鞣花酸對BRCA1沉默的三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)制

韋柳霞 何美玲 黃俊清 黃少欣 梁莉 何麗鳳 張玉梅

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是一種特殊的乳腺癌類型，占乳腺癌的15%～20%［1］，具有較高的異質(zhì)性及異型性，目前尚缺乏有效的治療靶點，預(yù)后較差［2］。乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1） 是 DNA損傷同源重組修復(fù)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因子，對維持基因組穩(wěn)定具有重要作用。研究表明，BRCA1突變與TNBC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，20%的TNBC存在BRCA1功能缺失［3-4］。鞣花酸（ellagic acid，EA）是一種存在于葡萄、石榴皮、草莓、堅果等植物組織中的多酚類植物化學(xué)物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)等特性［5］。研究發(fā)現(xiàn)EA主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡以及抑制細(xì)胞周期、血管生成、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移而發(fā)揮抗癌作用，在乳腺癌等多種腫瘤治療中顯示良好的抗癌效果［6-8］。本研究構(gòu)建BRCA1沉默的人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株，探討EA對其細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響及作用機(jī)制，為TNBC診療尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；BRCA1 siRNA和陰性對照siRNA均購自廣州銳博生物科技有限公司。轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司；BRCA1、PARP1兔抗鼠多克隆抗體購自美國Abcam公司；山羊抗兔IgG二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；高純度EA（批號：476-66-4，100 g/瓶）購自北京雅安達(dá)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MDA-MB-231細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，并于 37 °C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每 3～4 d換液傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞，并用0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，用于后續(xù)實驗。

1.3 實驗分組和siRNA轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染驗證實驗分為對照組（MDA-MB-231細(xì)胞加轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000）、陰性對照組、siRNA-1組、siRNA-2組和siRNA-3組。將對數(shù)生長期的MDAMB-231細(xì)胞接種于6孔板（3×105/孔），當(dāng)融合度為50%～60%時轉(zhuǎn)染。根據(jù)LipofectamineTM3000試劑說明進(jìn)行細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染，分別將5 μL siRNA（BRCA1 siRNA或陰性對照siRNA）和5 μL LipofectamineTM3000溶于200 μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力

1.4.1 EA對MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響 取對數(shù)生長期的單細(xì)胞懸液接種于96孔板（4×103/孔），共3板，培養(yǎng)18 h后更換新的培養(yǎng)基，每板分別加入不同濃度的 EA（0 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL和 20 μg/mL），每個處理組設(shè) 6 個復(fù)孔，于 37 °C、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。各孔加入10 μL 0.5%MTT溶液，避光孵育4 h，棄上清后加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測波長為490 nm的吸光度值（OD值），計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=［1-（EA組 OD值-空白組 OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）］×100%。同時計算各時間點EA的IC50值，確定后續(xù)實驗的藥物濃度。

1.4.2 EA對BRCA1沉默的MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響 將陰性對照siRNA和siRNA-1轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231細(xì)胞以及未轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞分別接種于96孔板（4×103／孔），培養(yǎng)18 h后更換新的培養(yǎng)基，分別加入100 μL終濃度為5 μg/mL的EA，并分別設(shè)為陰性對照組、siRNA+EA組和EA組，同時設(shè)置對照組（siRNA+LipofectamineTM3000）。每組設(shè)6個復(fù)孔，于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h、96 h。按 1.4.1 方法測定 OD 值。實驗重復(fù)3次。

1.5 RT-qPCR法檢測BRCA1和PARP1 mRNA的表達(dá)水平

收集各組細(xì)胞，按照Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，測定RNA純度及含量，按M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。引物序列由上海生物工程公司合成，以GAPDH為內(nèi)參。引物序列：GAPDH上游引物為5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，下游引物為 5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′；BRCA1上游引物為 5′-ACCTTGGAACTGTGAGAACTCT-3′，下游引物為 5′-TCTTGATCTCCCACACTGCAATA-3′；PARP1 上游引物為 5′-CGGAGTCTTCGGATAAGCTCT-3′，下游引物為 5′-TTTCCATCAAACATGGGCGAC-3′。反應(yīng)體系為20 μL。PCR 反應(yīng)條件：變性 95 °C 15 s，退火 60 °C 60 s，延伸 72 °C 15 s，40 個循環(huán)。采用 2-ΔΔCt計算mRNA的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

1.6 Western blot檢測BRCA1和PARP1蛋白的表達(dá)水平

收集并裂解各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，按BCA蛋白定量試劑盒使用說明書進(jìn)行蛋白定量分析。加入蛋白樣品（50 μg/孔），于8%聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉孵育1 h，加入一抗（稀釋比例為 1∶500），4 °C 下孵育過夜，加入二抗（稀釋比例為1∶1 000），孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光曝光檢測，凝膠成像儀觀察分析。實驗重復(fù)3次。采用Image Lab軟件分析蛋白條帶灰度值，蛋白相對表達(dá)量=PARP蛋白條帶灰度值/GAPDH內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.7 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力

將對照組、EA組、陰性對照組和siRNA+EA組細(xì)胞接種于6孔板，并于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時棄培養(yǎng)基，以無菌PBS清洗，以200 μL移液器槍頭在培養(yǎng)板每孔的中央沿垂直于橫線劃一直線。無菌PBS漂洗2次去除劃下細(xì)胞，在倒置顯微鏡下拍照并記為0 h。EA組、陰性對照組和siRNA+EA組細(xì)胞加入2 mL終濃度為5 μg/mL的EA，對照組加入2 mL不含EA的DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。倒置顯微鏡下觀察24 h、48 h時各組劃痕的愈合情況并拍照記錄。采用Image Pro Plus 6.0軟件計算各時間點劃痕寬度并計算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率（%）=［（0 h劃痕寬度-24 h（或 48 h）劃痕寬度）/0 h劃痕寬度］×100%。

1.8 Transwell小室檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力

對照組、EA組、陰性對照組和siRNA+EA組細(xì)胞消化后，加入無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×104·mL-1，分別接種于含 Matrigel基質(zhì)膠和不含Matrigel基質(zhì)膠的24孔Transwell小室上室中，每室200 μL；下室含20%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，每孔700 μL。常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出小室，PBS清洗，擦拭上室內(nèi)細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色，PDS漂洗。于倒置顯微鏡下觀察，拍照，200倍鏡下隨機(jī)選取5個視野計數(shù)并計算平均值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和Graphpad prism 7作圖。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鞣花酸對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響

MTT 實驗結(jié)果顯示，不同濃度的 EA（1～20 μg/mL）處理MDA-MB-231細(xì)胞24～72 h均能抑制細(xì)胞增殖，見表1。根據(jù)MTT實驗結(jié)果，可計算出EA作用于MDA-MB-231 細(xì)胞 24 h、48 h、72 h 的 IC50分別為13.739 μg/mL、10.645 μg/mL、5.344 μg/mL，考慮不同濃度的EA對MDA-MB-231細(xì)胞的增殖均有抑制作用，而1 μg/mL EA作用于MDA-MB-231細(xì)胞24 h內(nèi)抑制率與未加藥組無明顯差異，因此選擇5 μg/mL EA用于后續(xù)實驗。

2.2 構(gòu)建BRCA1沉默的MDA-MB-231細(xì)胞

Western blot檢測結(jié)果顯示，對照組、陰性對照組和siRNA-2組在201 kD處存在BRCA1蛋白條帶，而siRNA-1組和siRNA-3組不表達(dá)BRCA1（圖1A）。RT-qPCR結(jié)果顯示，對照組、陰性對照組、siRNA-1組、siRNA-2組和siRNA-3組的BRCA1 mRNA相對表達(dá)量分別為1.018±0.078、1.000±0.088、0.057±0.024、0.423±0.069和0.260±0.023，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=145.602，P＜0.001）。其中，對照組與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與對照組和陰性對照組相比，siRNA-1組、siRNA-2組和siRNA-3組的BRCA1 mRNA相對表達(dá)量均明顯降低（均P<0.001），且siRNA-1組的相對表達(dá)量最低，說明siRNA-1組中BRCA1基因的沉默效果最好（圖1B），因此選擇siRNA-1組的MDA-MB-231細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

表1 不同濃度的EA對MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響（±s）Tab.1 Effect of different concentrations of EA on the proliferation of MDA-MB-231 cells（±s）

表1 不同濃度的EA對MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響（±s）Tab.1 Effect of different concentrations of EA on the proliferation of MDA-MB-231 cells（±s）

aComparison of inhibition rates between different drug concentrations at the same time point，P<0.05；bComparison of inhibition rates at different time points in the same drug concentration group，P<0.05；△Compared with the 0 μg/ml EA group，P＞0.05

Concentrations of EA（μg/mL） 24 h 48 h 72 h 0 0 0 0 1 3.97±1.27b△ 11.09±1.17ab 29.75±1.51ab 5 18.13±1.80ab 24.06±1.36ab 38.78±1.89ab 10 30.29±2.70ab 38.27±1.69ab 51.89±0.93ab 20 70.48±3.53ab 78.81±4.44a 84.64±1.89a Inhibition rate（%）

圖1 沉默BRCA1對MDA-MB-231細(xì)胞中BRCA1表達(dá)的影響Fig.1 Effect of transfection of BRCA1 siRNA on BRCA1 expression in MDA-MB-231 cells

2.3 EA對BRCA1沉默的MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，作用24 h后，對照組、EA組、陰性對照組和siRNA+EA組OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.871，P=0.104）。作用 48 h、72 h 和 96 h后，4 組的OD值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，siRNA+EA組的OD值均低于對照組、EA組和陰性對照組（P<0.001），見表 2。

表2 EA對BRCA1沉默的MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響（±s）Tab.2 Effect of EA on proliferation of BRCA1 silenced MDA-MB-231 cells（±s）

表2 EA對BRCA1沉默的MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響（±s）Tab.2 Effect of EA on proliferation of BRCA1 silenced MDA-MB-231 cells（±s）

Group 24 h 48 h 72 h 96 h Control 0.433±0.029 0.559±0.013 1.031±0.031 1.565±0.091 EA 0.415±0.009 0.430±0.006 0.661±0.009 0.908±0.057 Negative control 0.433±0.025 0.455±0.006 0.640±0.028 0.834±0.038 siRNA+EA 0.392±0.006 0.414±0.007 0.428±0.009 0.687±0.032 F 2.871 171.664 793.770 260.484 P 0.104 <0.001 <0.001 <0.001 OD value

2.4 EA對BRCA1沉默的MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h和48 h后，對照組、EA組、陰性對照組和siRNA+EA組細(xì)胞的遷移率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=42.749，57.167；均 P<0.001）；兩兩比較顯示，siRNA+EA組細(xì)胞遷移率均較其他組低（P<0.01），見圖 2。

圖2 劃痕實驗檢測EA對BRCA1沉默的MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響（×100）Fig.2 Effect of EA on migration ability of BRCA1 MDA-MB-231 cells detected by scratch assay（×100）

Transwell小室遷移實驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h后，對照組、EA組、陰性對照組和siRNA+EA組細(xì)胞穿膜數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=93.250，P＜0.001）；且 siRNA+EA組的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于其他組（P＜0.001），見圖3。

圖3 Transwell小室實驗檢測EA對BRCA1沉默的MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響（×200）Fig.3 Effect of EA on migration ability of BRCA1 silenced MDA-MB-231 cells detected by Transwell chamber（×200）

2.5 EA對BRCA1沉默的MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell小室侵襲實驗結(jié)果顯示，對照組、EA組、陰性對照組和siRNA+EA組細(xì)胞穿膜數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=47.745，P＜0.001）。其中，EA組、陰性對照組和siRNA+EA組的細(xì)胞穿膜數(shù)均較對照組明顯減少（P＜0.001），且 siRNA+EA 組最少，見圖 4。

2.6 EA對BRCA1沉默的MDA-MB-231細(xì)胞中PARP1表達(dá)的影響

Western blot和RT-qPCR檢測檢測結(jié)果顯示，對照組、EA組、陰性對照組和siRNA+EA組的PARP1蛋白表達(dá)量分別為 0.49±0.03、0.30±0.02、0.36±0.01 和0.07±0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=228.194，P＜0.001）；PARP1 mRNA 表達(dá)量分別為 1.005±0.005、0.841±0.008、0.703±0.005 和 0.352±0.011，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7 790.139，P＜0.001），進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，siRNA+EA組PARP1蛋白和mRNA表達(dá)量均低于其他組（P＜0.001），EA組與陰性對照組比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖 5。

圖4 EA對BRCA1沉默的MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響（×200）Fig.4 Effect of EA on invasion ability of BRCA1 silenced MDA-MB-231 cells（×200）

圖5 EA對MDA-MB-231細(xì)胞中PARP1表達(dá)的影響Fig.5 Effect of EA on the expression of PARP1 in MDA-MB-231 cells

3 討論

TNBC的發(fā)生發(fā)展由多基因、多通路、多分子蛋白共同參與。TNBC因缺乏有效的治療靶點，內(nèi)分泌治療效果差，目前主要以蒽環(huán)類、紫杉類、鉑類等傳統(tǒng)藥物化療為主，但大多數(shù)患者化療后耐藥，療效亦不理想。有研究觀察EA對乳腺癌細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)20 μmol/L和40 μmol/L EA可抑制人乳腺癌 MCF-7細(xì)胞中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，從而影響DNA甲基化［9］。另有研究發(fā)現(xiàn)，15 μg/mL和20 μg/mL EA 可在 G0/G1期阻滯細(xì)胞周期且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制MCF-7細(xì)胞增殖［10-11］。而 WANG 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，2.5～20 μmol/L的EA作用于乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞12～48 h后，可抑制細(xì)胞的增殖和血管生成。本研究采用不同濃度的 EA（1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL 和 20 μg/mL）分別作用MDA-MB-231細(xì)胞24 h、48 h和72 h后，發(fā)現(xiàn)不同濃度的EA均可抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖，且其IC50分別為 13.739 μg/mL、10.645 μg/mL、5.344 μg/mL，因此選擇5 μg/mL EA進(jìn)行后續(xù)實驗。

BRCA1不僅可激活S期、G2/M期DNA損傷檢測點，還可激活后續(xù)的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，引起腫瘤細(xì)胞對化療藥物（如鉑類）耐藥，如BRCA1功能缺失，可使腫瘤細(xì)胞對順鉑敏感［12-13］。多項研究報道，與其他化療方案比較，BRCA1/2突變TNBC患者采用以鉑類為基礎(chǔ)的化療方案更能獲益［14-15］。本研究利用脂質(zhì)體法將BRCA1 siRNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，成功構(gòu)建BRCA1沉默的MDA-MB-231細(xì)胞，并采用5μg/mL EA處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EA作用可明顯抑制BRCA1沉默的MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，且較未沉默BRCA1的MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力降低，與上述文獻(xiàn)報道一致，說明BRCA1缺失對EA抗三陰性乳腺癌產(chǎn)生積極的影響。

王東等［16］報道，EA可破壞HEK-293細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化平衡，使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，造成細(xì)胞DNA損傷。另有研究發(fā)現(xiàn)，EA可通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad3信號通路而抑制MCF-7細(xì)胞增殖［10-11］。此外，EA還可通過PI3K、mTOR等多種信號通路發(fā)揮抗乳腺癌作用［17-19］，而這些信號通路均涉及多種DNA損傷修復(fù)的關(guān)鍵因子。聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶［poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］是參與 DNA 損傷修復(fù)的核酶，PARP1為最主要成員之一，具有DNA損傷修復(fù)、維持基因組穩(wěn)定和調(diào)控細(xì)胞代謝、增殖、凋亡等作用［20-21］。TNBC患者多伴BRCA1基因突變或缺失，致使DNA損傷不能通過HRR機(jī)制有效修復(fù)，導(dǎo)致DNA損傷不斷積累；而當(dāng)TNBC患者PARP1蛋白表達(dá)上調(diào)［22］，PARP1抑制劑可用于阻斷DNA單鏈斷裂修復(fù)，上述兩種因素共同殺傷腫瘤細(xì)胞，即為“協(xié)同致死”機(jī)制原理，這正是PARP抑制劑用于BRCA突變或缺失患者的理論依據(jù)。初步的臨床試驗研究已證實，BRCA基因突變或缺失的TNBC患者對PARP抑制劑更敏感，療效更明顯［23-25］。而在前列腺癌［26］及結(jié)腸癌［27］研究中發(fā)現(xiàn)，EA 在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中，均涉及DNA片段化從而導(dǎo)致PARP被切割裂解相關(guān)機(jī)制。為了明確BRCA1缺失及其相關(guān)DNA同源重組修復(fù)通路是否對EA抗TNBC產(chǎn)生影響，本研究利用RT-qPCR和Western blot檢測EA作用BRCA1沉默和正常的MDA-MB-231細(xì)胞后PARP1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，siRNA+EA組中PARP1 mRNA和蛋白的表達(dá)量均明顯降低，表明EA可顯著抑制BRCA1沉默的三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的PARP1表達(dá)，其作用機(jī)制可能與BRCA1缺失導(dǎo)致其相關(guān)DNA修復(fù)通路障礙有關(guān)。

綜上，EA可顯著抑制BRCA1沉默的三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，可能與抑制DNA修復(fù)通路中關(guān)鍵因子PARP1的表達(dá)，從而造成相關(guān)DNA修復(fù)通路障礙有關(guān)。但是，BRCA1突變形式多樣，EA對BRCA1突變的三陰性乳腺癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)制有待在其他三陰乳腺癌細(xì)胞中驗證，并探討更多DNA修復(fù)通路相關(guān)基因的作用。