氨基酸分析儀法批量測定小鼠皮質(zhì)和海馬中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)和牛磺酸的含量

武春陽 馬佳呈 張 楠 張丹參 張 力

1.河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北省神經(jīng)藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，張家口，075000，中國

2.河北科技大學(xué)，石家莊，050000，中國

氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)是腦內(nèi)重要的一類神經(jīng)遞質(zhì)，人腦的功能取決于興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之間的平衡［1］。谷氨酸（glutamic acid，Glu）和天冬氨酸（aspartic acid，Asp）等為腦內(nèi)興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)；甘氨酸（glycine，Gly）和γ-氨基丁酸（gammaaminobutyric acid，GABA）等為腦內(nèi)抑制性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)［2］。牛磺酸（taurine，Tau）雖不是神經(jīng)遞質(zhì)，但其在大腦中廣泛分布，具有神經(jīng)保護(hù)作用［3］。

當(dāng)前氨基酸的檢測方法主要有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）［4］和氨基酸分析儀法（amino acid analyzer，AAA）［5］，其中，AAA 的分析原理基于柱后衍生，衍生化反應(yīng)在氨基酸和其他物質(zhì)分離后發(fā)生從而避免了干擾，尤其適合于批量樣品的分析［6］。本實(shí)驗(yàn)選用A300 全自動氨基酸分析儀，旨在建立一種穩(wěn)定可靠的檢測方法，能夠?qū)Υ菩坌∈笃べ|(zhì)和海馬內(nèi)Glu，Asp，Gly，GABA 和 Tau 的含量進(jìn)行批量檢測。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

8周齡SPF 級KM 小鼠，購于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)證許可號：SCXK（京）2016-0002。SPF 級滅菌飼料喂養(yǎng)，于河北北方學(xué)院藥學(xué)系SPF 級標(biāo)準(zhǔn)動物屏障實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，達(dá)到實(shí)驗(yàn)月齡，動物飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)過程符合國家動物福利法的要求。

1.1.2 藥品與試劑

5 種氨基酸（Tau、Asp、Glu、Gly、GABA）單體標(biāo)準(zhǔn)品，購自美國Sigma 公司；游離氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品，100 nmol·mL-1，購自德國曼默博爾公司；國產(chǎn)鋰鹽試劑包，包括①茚三酮溶液；②茚三酮活化劑；③自動進(jìn)樣器清洗液；④反應(yīng)器清洗液；⑤鋰鹽流動相A～F；⑥樣品稀釋液，購于德國曼默博爾公司青島技術(shù)服務(wù)中心；5-磺基水楊酸（5-sulfosalicylic acid dihydrate），購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司；高純氮，99.999%，購自北京市北溫氣體制造廠。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

A300 全自動氨基酸分析儀，德國曼默博爾公司；Sigma 3K30 高速冷凍離心機(jī)，德國；FSH-2A 可調(diào)高速勻漿機(jī)，江蘇大地自動化儀器廠；WH-2 微型旋渦混合儀，上海滬西分析儀器廠；ME235P 電子分析天平，德國Sartorius；KQ520DV 數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UPT-I-60L 優(yōu)普系列超純水設(shè)備，成都超純水科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的配制

分別準(zhǔn)確稱取5 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（Tau，Asp，Glu，Gly，GABA）6.26，6.66，7.36，3.75，5.16 mg，超聲均質(zhì)溶解，使用超純水定容至100 mL，得到濃度為500 μmol·L-1的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 腦組織樣品的制備

小鼠生長達(dá)到6月齡、7月齡時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前，小鼠禁食不禁水12 h，隨機(jī)選取相同日齡的雌雄小鼠各3只，稱體質(zhì)量后斷頭處死，置于冰上分離剝?nèi)ツX外組織，取全腦置于4℃生理鹽水中沖洗，取出濾紙吸干，于冰上分離雙側(cè)皮質(zhì)和海馬，稱量皮質(zhì)與海馬重量后分別置于冰盒中的10 mL 離心管，根據(jù)所取腦組織重量按照一定的比例加入冰冷超純水（皮質(zhì)：水=1 g：20 mL，海馬均加1 mL）進(jìn)行勻漿，隨后低溫離心7 min（4 500 r·min-1），移取400μL上清液，加 入100 μL 10%磺基水楊酸溶液，旋渦儀混合均勻，置于4℃冰箱中冷藏靜置60 min 進(jìn)行蛋白沉淀，之后4℃低溫離心15 min（14 500 r·min-1），取400 μL 上清液加入400 μL 樣品稀釋液，旋渦儀混合均勻，后經(jīng)針孔過濾器（0.22 μm）過濾后于-20℃冰箱冷凍保存。

1.2.3 顯色試劑的活化

在加熱條件以及弱酸環(huán)境下，氨基酸與茚三酮溶液發(fā)生顯色反應(yīng)。茚三酮溶液在使用前需使用活化劑活化（100 mL 茚三酮溶液+40 mg 活化劑），需預(yù)先配好并在室溫下避光靜置4 h 以上。

1.2.4 進(jìn)樣次數(shù)

在進(jìn)行批量氨基酸檢測時(shí)，進(jìn)樣次數(shù)是有上限的，在實(shí)驗(yàn)所需的試劑中（包括茚三酮溶液、鋰鹽流動相A～F、自動進(jìn)樣器清洗液、反應(yīng)器清洗液），一次進(jìn)樣消耗最多的試劑為茚三酮12 mL，儀器內(nèi)存放的試劑瓶容量為400 mL，試劑瓶剩余液量過低（＜50 mL）時(shí)儀器報(bào)警并停止分析，故一次實(shí)驗(yàn)最多不應(yīng)超29次（＜350 mL）。一次進(jìn)樣分析所需時(shí)間為145 min，一次實(shí)驗(yàn)最長大概需要72 h（包括1 h 清洗程序和1 h 自檢程序）。

1.2.5 色譜條件

分離柱：游離氨基酸鋰鹽柱（Column kit，Lithium system）；流動相：鋰鹽試劑（A～F，pH 逐漸升高）；衍生試劑（顯色劑）：主要成分為茚三酮；緩沖液流速：180 μL·min-1；檢測波長：570 nm；分離柱初始溫度：40℃，反應(yīng)器初始溫度：70℃，且溫度隨梯度洗脫程序不斷變化；進(jìn)樣量：20 μL；使用儀器譜圖處理軟件AminoPeak 進(jìn)行數(shù)據(jù)采集處理［7］。

1.2.6 稀釋系數(shù)的計(jì)算

在含量測定的過程中，需要計(jì)算每個(gè)樣品的稀釋系數(shù)。在本實(shí)驗(yàn)中，取A g 腦組織，按照“1.2.2”樣品制備時(shí)的比例加入B mL 水，勻漿離心后，取0.4 mL樣品加入0.1 mL 10%磺基水楊酸溶液，經(jīng)過蛋白沉淀、離心、過膜后，從中取0.4 mL 加入0.4 mL 鋰鹽試劑包的樣品稀釋液，最終從旋渦混合均勻后的樣品中取20 μL 進(jìn)樣，本實(shí)驗(yàn)稀釋系數(shù)的計(jì)算方法為：（1 000/20）×（0.4+0.4）×［（0.4+0.1）/0.4］×（B/0.4）×10-6×100%=B×125×10-4（%）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 19.0 中的兩獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)對相同日齡雌雄小鼠皮質(zhì)和海馬中的5 種氨基酸含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05 表示雌雄小鼠之間氨基酸含量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性實(shí)驗(yàn)

取稀釋后的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（400 μmol·L-1）和按照“1.2.2”項(xiàng)下處理的皮質(zhì)及海馬樣品溶液在“1.2.5”色譜條件下進(jìn)樣分析，根據(jù)保留時(shí)間判定氨基酸的種類。由Fig.1 可知，樣品中Tau、Asp、Glu、Gly 和GABA 5 種氨基酸的峰形良好，分離度較高。

2.1.2 線性關(guān)系

精密吸取“1.2.1”項(xiàng)下配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度為400，200，100，40，8 μmol·L-1的溶液，在“1.2.5”色譜條件下進(jìn)樣，每個(gè)濃度進(jìn)樣3次，得到以Tau，Asp，Glu，Gly 和GABA 五種氨基酸濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)的回歸方程，結(jié)果見Tab.1。結(jié)果顯示，在8～400 μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)，5 種氨基酸的線性良好。

Tab.1 Standard curves，linear ranges and coefficients of five amino acids（n=3）

2.1.3 檢測限與定量限

以信噪比S/N=3 確定5 種氨基酸的最低檢出限，以信噪比S/N=10 確定5 種氨基酸的定量下限，結(jié)果見Tab.2。

Tab.2 Detection limit and quantitative limit

Fig.1 Five kinds of amino acids in samples detected by AAA

2.1.4 日內(nèi)精密度和回收率試驗(yàn)

取100 μmol·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在“1.2.5”色譜條件下進(jìn)行分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，得到Tau，Asp，Glu，Gly 和GABA 峰面積的RSD；取按照“1.2.2”項(xiàng)下處理的樣品溶液在“1.2.5”色譜條件下進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，得到樣品中5 種氨基酸峰面積的RSD；取已知含量的樣品溶液，加入一定濃度的混合標(biāo)品溶液，使加標(biāo)后各氨基酸濃度最大值不超400 μmol·L-1，按“1.2.5”色譜條件測定6次，得到5 種氨基酸的加標(biāo)回收率。結(jié)果表明（Tab.3），儀器日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度良好。

Tab.3-1 Precision of mixed standard samples（±s，n=6）

Tab.3-1 Precision of mixed standard samples（±s，n=6）

Tab.3-2 Precision of brain tissue samples（±s，n=6）

Tab.3-3 Recovery rate of brain tissue samples（±s，n=6）

Tab.3-3 Recovery rate of brain tissue samples（±s，n=6）

2.2 日間精密度測定

在一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣3次標(biāo)樣，結(jié)果取均值，在同一時(shí)間連續(xù)進(jìn)樣5 d，得到標(biāo)樣中5 種氨基酸峰面積的日間精密度為36.40%～42.74%，可見，儀器的日間精密度偏差大，考慮與茚三酮試劑隨時(shí)間的推移而不斷氧化導(dǎo)致顯色效果逐漸降低有關(guān)，這與5 d 內(nèi)氨基酸峰面積數(shù)值逐漸降低的結(jié)果吻合，進(jìn)行樣品批量分析時(shí)需要的時(shí)間較長（3～4 d），故實(shí)驗(yàn)需要獲取更準(zhǔn)確的標(biāo)樣峰面積結(jié)果來準(zhǔn)確計(jì)算樣品中氨基酸的含量。

2.2.1 添加氮?dú)獗Ｗo(hù)穩(wěn)定性檢測

添加氮?dú)獗Ｗo(hù)在理論上可一定程度避免顯色試劑與空氣中的氧接觸，從而減少氧化，本實(shí)驗(yàn)采用99.999%的高純氮，在保證氣密性的前提下對顯色試劑提供氮?dú)獗Ｗo(hù)。Tab.4為不同氮?dú)鈮毫ο拢B續(xù)進(jìn)樣6次標(biāo)準(zhǔn)樣品時(shí)5 種氨基酸的日內(nèi)精密度。結(jié)果表明（Tab.4），添加氮?dú)獠⒉荒塬@得準(zhǔn)確的標(biāo)樣峰面積結(jié)果，而且進(jìn)行批量分析樣品時(shí)，由于分析時(shí)間較長，隨著氮?dú)獾牟粩嘞模獨(dú)獗韷嚎赡軙霈F(xiàn)不穩(wěn)定的情況，氮?dú)饬魉龠^大有損儀器管路結(jié)構(gòu)。因此，本檢測方法改為無氮?dú)獗Ｗo(hù)檢測。

Tab.4 Intraday precision of amino acids under different nitrogen pressures（n=6）

2.2.2 繪制標(biāo)樣峰面積衰減曲線

本實(shí)驗(yàn)采用繪制標(biāo)樣峰面積衰減曲線的辦法獲取準(zhǔn)確的標(biāo)樣峰面積結(jié)果來計(jì)算樣品中氨基酸的含量。在進(jìn)行批量樣品分析的初始、過程中、終末時(shí)分別進(jìn)一次標(biāo)樣（初始時(shí)進(jìn)兩次，以第二次為準(zhǔn)），繪制標(biāo)樣峰面積的衰減曲線，選擇對應(yīng)的標(biāo)樣峰面積作為校正因子。Fig.2為分別在小鼠6月齡和7月齡制備腦組織樣品后立即進(jìn)行批量分析時(shí)5 種氨基酸標(biāo)樣峰面積的衰減曲線。衰減曲線顯示，標(biāo)樣峰面積的衰減并不恒定。

2.3 雌雄小鼠皮質(zhì)和海馬內(nèi)5 種目標(biāo)氨基酸的含量

在計(jì)算不同樣品含量時(shí)，選擇衰減曲線中對應(yīng)的標(biāo)樣峰面積作為校正因子，得到樣品中5 種氨基酸含量，結(jié)果如Fig.3 所示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，相同日齡小鼠腦組織（皮質(zhì)、海馬）內(nèi)的5 種氨基酸含量在不同性別之間未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確可靠。

3 討論

氨基酸分析儀法是國內(nèi)外游離氨基酸定量分析的一種常用方法［8-9］，實(shí)驗(yàn)選用德國曼默博爾公司的A300 全自動氨基酸分析儀。

3.1 檢測方法的優(yōu)勢

Fig.2 Attenuation curve of amino acid standard peak area when batch testing samples

Fig.3 Amino acid content in cortex and hippocampus samples of male and female mice of the same age（±s，n=3）

可對制備好的氨基酸樣品自動進(jìn)行批量檢測，檢測過程無需人工干預(yù)，只需編輯好分析程序即可。本實(shí)驗(yàn)以SPF 級KM 小鼠為研究對象，采用A300 氨基酸自動分析儀，對雌雄小鼠皮質(zhì)和海馬內(nèi)的Tau，Asp，Glu，Gly 和GABA 含量進(jìn)行了準(zhǔn)確測定，該方法具有良好的專屬性、線性關(guān)系，日內(nèi)精密度和回收率符合要求，通過繪制標(biāo)樣峰面積曲線測得的氨基酸含量準(zhǔn)確可靠，經(jīng)過方法學(xué)考察，該方法適用于小鼠腦組織中目標(biāo)氨基酸含量的批量測定。

3.2 注意事項(xiàng)

①需要做好分析前儀器的檢查，校正試劑液量以保證正常運(yùn)行，實(shí)驗(yàn)前對儀器進(jìn)行排氣泡、清洗、檢測壓力的操作尤為重要，否則一旦分析過程中出現(xiàn)問題，儀器自動停止分析，將導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確、浪費(fèi)試劑、降低分離柱效能、減少儀器壽命等諸多問題；②其次，在一次實(shí)驗(yàn)中應(yīng)盡量多的分析待測樣品以節(jié)省標(biāo)準(zhǔn)樣品和試劑，這樣做可同時(shí)減少儀器自檢程序的次數(shù)從而節(jié)省時(shí)間；③對于定量分析游離氨基酸樣品，檸檬酸鋰緩沖體系比檸檬酸鈉緩沖系統(tǒng)有明顯的優(yōu)勢［10］；④氨基酸樣品直接進(jìn)樣分析得到的譜圖基線不太穩(wěn)定，加入一定比例的樣品稀釋液（主要成分為甲酸、乙酸、乙醇，pH為2.2）后能有所改善，增加實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性；⑤小鼠處死后，應(yīng)立即制成腦組織游離氨基酸樣品再進(jìn)行凍存，直接凍存固體腦組織而不及時(shí)制備氨基酸樣品可影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.3 檢測方法的優(yōu)化

氨基酸分析儀的定量原理為外標(biāo)法［11］，獲取準(zhǔn)確的標(biāo)樣峰面積是實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)。該方法試驗(yàn)結(jié)果顯示，在本研究中傳統(tǒng)的添加高純氮?dú)猓⒉荒鼙ＷC茚三酮不被氧化，在進(jìn)行樣品批量分析時(shí)，由于分析時(shí)間長，隨著茚三酮的不斷消耗，茚三酮的顯色效果如何變化及變化多少直接影響著實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用繪制標(biāo)樣峰面積曲線的方法能揭示顯色效果的趨勢，通過曲線方程能得到更加準(zhǔn)確的標(biāo)樣峰面積。因此，本研究對檢測方法進(jìn)行了優(yōu)化，取消了傳統(tǒng)的氮?dú)獗Ｗo(hù)，得到更穩(wěn)定的標(biāo)樣峰面積。