脂肪干細胞的分離培養(yǎng)、分化及其應用

李玉秋，焦玉祥，劉銳，黃飛

（山東華思生物科技有限公司，山東 煙臺264003）

脂 肪 干 細 胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是一種間充質(zhì)干細胞，是從脂肪組織中分離得到的一種具有自我更新和多向分化潛能的干細胞，其含量約占脂肪組織的10%～20%［1］。ADSCs屬于成體干細胞，其應用完全可以回避胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESC）在應用時存在的倫理學、法律政策和安全性等多方面因素［1］。而ADSCs同 其 他 間 充 質(zhì) 干 細 胞（mesenchymal stem cells，MSCs）一樣均來源于中胚層的胚胎結(jié)締組織，均是具有多項分化能力的原始幼稚細胞，可分化為多種成體細胞。但ADSCs與其他MSCs相比更具優(yōu)勢性［2-6］：ADSCs來源充足，機體內(nèi)脂肪分布相對廣泛；取材方便，運用吸脂術即可獲得脂肪，且創(chuàng)傷較小，患者痛苦較少；ADSCs分離方法相對簡單，且產(chǎn)量較高（ADSCs的提取率為1%～2%，而骨髓干細胞的提取率僅有0.001%～0.002%）；ADSCs擴增能力強，增殖迅速，易于傳代培養(yǎng)；生物學性狀穩(wěn)定，可塑性強；可跨胚層分化；免疫排斥低等。ADSCs的優(yōu)勢使其在整形醫(yī)學、臨床醫(yī)學、再生醫(yī)學等方面均受到了研究者的青睞，本文就ADSCs的分離、鑒定及應用研究進行綜述。

1 ADSCs的提取、培養(yǎng)

ADSCs是從脂肪組織中提取的一種MSCs，最早是Zuk等［7］于2001年從吸脂術抽取的脂肪中發(fā)現(xiàn)的。隨著干細胞研究技術的發(fā)展，ADSCs的提取、培養(yǎng)、擴增、凍存技術越來越完善。其中提取分離方法包括了組織塊貼壁法、酶消化法、機械分離法（直接離心法、震蕩離心法、旋渦離心法、吸附柱法、超聲處理法）、膠原酶結(jié)合組織塊貼壁法、懸浮培養(yǎng)法等［8］。對ADSCs提取后的純化提取、培養(yǎng)條件、凍存保留等過程需要注意的問題，試劑選擇、離心轉(zhuǎn)速、傳代代數(shù)、凍存試劑、凍存過程等方面，陳猶白等［9］對其進行了詳細的分析。

ADSCs的分離提取、培養(yǎng)傳代、凍存保留的方法有很多，但讓更多研究者認可的方法是：以吸脂術法獲取新鮮脂肪，將新鮮脂肪在無菌條件下剪成脂肪粒，剔除血管、結(jié)締組織包膜；用終濃度為0.2%Ⅰ型膠原酶在37℃恒溫、恒濕環(huán)境中消化1 h；終止消化后，1 800 r/min離心獲得含有10%～20%ADSCs的 基 質(zhì) 血 管 成 分（stromal vascular fraction，SVF），用含10%胎牛血清的LDMEM重懸SVF，用200目篩網(wǎng)將單細胞過濾至培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)，通過換液傳代獲得ADSCs，用于后期實驗研究［10］。凍存液用DMSO：培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）：胎牛血清為1∶4∶5的比例混勻為佳；凍存過程以程序降溫法，于-80℃保存為宜。

2 ADSCs的生物學特征

2.1 細胞形態(tài) 我們對ADSCs培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，接種24 h后，細胞貼壁，呈圓形、短梭形或者多角形，大小不一；待細胞進入增殖期時，ADSCs逐漸伸展呈現(xiàn)長梭形，排列緊密，呈漩渦狀生長，細胞形態(tài)與成纖維細胞相似，大小均一，多角形及圓形細胞少見［11］。

2.2 特異性標記物 特異性標記物是鑒別不同細胞的理想條件，但ADSCs目前尚沒有發(fā)現(xiàn)其特異性的細胞表面分子標記物。作為干細胞，ADSCs表達干細胞特異性組合表面標記物CD90、CD105、CD73、CD44和CD166，不表達造血系細胞標記物CD45和CD34。作為MSCs，ADSCs表達所有MSCs標記物如CD10、CD13、CD29、CD44、CD54、CD73，成纖維細胞標記物CD10、CD29、CD91，基 質(zhì) 細 胞 標 記 物CD13、CD29、CD44、CD49等［12］。2013年，國際脂肪應用技術協(xié)會宣布了ADSCs的細胞表型作為其鑒別標準：新分離的ADSCs表型為CD31（-）/CD34（+）/CD45（-）/CD235a（-）；經(jīng)體外培養(yǎng)的ADSCs表型為CD31（-）/CD44（+）/CD45（-）/CD73（+）/CD90（+）/CD105（+）［13］。

2.3 ADSCs多能性鑒定 ADSCs具有多項分化的潛能，其分化成脂、成骨是其公認的譜系特異性［14］。

2.3.1 ADSCs成脂誘導分化鑒定 將培養(yǎng)成熟的ADSCs用成脂誘導液（HG-DMEM含10%FBS、10-6mol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、10 μg/ml胰島素、100μg/ml吲哚美辛）進行誘導，每3 d換1次液。2周后進行油紅O染色觀察成紅色脂滴［3］。

2.3.2 ADSCs成骨誘導分化鑒定 將培養(yǎng)成熟的ADSCs用成骨誘導液（L-DMEM含10%FBS、0.1 mol/Lβ-甘油磷酸鈉、10-7mol/L地塞米松和50 mg/L的磷酸化Vc）進行誘導，每3 d換1次液。2周后進行茜素紅染色，顯微鏡下觀察可見紅色鈣結(jié)節(jié)［3］。

2.3.3 ADSCs成軟骨誘導分化鑒定 將培養(yǎng)成熟的ADSCs用成軟骨誘導液：高糖DMEM含10%FBS、2 mg/L胰島素、3 mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、1 mmol/L丙酮酸、100 nmol/L地塞米松和10μg/ml轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）進行誘導，每3 d換1次液。3周后進行阿利新藍染色以及免疫組化檢測Ⅱ型膠原蛋白表達［15］。

2.4 ADSCs的分化研究 ADSCs具有較強的分化能力，經(jīng)過不同的誘導環(huán)境，可使其分化為三胚層源細胞。中胚層：除了脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞外，還可誘導成心肌細胞、骨骼肌細胞、血管內(nèi)皮細胞等；外胚層：神經(jīng)細胞、表皮細胞等；內(nèi)胚層：肝細胞樣細胞、胰島細胞、腎樣細胞等。

2.4.1 ADSCs向同胚層（中胚層）源細胞分化

2.4.1.1 心肌細胞 Mizuno等［16］認為10μmol/L的5-氮雜胞苷可以將ADSCs誘導成心肌細胞，但由于5-氮雜胞苷存在毒性，還需尋找能夠有效替代5-氮雜胞苷的方法。Gwak等［17］發(fā)現(xiàn)TGF-β1也能將ADSCs誘導成心肌樣細胞。宋克東等［18］研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）能誘導人ADSCs于4周后分化為心肌樣細胞，心肌肌鈣蛋白（cTn-I）、縫隙連接蛋白43（Con43）、肌球蛋白重鏈（MHC）呈陽性表達，表明AngⅡ可以用來替代傳統(tǒng)的誘導劑5-氮胞苷。

2.4.1.2 骨骼肌細胞 Mizuno等［16］用5%馬血清和50μmol/L氫化可的松配成的成肌誘導液，誘導ADSCs 6周后，用免疫組織化學法染色鑒定了骨骼肌特異性標記物MyoD 1和MHC的表達，并且發(fā)現(xiàn)多核細胞，表明肌管形成。Stern-Straeter等［19］發(fā)現(xiàn)，通過改變微環(huán)境同樣可以將ADSCs誘導成骨骼肌，將ADSCs與含有30%的骨骼肌衛(wèi)星細胞條件培養(yǎng)基的誘導液能很好地將ADSCs轉(zhuǎn)化為肌細胞，且成肌比例較高。Lee等［20］發(fā)現(xiàn)將ADSCs與肌源性干細胞（MDSCs）共同培養(yǎng)也可將其誘導為肌管。

2.4.1.3 血管內(nèi)皮細胞 Miranville等［21］發(fā)現(xiàn)，適當?shù)呐囵B(yǎng)條件可將ADSCs誘導成血管內(nèi)皮樣細胞。付全花等［22］研究發(fā)現(xiàn)，含10%FBS、血管內(nèi)皮 生 長 因 子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）10 ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）2 ng/ml的誘導劑將ADSCs誘導10 d后可呈 現(xiàn)“鋪 路 石”樣 內(nèi) 皮 細 胞。Volz等［23］發(fā) 現(xiàn)ADSCs成脂誘導14 d后，與血管內(nèi)皮細胞用1μl/ml R3-胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF），1μl/ml VEGF，0.4μl/ml氫化可的松，1μl/ml A2P和4μl/ml hFGF-β構(gòu)成的誘導液共同培養(yǎng)14 d，可檢測到血管內(nèi)皮細胞特異性標記物CD31和血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）。

2.4.2 ADSCs向外胚層源細胞分化

2.4.2.1 神經(jīng)細胞 Ashjian等［7］用在完全培養(yǎng)基中添加5μg/ml胰島素、0.5 mmol/L二甲基亞甲基黃嘌呤、200μmol/L吲哚美辛配制的誘導液培養(yǎng)ADSCs 14 d，約有20%～25%的細胞分化為具有典型神經(jīng)形態(tài)學特征的細胞。羊書勇等［24］用含有20 ng/ml的bFGF和20 ng/ml的表皮生長因子（EGF）以及2%B27的Neurobasal培養(yǎng)基配制的神經(jīng)誘導液，培養(yǎng)ADSCs 9 d可測到神經(jīng)球Nestin陽性，神經(jīng)球誘導分化5 d后可測到特異性抗原MAP-2陽性。

2.4.2.2 表皮細胞 Brzoska等［25］用終濃度為5μmol/L全反式維甲酸（all-trans-retinoicacid，ATRA）、10%FBS、低糖（1 000 mg/L）DMEM培養(yǎng)基配成的誘導液培養(yǎng)ADSCs 10 d，誘導表皮細胞率為80%。沙德潛等［26］發(fā)現(xiàn)用70%的基礎培養(yǎng)基、30%的成纖維細胞培養(yǎng)基上清液、10 ng/L重組人EGF組成的誘導液培養(yǎng)20 d，能有效地將ADSCs誘導成表皮細胞，而20 mol/L鹽酸法舒地爾（1HA1077）能促進其誘導分化。林文韜等［27］用2%FBS、5μmol/L ATRA、20 ng/ml EGF、10 ng/ml角質(zhì)細胞生長因子（KGF），0.1μmol/L地塞米松配成的誘導液培養(yǎng)12 d，可見表皮細胞的特異性標記物CK14呈陽性；而在誘導液中加入50%HaCaT上清液，則可增強ADSCs轉(zhuǎn)化成表皮細胞的能力。

2.4.3 ADSCs向內(nèi)胚層源細胞分化

2.4.3.1 肝細胞樣細胞 Talens-Visconti等［28］將ADSCs無血清培養(yǎng)2 d后，用20 ng/ml肝細胞生長因子（HGF）、10 ng/ml bFGF、4.9 mmol/L煙酰胺培養(yǎng)ADSCs 14 d，可將ADSCs誘導成肝細胞樣細胞。劉美媛［29］通過用5%FBS、20 ng/ml HGF、20 ng/ml FGF-4配成的低糖誘導培養(yǎng)液，誘導ADSCs 21 d后檢測到肝細胞標記物白蛋白的表達，證實ADSCs可以誘導成肝細胞樣細胞。

2.4.3.2 胰島細胞 Liu等［30］用10 mmol/L煙酰胺、1μmol/L exendin-4多肽、2 nmol/L激活素A、10 nmol/L pentastrin、123 pmol/L HGF、1%B27、N2添加劑和17.5 mmol/L葡萄糖配成的無血清DMEM分化培養(yǎng)基培養(yǎng)豬ADSCs 3 d，將誘導液的葡萄糖換成5.5 mmol/L繼續(xù)誘導15 d，檢測到胰島素促進因子（PDX-1）、胰島素基因增強子蛋白1（ISL-1）的表達，成功地誘導成了胰島樣細胞。楊光等［31］發(fā)現(xiàn)用高糖DMEM（25 mmol/L）、10%FBS、10μg/L bFGF、10 mmol/L煙酰胺直接誘導兔ADSCs 12 d，即可使其向胰島β樣細胞分化。

3 ADSCs的應用研究

3.1 美容整形 ADSCs可以分泌多種生長因子，培養(yǎng)ADSCs的上清液中含有VEGF、bFGF、HGF、胰島素樣生長因子（IGF）、血管生成素（Ang）、TGF、血小板源性生長因子（PDGF）、胎盤生長因子（PIGF）、粒細胞巨噬細胞刺激因子（GM-CSF）等多種因子［32］，因此其在促進創(chuàng)面愈合［33］、美容護膚［34］、毛發(fā)再生［35］、心肌梗死后心臟功能改善［36］等方面存在特有的功效。因ADSCs具有多向分化潛能，其可替代、修復衰老的組織細胞，并分泌高效的細胞因子營養(yǎng)組織器官，可以顯著提高機體免疫力，增加機體抗病能力，消除疲勞感，恢復體能，維持機體“年輕態(tài)”。欒芳等［37］報道用自體ADSCs對面部軟組織輪廓整形患者進行治療，是一種安全有效的整形美容方法。李俊等［38］對ADSCs在乳房整形手術中的應用進行報道。ADCSs在美容整形領域擁有廣闊的應用前景。

3.2 臨床治療 ADSCs可以誘導分化成多種細胞，因此在臨床疾病治療中有著廣闊的治療前景。（1）治療心肌相關疾?。篈DSCs可分化成心肌細胞，提高左心室功能和心室壁厚度，改善左心室的射血分數(shù)，改善整體心肌功能，可用于治療心肌梗死、慢性心臟病等［39-41］。（2）骨骼肌損傷修復：ADSCs能分化為成骨骼肌細胞并分泌一些因子，可改善肌肉萎縮狀況，促進萎縮骨骼肌再生，修復肌營養(yǎng)不良癥，增加損傷骨骼肌的收縮力量及抗疲勞能力［42-44］。（3）治療骨質(zhì)疏松：ADSCs可激活成骨細胞和破骨細胞的增殖、分化［45-46］，提高骨密度，降低骨吸收，促進骨形成，有效改善骨組織微結(jié)構(gòu)［47］，可有效促進骨質(zhì)疏松性骨缺損的修復與再生，從而達到治療的效果。（4）硬皮病治療：脂肪移植是治療硬皮病的一種常用手段，但局限性硬皮病患者移植后的脂肪成活率低。Sreeatrice等［48］發(fā)現(xiàn)用ADSCs加以脂肪移植可以緩解硬皮病裸鼠的皮膚；Magalon等［49］臨床研究發(fā)現(xiàn)，用含有大量ADSCs的血管基質(zhì)組分（SVF）進行硬皮病的治療，可以明顯改善患者的皮膚病變癥狀。（5）修復椎體損傷：ADSCs能在特定條件下誘導成骨，Tang等［50］將ADSCs與納米羥基磷灰石-膠原-聚乳酸聯(lián)合作為復合支架能有效提高與脊柱的融合率。王騰飛等［51］發(fā)現(xiàn)，ADSCs與羥基磷灰石/β-磷酸三鈣復合體能夠有效修復兔椎體損傷。（6）口腔修復：ADSCs具有多向分化及分泌多種營養(yǎng)因子的功能，其在口腔修復中存在一定的作用。趙佳佳等［52］發(fā)現(xiàn)ADSCs分泌的生長因子能夠促進口腔內(nèi)膜成纖維細胞的增殖。Tobita等［53］發(fā)現(xiàn)ADSCs和富血小板血漿混合能生成完整的牙周組織。臨床研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs可明顯增加患者牙槽骨量缺失嚴重區(qū)域的牙槽骨高度和寬度［54］；ADSCs與β-磷酸三鈣支架和重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（rhBMP-2）能修復下頜骨成釉細胞瘤切除后的骨缺損［55］。ADSCs在難愈性創(chuàng)面治療［56］、炎性腸病治療［57］、泌尿系統(tǒng)修復［58］等方面的應用均有相關報道。因ADSCs的多能分化及可分泌多種因子的優(yōu)勢，其在臨床治療中擁有巨大的治療優(yōu)勢。

4 結(jié)語

ADSCs在美容整形、臨床治療、再生醫(yī)學等方面作用巨大，具有一定的應用價值。但ADSCs的應用也存在一定問題：（1）ADSCs隨著細胞傳代次數(shù)的增加，增殖分化能力將會發(fā)生改變，表型也將發(fā)生變化，具有向癌細胞分化的潛能。這是ADSCs實際應用亟待解決的問題。（2）ADSCs可以從自身體內(nèi)的脂肪中獲得，很好地解決了倫理道德問題。但不同來源、不同部位的脂肪所提取的ADSCs的分化差異性顯著。（3）ADSCs在體外雖然可以誘導分化為多種細胞，但誘導液價格昂貴且含有與腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移有關的生長因子。誘導分化機制目前并不明確。（4）ADSCs誘導分化為其他細胞，分化后細胞的穩(wěn)定性、特異性的鑒定，誘導液的標準體系還未建立。因此，ADSCs應用的安全性及有效性還需進一步評估，誘導分化機制還需深入研究，誘導體系也需進一步明確，進而發(fā)揮ADSCs在多方面的治療作用。