl-2/Bax比值影響著細(xì)胞對(duì)凋亡刺激因子的敏感性和抵抗性。促凋亡蛋白經(jīng)歷翻譯后修飾，包括去磷酸化和切割，導(dǎo)致其活化和轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，引起細(xì)胞凋亡[11]。有研究結(jié)果表明甲狀腺癌組織中Bax的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌旁正常組織[12]，提示Bax在甲狀腺癌中可發(fā)揮抑癌作用。夏枯草能抑制人甲狀腺癌K1細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與Bcl-2/Bax比值降低導(dǎo)致線粒體膜的通透性增加所引起的線粒體凋亡有關(guān)[13]。姜黃素也可通過(guò)上調(diào)Bax表達(dá)、下調(diào)Bcl-2表達(dá)來(lái)抑制人甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。

2.3 抑制cMyc基因表達(dá)

cMyc是常見(jiàn)的原癌基因，其產(chǎn)物為核重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可調(diào)節(jié)10%-15%參與細(xì)胞周期，發(fā)育，凋亡和代謝的的人類(lèi)基因[15]，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的雙重功能，抑制cMyc基因表達(dá)可以抑制細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而抑制腫瘤的增殖[16]。cMyc可以選擇性地微調(diào)許多對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和癌癥進(jìn)展至關(guān)重要的重要基因的表達(dá)，其介導(dǎo)的絲氨酸生物合成途徑的激活對(duì)于營(yíng)養(yǎng)缺乏條件下的癌癥進(jìn)展是至關(guān)重要的[17]。中藥玄參和山慈菇有抑制甲狀腺癌SW579細(xì)胞增殖的作用，可能與下調(diào)cMyc表達(dá)有關(guān)，不同濃度的玄參與凋亡相關(guān)基因與cMyc表達(dá)具有量效關(guān)系[18,19]。

2.4 下調(diào)Survivin基因和蛋白表達(dá)

Survivin是IAP（The inhibitor of apoptosis family）基因家族成員，參與程序性細(xì)胞死亡和有絲分裂[20]，它在各種惡性腫瘤中大量表達(dá)，但在大多數(shù)正常分化組織中檢測(cè)不到。Survivin蛋白是最具腫瘤特異性的分子之一，其拮抗細(xì)胞凋亡促進(jìn)腫瘤相關(guān)的血管生成，并作為各種抗癌療法的抵抗因子[21,22]，還是腫瘤發(fā)病和復(fù)發(fā)的診斷生物標(biāo)志物。有研究表明所有甲狀腺腫瘤中Survivin蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)，Survivin表達(dá)的上調(diào)可能是甲狀腺上皮癌中去分化的分子標(biāo)志[23]。五味子多糖能有效抑制人甲狀腺癌細(xì)胞株SW579中Survivin基因表達(dá)，誘導(dǎo)SW579細(xì)胞凋亡并抑制腫瘤細(xì)胞增殖[24]。黃藥子則能明顯下調(diào)人甲狀腺癌細(xì)胞株SW579中Survivin mRNA和蛋白的表達(dá)而誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡[25]。另有研究指出Survivin表達(dá)下調(diào)還有助于甲狀腺癌細(xì)胞的化療耐藥[26]。因此，中藥對(duì)Survivin基因和蛋白的干預(yù)作用是癌癥藥物研究的潛在靶標(biāo)。

2.5 抑制P13K/AKT信號(hào)通路

磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K/AKT）信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)增殖等調(diào)節(jié)中起重要作用，并參與腫瘤細(xì)胞惡性增殖、轉(zhuǎn)移和血管新生等過(guò)程[27]。PI3K由p85調(diào)節(jié)亞基的異二聚體和催化亞基p110組成，其中只有催化亞基的同種型中PIK3CA在人類(lèi)癌癥中的基因中具有致癌突變或擴(kuò)增作用[28]。PIK3CA可被各種特異性結(jié)合蛋白質(zhì)因子激活，包括Ras和膜受體的各種信號(hào)，激活后PIK3CA磷酸化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate,PIP2）以產(chǎn)生磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（phosphatidylinositol(3,4,5)bisphosphate,PIP3），其將Ser/Thr激酶蛋白激酶B（protein kinase B,PKB，又稱(chēng)Akt）定位于細(xì)胞膜，并被磷酸肌醇依賴(lài)性激酶（phosphoinositide-dependent protein kinase,PDK）激活。活化的AKT磷酸化下游靶標(biāo)，包括FoxO轉(zhuǎn)錄因子、mTOR激酶，這些AKT靶標(biāo)在調(diào)節(jié)關(guān)鍵細(xì)胞功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括增殖、凋亡、葡萄糖穩(wěn)態(tài)等[29]。PI3K/AKT通路的異常激活在甲狀腺癌發(fā)生中發(fā)揮廣泛作用，可以促進(jìn)分化的腫瘤向未分化進(jìn)展[30]。靶向PTEN（gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten）腫瘤抑制基因的遺傳改變是人類(lèi)癌癥中最常見(jiàn)的體細(xì)胞突變，癌細(xì)胞中缺乏功能性PTEN導(dǎo)致PI3K途徑的下游靶標(biāo)的活化，這種作用在乳腺癌和甲狀腺癌的發(fā)病率升高有關(guān)[31]。葛根素可抑制甲狀腺癌細(xì)胞活力和誘導(dǎo)凋亡，機(jī)制可能與誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生及抑制P13K/AKT信號(hào)通路有關(guān)[32]。小檗堿可以調(diào)節(jié)甲狀腺癌細(xì)胞中PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路，從而導(dǎo)致線粒體凋亡及G0/G1細(xì)胞周期停滯[33]。因此PI3K/AKT途徑可能是中藥治療甲狀腺癌的有前景的治療靶點(diǎn)。

2.6 下調(diào)PARP的水平

多聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)是DNA修復(fù)酶，是細(xì)胞凋亡核心成員Caspase的切割底物,在DNA損傷修復(fù)與細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用，此外它還參與腫瘤發(fā)展及炎癥反應(yīng)過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)[34]。PARP家族中以PARP-1研究最多，在DNA受到損傷后其被激活，迅速募集到損傷DNA處，通過(guò)修復(fù)這些損傷從而使細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期，而抑制PARP可降低DNA修復(fù)功能[35]。多項(xiàng)研究均表明抑制PARP-1能增強(qiáng)放療及多種DNA損傷型化療藥的細(xì)胞毒作用[36]，PARP-1抑制劑已被開(kāi)發(fā)為增強(qiáng)基因毒性損傷敏感性的手段，并且正在與放化療和DNA修復(fù)能力缺陷的腫瘤中進(jìn)行臨床試驗(yàn)[37]。盡管如此，PARP-1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄控制在人類(lèi)惡性腫瘤中的機(jī)制和影響仍然很大程度上未被探索。PARP-1在雌激素受體-α轉(zhuǎn)錄激活中的作用提示PARP-1在激素依賴(lài)性癌癥中的潛在功能，最近的研究前列腺腺癌依賴(lài)于雄激素受體（AR）活性來(lái)生長(zhǎng)和存活，并且對(duì)化療具有很大的抵抗力[38,39]。有研究表明，PARP-1抑制劑能增加鈉-碘共同轉(zhuǎn)運(yùn)體（sodium iodide symporter,NIS）的mRNA的水平，并導(dǎo)致BCPAP細(xì)胞攝碘的增加，增加131I濃集在甲狀腺濾泡狀細(xì)胞而達(dá)到殺傷甲狀腺癌細(xì)胞的目的[40]。冬凌草甲素對(duì)甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞增殖有抑制作用，其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)了被剪切PARP而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[41]。蟲(chóng)草素誘導(dǎo)的CGTH W-2細(xì)胞凋亡是由Caspase7-PARP途徑介導(dǎo)的，而AR參與蟲(chóng)草素的凋亡作用[42]。今后進(jìn)一步探究PARP對(duì)腫瘤抑制作用的機(jī)制和對(duì)細(xì)胞周期的影響，可為甲狀腺癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2.7 抑制MAPK信號(hào)通路

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)為普遍存在于真核細(xì)胞中的一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其通過(guò)細(xì)胞表面受體把多種細(xì)胞外理化刺激傳導(dǎo)到胞內(nèi)。MAPK包含ERK、p38等亞族，MAPK通路在正常的通路活性條件下主要起到促進(jìn)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄、促進(jìn)細(xì)胞增殖、避免細(xì)胞過(guò)早凋亡等作用[43]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)MAPK信號(hào)通路的過(guò)度活化直接參與惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，其過(guò)度活化時(shí)應(yīng)能刺激腫瘤細(xì)胞的增殖及抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[44]。有研究證明在甲狀腺乳頭狀癌中可檢測(cè)到MAPK信號(hào)通路的過(guò)度激活，且這種過(guò)度活化與BRAF基因的變異有關(guān)[45]。小檗堿可以調(diào)節(jié)甲狀腺癌細(xì)胞中PI3K-AKT和MAPK信號(hào)通路，從而導(dǎo)致線粒體凋亡以及G0/G1細(xì)胞周期停滯和抑制性遷移，是治療甲狀腺癌的有希望的化學(xué)療法[33]。姜黃素以劑量依賴(lài)性方式顯著抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株K1活力并促進(jìn)其凋亡，這與Bcl-2表達(dá)的降低以及PARP的切割的增多有關(guān)[46]。因此，對(duì)MAPK信號(hào)通路在甲狀腺癌中促凋亡機(jī)制的深入探索及臨床研究的開(kāi)展可為未來(lái)的研究提供方向。

3 總結(jié)和展望

綜上所述，提高對(duì)分子遺傳缺陷和腫瘤中復(fù)雜信號(hào)調(diào)節(jié)過(guò)程的理解，尤其是細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，可以為新的靶向治療提供了基礎(chǔ)。細(xì)胞凋亡機(jī)制在中藥治療甲狀腺癌的發(fā)揮著重要的作用，許多實(shí)驗(yàn)研究都結(jié)合信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及分子、基因等為中藥治療甲狀腺癌的促凋亡機(jī)制作了有益的探索，將有助于發(fā)現(xiàn)新的靶向藥物和基于靶向腫瘤特異性分子缺陷的臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)。其他如NF-κB通路、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)和Ras等途徑也可促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡，其具體作用還有待進(jìn)一步探索。但是，應(yīng)該指出的是中藥治療甲狀腺癌的效應(yīng)途徑不僅限于此，大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，調(diào)節(jié)甲狀腺癌細(xì)胞周期、抑制轉(zhuǎn)移和侵襲、誘導(dǎo)自噬、輔助放療化療等過(guò)程也是其發(fā)揮治療作用方式。因此，中藥抗腫瘤的機(jī)制可能是通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑、多層次協(xié)同作用的結(jié)果，這些具體作用途徑及相應(yīng)的效應(yīng)機(jī)制也應(yīng)是今后深入的研究的重點(diǎn)，由于目前尚缺乏中藥治療甲狀腺癌癥大規(guī)模臨床研究，故中藥治療甲狀腺癌的推廣尚需進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。