Fstl1-TGF-β1-Smad2/3信號(hào)通路與肺纖維化的靶向治療

楊 華，張莉莉

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是以上皮細(xì)胞受損、成纖維細(xì)胞增殖活化、細(xì)胞外基質(zhì)聚積、肺泡不可逆性破壞為主要特點(diǎn)的肺間質(zhì)性疾?。╥nterstitial lung diseases，ILDs）， 是多種間質(zhì)性肺病的終末期改變。在纖維化肺疾病中，繼發(fā)于結(jié)締組織病的肺纖維化 （connective tissue diseaseassociated interstitial disease，CTD-ILD） 常常以組織病理學(xué)的不同類型為特征，不同的病理類型對(duì)藥物的反應(yīng)不一，而特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是臨床較為常見的疾病，病因未明，具有漸進(jìn)性和致死性。兩類肺纖維化具有異質(zhì)性，又有共同的致纖維化途徑［1］。肺纖維化常見癥狀有咳嗽、進(jìn)行性呼吸困難、乏力等，晚期多因呼吸衰竭而死亡，半數(shù)可伴杵狀指和發(fā)紺。由于肺纖維化預(yù)后差，致殘率和致死率高，藥物療效有限，嚴(yán)重威脅患者的生活質(zhì)量和生存率，成為近年來(lái)診治的難點(diǎn)而備受關(guān)注。

目前IPF病因和發(fā)病機(jī)制都不很清楚，可能與環(huán)境（如接觸金屬和木粉）、吸煙、藥物、遺傳、病毒感染等因素相關(guān)。新近一項(xiàng)研究報(bào)告顯示，美國(guó)IPF 的患病率是（14.0～42.7）/10 萬(wàn)人口［2］，但我國(guó)缺乏相應(yīng)的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)根據(jù)國(guó)內(nèi)十幾家綜合醫(yī)院就診資料發(fā)現(xiàn)，近10年我國(guó)住院的IPF患者的比例呈明顯的上升趨勢(shì)。由于IPF預(yù)后較差，發(fā)病率及病死率呈逐年增加的趨勢(shì)，根據(jù)歐洲10個(gè)國(guó)家統(tǒng)計(jì)機(jī)構(gòu)提供的1999年—2012年間的IPF死亡率，年齡標(biāo)準(zhǔn)化死亡率為4～10/10萬(wàn)人口，且與年齡呈正相關(guān)，男性多發(fā)［3］。IPF久治不愈的主要原因是對(duì)IPF發(fā)病機(jī)制缺乏正確的認(rèn)識(shí)，因而缺少特異性的高效治療藥物及措施。早先免疫抑制劑被認(rèn)為是IPF的重要治療手段，糖皮質(zhì)激素聯(lián)合硫唑嘌呤或環(huán)磷酰胺甚至效果更優(yōu)，但2015年更新的ATS/ERS/JRS/ALAT臨床實(shí)踐指南明確不推薦強(qiáng)的松+硫唑嘌呤+N-乙酰半胱氨酸，同時(shí)不推薦使用的還有抗凝劑華法林、選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑安倍生坦、單靶位酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼，有條件地推薦使用多靶位酪氨酸激酶抑制劑尼達(dá)尼布、吡菲尼酮、抗酸治療［4］。氧療只是一種對(duì)癥的手段，不能從根本上治愈肺纖維化；而肺移植在我國(guó)面臨供體稀缺的問(wèn)題，能接受肺移植的患者極少；目前臨床各種藥物只是延緩肺纖維化的進(jìn)程，并不能阻止或逆轉(zhuǎn)肺纖維化的發(fā)展。

近年來(lái)，隨著對(duì)肺纖維化發(fā)病機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子在疾病發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中起到非常關(guān)鍵的作用，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor，TGF-β）信號(hào)傳導(dǎo)通路與肺纖維化關(guān)系密切，基于此，為尋求治療的新途徑，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了以其為靶點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)性肺纖維化治療研究。該文就肺纖維化中TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路及其靶向治療做一綜述。

1 TGF-β家族及影響肺纖維化的信號(hào)通路

TGF-β超家族是包含多種多肽類生長(zhǎng)因子的家族，主要有TGF-β、骨形成蛋白（bone morphogenic protein，BMP）、激活素、抑制素、穆勒氏管抑制物質(zhì)（Mullerian inhibitor substance，MIS）、生長(zhǎng)分化因子等，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、成骨分化、細(xì)胞外基質(zhì)沉積等。TGF-β超家族成員有以下共同特征：（1）N-末端有1段信號(hào)肽序列，可借以跨過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；（2）緊靠生物活性區(qū)有由4個(gè)氨基酸殘基（RSRR）組成的蛋白酶加工位點(diǎn)；（3）C-末端包含 9個(gè)保守的半胱氨酸的生物活性區(qū)，靠分子間的二硫鍵形成二聚體。

業(yè)已證實(shí)，纖維增生的病理基礎(chǔ)是成纖維細(xì)胞活化和廣泛的基質(zhì)重塑。促纖維化因子刺激成纖維細(xì)胞過(guò)度表達(dá)纖維化基質(zhì)蛋白，促使更多的促纖維化細(xì)胞因子表達(dá)。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）可以預(yù)示成纖維細(xì)胞活性，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞（alveolar epithelial cells，肺泡上皮細(xì)胞）通過(guò)TGF-β介導(dǎo)的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化能通過(guò)CTGF的產(chǎn)生激活肺成纖維細(xì)胞（lung fibroblast，LF）［5］。在哺乳動(dòng)物體內(nèi) TGF-β 有 3 種亞型，TGF-β1 和 TGF-β2 促進(jìn)瘢痕組織形成，而TGF-β3有抗瘢痕形成的作用。TGF-β1是一個(gè)多功能的細(xì)胞因子，參與調(diào)控發(fā)病機(jī)制方面是非常明確的，在肺纖維化發(fā)病過(guò)程中起著中樞調(diào)控的重要作用，是作用最強(qiáng)的致纖維化因子。TGF-β1在組織損傷修復(fù)過(guò)程主要通過(guò)誘導(dǎo)下游經(jīng)典的Smads（drosophila mothers against decapentaplegic protein）蛋白信號(hào)通路和非經(jīng)典的Smads信號(hào)通路，參與肺泡上皮細(xì)胞的增殖、凋亡、自噬，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的分化，促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，MF）的增殖、遷移、侵襲，并維持成纖維細(xì)胞持久生存，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，在IPF發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段起著主要的促進(jìn)作用［6］。

2 以 Fstl1-TGF-β1-Smad2/3信號(hào)通路為靶位點(diǎn)的抗纖維化治療

2.1 以Fstl1為靶位點(diǎn)的抗纖維化治療卵泡抑素樣蛋白 1（follistatin-like 1，F(xiàn)stl1）是一種細(xì)胞外的分泌型糖蛋白，富含半胱氨酸，隸屬酸性分泌蛋白家族，具有多種生物學(xué)功能，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化、代謝等多種病理生理過(guò)程，并通過(guò)激活多種信號(hào)通路發(fā)揮作用。TGF-β1在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控Fstl1表達(dá)，有研究表明鼠肺成纖維細(xì)胞TGF-β1調(diào)控 Fstl1表達(dá)上調(diào)，TGF-β1-Smad3-c-jun通路在這一過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用［7］。Fstl1可以通過(guò)促進(jìn)TGF-β1/Smad2/3信號(hào)通路來(lái)調(diào)控成纖維細(xì)胞的活化和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，上調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)，具有促纖維化作用［8］。Fstl1的缺失對(duì)小鼠的肺臟發(fā)育及氣管重塑等方面都有不同程度的影響［9，10］。有研究者通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)充分證實(shí)了使用Fstl1中和抗體能減少小鼠肺纖維化的發(fā)展［8］。葛根素提取物能改善百草枯所致的肺纖維化，研究發(fā)現(xiàn)葛根素提取物主要是通過(guò)抑制微小RNA-21（miR-21）的表達(dá)拮抗 Fstl1通路和氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制炎癥和成纖維細(xì)胞增殖，達(dá)到減輕肺纖維化的目的［11］。大量研究表明，F(xiàn)stl1在肺纖維化、炎癥、代謝等方面起著重要的作用，隨著蛋白組學(xué)在臨床上的深入研究，F(xiàn)stl1的功能及其作用機(jī)制將會(huì)進(jìn)一步明確，具有潛在的靶向治療前景。

2.2 以TGF-β1為靶位點(diǎn)的抗纖維化治療

2.2.1 相關(guān)的治療藥物 首先吡非尼酮已被證明是細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)劑，抑制TGF-β1、血小板衍化生長(zhǎng)因子（PDGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）的表達(dá)，抑制腫瘤壞死因子 α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-18（IL-18）的產(chǎn)生，減少成纖維細(xì)胞增殖分化，減少膠原纖維合成和細(xì)胞外基質(zhì)沉積［12］。吡菲尼酮無(wú)論在臨床試驗(yàn)還是現(xiàn)實(shí)治療中具有良好的安全性，被FDA認(rèn)定為是突破性治療肺纖維化的藥物。有學(xué)者統(tǒng)計(jì)了自1995年以來(lái)收錄于Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)吡菲尼酮治療IPF的相關(guān)文獻(xiàn)，IPF中位生存期2.8～4.2年，5年生存率為20%，吡菲尼酮有良好的耐受性，可以延緩用力肺活量 （forced vital capacity，F(xiàn)VC）下降，增加6分鐘步行試驗(yàn)距離、延長(zhǎng)無(wú)進(jìn)展生存期 （progression-free survial，PFS）、降低死亡率。然而為了達(dá)到能夠耐受長(zhǎng)期用藥以從中獲益的目標(biāo)，加強(qiáng)藥物不良反應(yīng)的監(jiān)管至關(guān)重要，主要治療相關(guān)不良事件有胃腸道不適、皮疹和光敏性。為減少藥物對(duì)胃腸道的刺激，結(jié)合藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，該藥宜在進(jìn)餐時(shí)服用［13，14］。新近有報(bào)道采取吡菲尼酮吸入或肺內(nèi)給藥的方式治療百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化模型鼠，通過(guò)比較形態(tài)學(xué)、羥脯氨酸含量、TGF-β1、TNF-α、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑 1（TIMP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）等指標(biāo)的變化與口服給藥對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩者療效相似但吸入給藥用劑量少、不良反應(yīng)少，認(rèn)為吸入給藥具有很大的潛力［15］。中藥川芎嗪不僅可以改善肺臟血液循環(huán)，還可以對(duì)抗脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，我國(guó)學(xué)者對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠模型應(yīng)用丹參聯(lián)合川芎嗪腹腔注射，發(fā)現(xiàn)可下調(diào)大鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中TGF-β1的表達(dá)水平，減輕肺泡炎癥和肺組織纖維化的進(jìn)程［16］。再者，如它與血管內(nèi)皮功能關(guān)系密切，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、維持血管通透性、促組織纖維化等方面發(fā)揮作用，與TGF-β、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 （fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）等共同參與氣道重塑。血管改變是氣道重塑的特征之一，研究表明，以布地奈德預(yù)處理成纖維細(xì)胞可抑制磷酸化Smad3水平，降低TGF-β1表達(dá)及其誘導(dǎo)的VEGF產(chǎn)生，抑制細(xì)胞外基質(zhì)合成［17］。霧化吸入局部用藥作用直接，不良反應(yīng)小，有望成為臨床抗肺纖維化治療的新選擇。維生素D能抑制肺超微結(jié)構(gòu)病變，顯著減少肺組織內(nèi)細(xì)胞基底膜的厚度，降低羥脯氨酸水平，下調(diào)TGF-β1的表達(dá)，從而抑制成纖維細(xì)胞增殖活化，有效地減輕肺纖維化的進(jìn)程［18］。

2.2.2 通過(guò)基因技術(shù)及細(xì)胞分子技術(shù)的治療 該兩項(xiàng)技術(shù)可干預(yù)TGF-β1信號(hào)通路的傳導(dǎo)，有益于肺纖維化的治療。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NDAPH氧化酶，NOX）是機(jī)體組織氧化應(yīng)激的酶類，其亞型NOX4在肺泡上皮細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞均有表達(dá)，產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡，促成肺纖維化的發(fā)生。NOX4抑制劑減弱TGF-β1介導(dǎo)的促纖維化基因上調(diào)，抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積，是抗肺纖維化治療中很有前景的靶點(diǎn)［19］。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）具有強(qiáng)大的自我復(fù)制更新能力，有多向分化潛能，具有免疫調(diào)節(jié)功能和低免疫原性，加上肺組織高容量低阻力的結(jié)構(gòu)特性，使得MSC易于肺內(nèi)沉積，在呼吸系統(tǒng)疾病中應(yīng)用廣泛?？上抡{(diào)MMP-9、TIMP-1、INF-γ、TGF-β1，減輕肺泡炎，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，減輕肺纖維化［20］。 Srour等［21］回顧分析了 17 項(xiàng)有關(guān)MSC治療博來(lái)霉素誘導(dǎo)的動(dòng)物肺纖維化模型的報(bào)告，發(fā)現(xiàn)MSC主要在初始炎癥階段而非纖維化階段發(fā)揮療效，能夠改善肺纖維化的膠原沉積和Ashcroft病理評(píng)分。

2.3 以Smads蛋白為靶分子的抗纖維化治療Smads蛋白的表達(dá)調(diào)控在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中起重要作用，Smad3通路抑制劑或提高Smad7的表達(dá)以阻斷TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可能為纖維化疾病的治療提供一種新手段。

Smad3是主要的TGF-β1/Smads信號(hào)通路活化蛋白，Smad3蛋白的正常表達(dá)是形成肺纖維化所必需的。成纖維生長(zhǎng)因子受體抑制劑ponatinib是一種多靶點(diǎn)激酶抑制劑，主要用于治療白細(xì)胞。但研究表明ponatinib通過(guò)抑制TGF-β1/Smad3通路，抑制TGF-β1介導(dǎo)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和Ⅰ型肺泡上皮（AT1）凋亡，抑制成纖維細(xì)胞增殖，延緩肺纖維化進(jìn)程，拓寬了 ponatinib的治療領(lǐng)域［22］。 miRNA 的表達(dá)與IPF密切相關(guān)。博來(lái)霉素誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有利于胸膜間皮細(xì)胞遷移和胸膜下肺纖維化，而胸膜下肺纖維化是博來(lái)霉素肺纖維化模型鼠的病理標(biāo)志，研究發(fā)現(xiàn)纖維化模型鼠肺mir-18a-5p表達(dá)減少，而mir-18a-5p已被確定與TGF-β受體Ⅱ的mRNA的3UTR區(qū)結(jié)合，抑制TGF-β1-Smad2/3通路，因此mir-18a-5p過(guò)度表達(dá)可抑制TGF-β1介導(dǎo)的胸膜下肺纖維化，為IPF的治療提供新途徑［23］。紫杉醇是臨床上應(yīng)用廣泛的抗腫瘤藥物，研究發(fā)現(xiàn)低劑量紫杉醇通過(guò)下調(diào)mir-140抑制TGF-β1/Smad3通路，mir-140增加可導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，紫杉醇對(duì)此有表型逆轉(zhuǎn)作用，減少膠原沉積，從而發(fā)揮抗纖維化的作用［24］。因此Smad3是很有前景的抗纖維化治療靶點(diǎn)。另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究表明白介素-27（IL-27）是兼有促炎和抗炎作用的多功能細(xì)胞因子，可增加上皮細(xì)胞表型標(biāo)志物表達(dá)，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制TGF-β1/Smad通路相關(guān)蛋白的磷酸化。以Smad3特異性抑制劑SIS3對(duì)細(xì)胞預(yù)處理后，IL-27抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用顯著增強(qiáng)，從而減輕肺纖維化［25］。傳統(tǒng)中藥青蒿素除抗瘧作用外，還具有抑制生長(zhǎng)因子表達(dá)、抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用，研究發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素抑制 TGF-β1、smad2、smad3基因和蛋白表達(dá)，通過(guò)抑制TGF-β1-Smad2/3通路減輕組織炎癥和纖維化程度［26］。

Smad7是TGF-β1/Smads的信號(hào)通路最主要的負(fù)調(diào)蛋白，Smad 7蛋白的上調(diào)可以抑制肺纖維化的進(jìn)程。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；敢种苿┬炼１桨樊惲u肟酸（SAHA）通過(guò)穩(wěn)定Smad7水平，防止Smad去乙?；?，降低Smad3活性，抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化和膠原表達(dá)，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的組蛋白去乙酰化酶活性，起到抗肺纖維化作用［27］。另有研究表明甲基轉(zhuǎn)移酶set9可通過(guò)上調(diào)Smad7蛋白水平抑制TGF-β1介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)沉積和膠原產(chǎn)生，提出蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶可作為肺纖維化的治療靶點(diǎn)的可能性［28］。肺間充質(zhì)干細(xì)胞（lung resident mesenchymal stem cells，LR-MSC）成肌纖維細(xì)胞分化在IPF中起重要作用。通過(guò)比較miRNAS在LR-MSC成肌纖維細(xì)胞分化前后的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)mir-877-3p是纖維化相關(guān)miRNA，mir-877-3p螯合劑通過(guò)smad7通路抑制LR-MSC成肌纖維細(xì)胞分化，減輕肺纖維化，提示mir-877-3p具有治療肺纖維化的潛力，值得深入研究［29］。HasmiR-326調(diào)節(jié)TGF-β的表達(dá)，其水平與人類多種細(xì)胞TGF-β蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，人IPF肺標(biāo)本與非纖維化肺相比，miR-326表達(dá)顯著減少，在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型鼠TGF-β表達(dá)增加與mmu-miR-326相關(guān)，miR-326鼻腔給藥可以下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子 Ets1、Smad3和 MMP-9，上調(diào)Smad7，抑制TGF-β的表達(dá)，認(rèn)為miR-326有助于開發(fā)研制肺纖維化的治療新策略［30］。

綜上所述，雖然TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中雖然均被證實(shí)對(duì)抗肺纖維化治療有效，但用于臨床之前，仍需要進(jìn)行更加深入的研究，以確保治療的安全有效性。TGF-β1信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控是一個(gè)涉及多通路多靶點(diǎn)的復(fù)雜過(guò)程，進(jìn)一步探明TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)于發(fā)現(xiàn)肺纖維化的有效治療靶點(diǎn)、開發(fā)更有效的治療藥物及治療技術(shù)、控制肺纖維化具有重要意義。