誘發(fā)肺氣腫動物模型方法及評價

張丹參 李 蘭

河北科技大學(xué)，石家莊，050018，中國

肺氣腫是呼吸內(nèi)科疾病中很常見的一種慢性肺功能不全，是以逐漸破壞肺泡結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重者導(dǎo)致通氣換氣等功能障礙引起缺氧，最終會因肺心病、呼吸功能衰竭致死的疾?。?-3］。主要是指終末細(xì)支氣管遠(yuǎn)端（呼吸性細(xì)支氣管、肺泡管、肺泡）的氣道彈性降低，過度膨脹、充氣和肺容積增大或同時伴有氣道壁破壞的病理狀態(tài)［4］。其發(fā)病機(jī)制目前認(rèn)為是由于多種因素破壞支氣管壁，使管腔狹窄，形成不完全阻塞和肺內(nèi)彈性蛋白酶/抗彈性蛋白酶系統(tǒng)失衡［5］；以及肺部的慢性炎癥使白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放的蛋白分解酶增加，損害肺組織和肺泡壁，致多個肺泡融合成肺大泡或氣腫；而肺泡壁的毛細(xì)血管受壓，血液供應(yīng)減少，肺組織營養(yǎng)障礙，也引起肺泡壁彈性減退，易促進(jìn)肺氣腫［6-7］。因此，建立合適的肺氣腫動物模型是為研究肺氣腫新治療方法的關(guān)鍵。

1 動物的選擇

人們對造成肺氣腫的病因以及發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識不斷加深，其動物模型的實驗誘導(dǎo)方法也逐漸完善。但目前的問題是仍然不能夠復(fù)制出與人類肺氣腫病變特征完全相似的動物模型，也不能完全模仿人類病變的過程。常用于研究肺氣腫的動物模型有鼠類（小鼠、地鼠、大鼠、豚鼠）、比格犬、小型豬、兔到靈長類的猴［8］。鼠類最適合用于制作單純的肺氣腫模型，鼠類基因與人類基因相近，因其飼養(yǎng)方便，繁殖速度快，飼養(yǎng)費用低，研究時間周期短等優(yōu)點；小型豬的肺組織與人類較為相似，靈長類的動物肺組織模型更能接近與人類，但是選擇動物模型要充分考慮可行性、易操作性、經(jīng)濟(jì)性的角度，選擇合適的動物，對于實驗的順利進(jìn)行具有重要的影響。在對動物進(jìn)行氣管插管時，相對于大鼠和豚鼠，小型豬的氣管比較粗，利于插管。

2 誘導(dǎo)肺氣腫動物模型方法

目前，肺氣腫動物模型在制作上主要有四種方法：蛋白水解酶法［9］、煙霧吸入法［10］、化學(xué)藥物法［11］、基因誘導(dǎo)法［12］等。

2.1 蛋白水解酶法致肺氣腫模型

彈性蛋白酶通過靜脈注射、氣管內(nèi)滴入、氣管切開、霧化吸入［13］等給藥途徑來誘導(dǎo)動物模型肺氣腫，肺組織部的抗蛋白酶的平衡被滴入的彈性蛋白酶所打破，產(chǎn)生的炎癥因子能加速肺泡壁溶解、破裂與融合從而形成肺氣腫動物模型［14-15］。

蛋白水解酶法通過對兔進(jìn)行霧化吸入和靜脈內(nèi)注入木瓜蛋白酶進(jìn)行造模，能準(zhǔn)確反應(yīng)出肺氣腫的臨床特點，方法簡便，比起煙霧吸入法來，減少了勞動量和危險性，模型較為穩(wěn)定，制作時間短，不易出現(xiàn)感染及不良反應(yīng)。蛋白水解酶的方法雖然簡便且相對穩(wěn)定，但是病變往往分布不均勻并且這種方法誘導(dǎo)的病理改變?nèi)祟惓Ｒ姷挠捎陂L期吸煙引起的肺氣腫不完全一致［16］。氣管內(nèi)滴入酶液直接作用于肺部，較靜脈途徑直接且避免了血液成分的干擾；酶液定量準(zhǔn)確，避免了霧化吸入劑量不準(zhǔn)、操作復(fù)雜的缺點。總體來說，蛋白水解酶法制作的模型適應(yīng)性強(qiáng)，能根據(jù)需要在不同時間接受不同的干預(yù)措施，因此可用于肺氣腫和肺心病的發(fā)病機(jī)制、病理改變、藥物療效觀察及相關(guān)疾病手術(shù)的有關(guān)研究。

2.1.1 氣管內(nèi)滴注法致肺氣腫模型

2.1.1.1 大鼠氣管內(nèi)滴注法致肺氣腫模型 Sneha Dhapare［17］等采用氣管內(nèi)滴注的方法建立肺氣腫模型，大鼠體質(zhì)量180～200 g，腹腔注射20 mg·kg-1戊巴比妥鈉，并加入乙醚。分離暴露氣管，用4 號細(xì)針穿刺兩軟骨環(huán)間，向氣管內(nèi)快速推注3%豬胰彈性蛋白酶或木瓜蛋白酶液（1 mg·kg-1），推完后立即拔出針頭，使大鼠保持直立位，左、右來回旋轉(zhuǎn)1～2 min，使酶液盡可能均勻地達(dá)到兩側(cè)肺的深部。滴注酶液后2個月可作為肺氣腫動物模型。肺組織病理檢查可見，肺泡隔數(shù)量明顯減少，所存留肺泡隔變窄，部分肺泡隔斷裂、消失，若干肺泡融合成大圓囊，甚至肺泡管擴(kuò)張，可作為肺氣腫的形態(tài)學(xué)指標(biāo)。目前多采用氣道內(nèi)直接注射蛋白酶類來復(fù)制肺氣腫的模型。

2.1.1.2 小型豬氣管內(nèi)滴注法致肺氣腫模型 鄧丹［18］采用小型豬作為動物模型，選健康成年的小型豬15只，麻醉前4 h 禁止飲食，在耳后肌肉內(nèi)注射0.1 g·2 mL-1每支鹽酸氯氨酮注射液進(jìn)行靜脈滴注（15 mg·kg-1），麻醉后將無菌軟管的一段潤濕，經(jīng)鼻孔插入氣管，軟管外端插入無菌生理鹽水杯確定軟管在氣管內(nèi)后，將劑量為6 U·kg-1木瓜蛋白酶溶液注入氣管，然后使用生理鹽水沖管。3 d 后按照上述方法注入劑量為300 U·kg-1的豬胰彈性蛋白酶。

2.1.1.3 白兔氣管內(nèi)滴注法致肺氣腫模型 陳建新［19］采用白兔作為動物模型，選擇體質(zhì)量為1.5～2.0 kg 的健康白兔，雌雄不限，氟哌利多注射液2.5 mg·kg-1和鹽酸氯胺酮注射液50 mg·kg-1，混合注射白兔臀部肌肉進(jìn)行麻醉，直至適宜程度，內(nèi)徑為3.0 mm 的氣管插管插入兔的氣管中，使用生理鹽水稀釋胰彈性蛋白酶，按照2 000 U·kg-1的注射量，3 mL 經(jīng)氣管插管緩慢的注入兔肺氣腫模型，對照組則注入3 mL 生理鹽水作為對照組。實驗42 d 后解剖動物，分析其動物肺功能。

2.1.2 氣管切開滴注法致肺氣腫模型

Luiz Marcelo Oliveira Santos［20］采用體質(zhì)量為25～30 g 雄性瑞士小鼠，正常光照并正常喂食標(biāo)準(zhǔn)食物和水，使用氯胺酮（34 mg·kg-1）和甲苯噻嗪（12 mg·kg-1）腹腔注射麻醉小鼠，前切口暴露氣管，并滴注溶于無菌鹽水的豬胰彈性蛋白酶誘導(dǎo)肺氣腫模型組，正常對照組滴注無菌鹽水。

2.1.3 霧化吸入法致肺氣腫模型

2.1.3.1 家兔霧化吸入法致肺氣腫模型 晉云［21］等采用霧化吸入法建立動物模型。家兔體質(zhì)量1.8～2.0 kg，超聲波霧化器為自制霧化箱（70 cm×40 cm×30 cm，前面有一2 cm×2 cm 大小進(jìn)霧孔，后面及兩側(cè)各有一1 cm×1 cm 大小通氣孔）。2%豬胰彈性蛋白酶或5%木瓜蛋白酶50 mL，經(jīng)超生霧化器將酶液霧化后（直徑5 μL 以下顆粒占90%以上，50～60 mL 約4 h 霧化完）經(jīng)管道送入自制霧化箱，動物經(jīng)霧化吸入箱的開口處吸入酶的氣霧劑。每次吸入約4 h（至酶液霧化完），每周吸入一次，共3次。末次吸入后40 d，即可作為肺氣腫動物模型進(jìn)行實驗觀察。

2.1.3.2 新西蘭兔霧化吸入法致肺氣腫模型 李嫻［22］采用體質(zhì)量為2.8～3.4 kg 健康新西蘭雄性成年大白兔，飼養(yǎng)溫度為室溫，普通專用飼料飼養(yǎng)，隨機(jī)分為健康對照組及肺氣腫模型組，將2 g 豬胰彈性蛋白酶溶于150 mL 的0.9% NaCl 溶液中，倒入霧化裝置中，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，通過自制霧化箱持續(xù)性霧化等量的豬胰彈性蛋白酶，對照組吸入等量的0.9% NaCl 溶液，每周霧化一次，每次90 min，持續(xù)4周，其余時間正常喂養(yǎng)，以相同的方法處理后，正常飼養(yǎng)6周。通過外周血采集及血常規(guī)檢測、末梢血氧飽和度及心率測定、肺容積測定等方法確定造模成功。

2.2 煙霧吸入法致肺氣腫模型

將自制的煙霧彌漫在自制熏煙箱中，模型組動物將其每天吸取一定量的自制煙霧，一段時間后復(fù)制肺氣腫模型成功。

此實驗方法更適合用于小動物，需要制定特定的密閉容器，然后按計劃給予煙熏，如果體型較大的動物，可能會撞擊容器引起損傷，大動物的造模時間長，且大型動物不易控制。此模型穩(wěn)定性好。

2.2.1 大鼠煙霧吸入法致肺氣腫模型

安立［23］選擇鼠齡為6周的雄性大鼠，體質(zhì)量不超過150 g，限制其飲食，將大鼠置于自制的有機(jī)玻璃煙熏箱內(nèi)，箱頂留有直徑通氣孔，箱內(nèi)放置鈉石灰吸收CO2，以無水CaCl2吸收水蒸氣，將香煙點燃接于煙嘴上，用注射器連續(xù)吸入香煙煙霧并通過接有三通的輸液管注入箱內(nèi)，連續(xù)點燃5 支香煙產(chǎn)生煙霧，每周五天，每天90 min，共5個月。末次吸入的第二日作為肺氣腫動物模型。長期吸煙會造成肺部的巨噬細(xì)胞發(fā)生炎癥，從而導(dǎo)致支氣管管腔變狹窄和支氣管軟骨組織破損而導(dǎo)致肺泡增大、破裂、融合，形成肺氣腫。

2.2.2 新西蘭兔煙霧吸入法致肺氣腫模型

王培培［24］將雄性健康新西蘭大白兔隨機(jī)分成2組，正常對照組和煙熏模型組，煙熏組置于定制的兔籠中，上下兩層，將兔置于上層，下層放置酒精燈燃燒煙絲，早晚2次燃燒，每次燃燒15 g，每次30 min，連續(xù)70 天，正常對照組不熏煙。實驗過程中觀察動物的情況，煙熏至70 天的病兔停止煙熏1周，檢查行血氣分析、測定肺功能、處死后右肺性支氣管灌洗液分析、左肺作病理切片。

2.2.3 小鼠煙霧吸入法致肺氣腫模型

趙考昌［25］選擇鼠齡為6～8周，體質(zhì)量在20～25 g 的小鼠，將吸煙組的小鼠置于自制的煙熏箱中，每天煙熏4 h，每周煙熏5 d，連續(xù)24周，煙熏箱內(nèi)最佳煙霧和空氣的比例為1∶6，煙熏期間使用醫(yī)用氧氣艙測氧儀監(jiān)測艙內(nèi)的氧濃度使其不低于18%，正常對照組小鼠置于空氣環(huán)境優(yōu)良的空間內(nèi)，24周后以90 mg·kg-1腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉吸煙組與非吸煙組的小鼠，以HE 染色和流式染色的方法確定模型構(gòu)建的程度。

2.2.4 豚鼠煙霧吸入法致肺氣腫模型

陳輝［26］選擇12周齡的英國短毛雄性豚鼠，自制被動吸煙裝置，吸煙組的豚鼠每次10 支焦油量12 mg，煙堿量0.9 mg 的大前門牌香煙，每次持續(xù)2 h，每天2次，每周被動吸煙6 天，煙熏持續(xù)12周，對照組不做任何處理，12周后處死。通過HE 染色病理觀察到肺泡壁變薄，肺泡腔被破壞，炎癥細(xì)胞被浸泡，平均肺泡半徑大于對照組。

2.3 化學(xué)藥物法致肺氣腫模型

多種化學(xué)藥物可以引起肺部的炎癥及肺氣腫，這些藥物包括脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、氯化鎘、二氧化氮和臭氧等等。脂多糖是由呼吸道發(fā)生感染的細(xì)菌產(chǎn)生的，脂多糖是組成革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素的主要成分，化學(xué)藥物進(jìn)入肺臟后分泌一系列炎癥因子介導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)，破壞蛋白酶/抗蛋白酶系統(tǒng)，導(dǎo)致肺氣腫［27］。

化學(xué)藥物造模方法能短時間內(nèi)復(fù)制出由于吸煙所致的肺氣腫，能夠直接破壞周邊肺泡壁的結(jié)構(gòu)形成肺氣腫。

2.3.1 內(nèi)毒素法致肺氣腫模型

劉蕾［28］等采用氣管內(nèi)滴注脂多糖的建模方法，大鼠用1%的戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，仰臥位固定于大鼠固定板，暴露聲門，將18 號靜脈套管針快速插入氣管，拔出針芯，用1 mL 注射器注入溶于生理鹽水的LPS 200 μL（1 g·L-1），然后將大鼠固定板直立旋轉(zhuǎn)，使LPS 能夠均勻分布于兩肺。正常組注入生理鹽水。模型組和正常組的大鼠飼養(yǎng)3周。該模型的實驗結(jié)果顯示正常組大鼠精神狀態(tài)好，活動能力強(qiáng)，營養(yǎng)良好，被毛白皙有光澤，爪甲顏色呈淡粉色、有光澤，舌淡紅，苔薄，飲食正常，體質(zhì)量增長迅速，呼吸平穩(wěn)，無喉中痰鳴、無咳嗽、氣促等現(xiàn)象，二便正常。模型組動物在氣管內(nèi)滴注LPS 后，逐漸出現(xiàn)精神情況欠佳、咳嗽、喘促等情況，說明建模成功。

2.3.2 氯化鎘法致肺氣腫模型

Snider［29］等通過氯化鎘的方法建造肺氣腫動物模型，具體方法如下，挑選體質(zhì)量為120 g 的雄性倉鼠，并用CO2麻醉倉鼠并接受單次經(jīng)氣管內(nèi)滴注0.5 mL 0.15 mol·L-1NaCl 溶液，模擬組的倉鼠0.025% CdCl2（0.5 mL·100g-1），正常對照組不做任何處理。在5、10、21、42、105 和180 d 進(jìn)行研究，對模型組和對照組進(jìn)行生理學(xué)、形態(tài)學(xué)和生物學(xué)研究。

2.3.3 NO2法致肺氣腫模型

Wegman［30］等通過將小鼠長期放在低濃度NO2的方法造模成功，將至少圈養(yǎng)1周的小鼠暴露于20 ppm NO2的暴露室中25 d，每天維持14 h，該室具有用于氣體混合的入口和出口以及用于確保整個室內(nèi)的氣體均與分布，連續(xù)氣流調(diào)節(jié)12 L·min-1。對模型組分析其肺組織學(xué)檢查其造模程度。

3 誘發(fā)肺氣腫動物模型的注意事項

在制作過程中應(yīng)考慮動物的體質(zhì)，靜脈注射應(yīng)緩慢并注意用量，以免發(fā)生意外。并且霧化濃度及時間應(yīng)控制好，否則效果不佳。

總之，通過建立誘導(dǎo)肺氣腫動物模型是闡明其發(fā)病病因、發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵，由此對預(yù)防、治療、延緩的藥物進(jìn)行探索和篩選，為肺氣腫疾病研究提供依據(jù)梁。同時，肺氣腫動物模型構(gòu)建也為找到新治療方法奠定基礎(chǔ)。