一例糞類圓線蟲感染的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)診斷

楊瑞冰 王立富 賀平 袁東亞

糞類圓線蟲病是一種好發(fā)于熱帶及亞熱帶地區(qū)的被忽視的熱帶寄生蟲病[1,2]，由糞類圓線蟲(Strongyloidesstercoralis)和費氏類圓線蟲(Strongyloidesfuelleborni)感染而引起，前者較為常見。據(jù)Zeno Bisoffi等2013年的保守估計，全世界超過3.7億的人口被糞類圓線蟲感染[3]。

人類感染糞類圓線蟲后，可以表現(xiàn)為無癥狀感染、輕微的胃腸道癥狀、皮膚損害及伴或不伴發(fā)熱的肺部損害[4，5]。長期感染可導(dǎo)致免疫力低下、接受糖皮質(zhì)激素治療和器官移植的患者發(fā)生致命的播散性超重度感染癥狀[6,7]。因此，在感染早期作出及時診斷與治療，可根除感染以減少遠期致命的并發(fā)癥發(fā)生[3]。本文用形態(tài)學(xué)特征結(jié)合分子生物學(xué)的方法，確診了一例糞類圓線蟲感染病例現(xiàn)報告如下。

材料與方法

一、材料

糞便樣本來源于一位在中山醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室行寄生蟲檢查的患者；組織DNA小量提取試劑盒購自廣州美基生物；2×Green master mix購自Promega公司；COX1和18S rRNA基因引物合成于廣州擎科公司；EB染料購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；瓊脂糖購自上海百晶生物科技有限公司。

二、方法

1.病情問詢：對患者癥狀表現(xiàn)、生活飲食、是否有泥土接觸史等情況進行問詢。

2.顯微鏡下觀察蟲體形態(tài)特征：采用生理鹽水涂片法對患者糞便樣本進行涂片，顯微鏡下觀察。

3.DNA提取及PCR檢測：用組織DNA小量提取試劑盒按照說明書提取該蟲體的DNA。采用PCR技術(shù)，用2×Green master mix(Promega,USA)和引物對COX1及18S rRNA基因進行擴增。COX1基因引物通過犬弓蛔蟲、獅弓蛔蟲、毛圓線蟲屬鉤蟲及人蛔蟲的COX1序列設(shè)計得到。COX1基因的上游引物為5′-GTGGTTTTGGTAATTGAATGGTT-3′，下游引物為5′-ACCAGTTATACCACCTATAGTAA-3′。PCR的反應(yīng)條件為：95℃變性5 min；95℃變性50 s，53℃退火50 s，72℃延伸50 s，共35個循環(huán)；最后70℃延伸10 min。18S rRNA上游引物為5′-TCGTCCACCTTGGTGACTCT-3′，下游引物為5′-CTTCCGCGAACTCGGTGATA-3′。PCR擴增條件為95℃變性5 min；95℃變性50 s，52℃退火50 s，72℃延伸50 s,共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。通過EB預(yù)染的1%的瓊脂糖凝膠對COX1和18S rRNA PCR產(chǎn)物進行電泳。

4.PCR產(chǎn)物回收測序及比對：采用膠回收試劑盒對COX1和18S rRNA 的PCR產(chǎn)物進行回收，純化回收的PCR產(chǎn)物送Invitrogen公司測序。COX1和18S rRNA 的序列結(jié)果通過Blast進行比對分析(http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

結(jié) 果

一、病人情況

患者男，64歲，自述手癢、無力、手指疼痛2個月，于廣東省第二人民醫(yī)院就診，入院行血常規(guī)、血壓、脈搏、心率等常規(guī)及專項檢查，診斷為類風濕性關(guān)節(jié)炎，服用抗風濕藥物治療?；颊哂心嗤两佑|史，血常規(guī)結(jié)果顯示嗜酸性粒細胞增高。

二、形態(tài)學(xué)檢查

通過生理鹽水涂片法在顯微鏡下對患者的糞便樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)疑似線蟲游動。為進一步鑒定該幼蟲，對糞便中蟲體進行了清洗、富集，在顯微鏡下進一步檢查，發(fā)現(xiàn)該蟲體呈線性，半透明，尾部短，蟲體一端較鈍，一端尖細，見圖1。該蟲體的形態(tài)學(xué)特征與犬弓蛔蟲、獅弓蛔蟲、毛圓線蟲屬、鉤蟲及人蛔蟲的幼蟲十分相似。因此推斷該蟲為線蟲屬的一種，但是無法明確其具體物種。

A：×100；B：×400

圖1顯微鏡下蟲體形態(tài)

三、分子生物學(xué)檢查

為進一步明確該蟲體，采用PCR技術(shù)對該線蟲COX1及18S rRNA基因進行擴增，PCR產(chǎn)物用EB預(yù)染的1%的瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果提示該線蟲為糞類圓線蟲，見圖2。

圖2COX1和18S rRNA PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

為進一步驗證PCR結(jié)果，我們對COX1和18S rRNA 的PCR產(chǎn)物進行回收，純化后測序。測序序列通過Blast進行分析(http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。比對結(jié)果提示該蟲體的COX1和18S rRNA序列與已發(fā)布的糞類圓線蟲的序列相同(COX1 Sequence ID: KU962143.1; 18S rRNA Sequence ID: MH932096.1)，見圖3。驗證該蟲體為糞類圓線蟲。

圖3COX1和18S rRNA序列Blast分析結(jié)果

討 論

目前，糞類圓線蟲病的確診主要依據(jù)流行病學(xué)資料、病原學(xué)檢查和血清學(xué)檢查。重復(fù)多次的糞便涂片后形態(tài)學(xué)觀察為主要方法，但是漏檢率依舊很高，且糞類圓線蟲幼蟲與其他線蟲的幼蟲如犬弓蛔蟲、獅弓蛔蟲、毛圓線蟲屬、鉤蟲及人蛔蟲的形態(tài)學(xué)特征相似，增加了診斷的難度，從而導(dǎo)致臨床醫(yī)生(尤其是年輕無經(jīng)驗的臨床醫(yī)生)誤診。而ELISA檢測方法由于假陽性率較高，無法達到精確診斷的要求。寄生蟲感染的分子生物學(xué)檢測是指對寄生蟲的基因和核酸進行診斷的技術(shù)，其特異性好、靈敏度高，快速準確，適用于各種寄生蟲病的檢測和診斷，成為了最具前景的診斷技術(shù)。

糞類圓線蟲病臨床表現(xiàn)復(fù)雜，蟲體可在人體小腸繁殖，產(chǎn)生的絲狀蚴可移行到中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟等其他器官，引發(fā)自身重度感染。此外由于來自腸道的大量感染期幼蟲在體內(nèi)的移行，可將腸道的細菌帶入血流而引起敗血癥[8]。分子生物學(xué)診斷方法通過對糞類圓線蟲的鑒別基因進行擴增，并進一步測序比對，可以百分之百確診，達到及早診斷、及早治療的效果，尤其適用于免疫力低下、接受糖皮質(zhì)激素治療和器官移植后發(fā)生致命的播散性超重度感染癥狀的患者。本研究采用形態(tài)學(xué)特征觀察結(jié)合分子生物學(xué)方法診確診了一例糞類圓線蟲感染的病例，并及時提出了驅(qū)蟲治療方案。該患者在就診后服用阿苯達唑，于一個月后復(fù)查，血常規(guī)結(jié)果顯示嗜酸性粒細胞恢復(fù)正常，糞檢結(jié)合PCR檢測未發(fā)現(xiàn)糞類圓線蟲感染，病情得到緩解，提示形態(tài)學(xué)特征結(jié)合分子生物學(xué)診斷方法可為臨床寄生蟲病的及時確診提供重要保障。