誘發(fā)肺動脈高壓動物模型方法及評價(jià)

張丹參 李佳瑛

河北科技大學(xué)，石家莊，050018，中國

肺動脈高壓是一種由于肺血管重構(gòu)而發(fā)展起來的疾病，其特點(diǎn)是小肺動脈狹窄，導(dǎo)致平均肺動脈壓和肺血管阻力增加［1］，引起肺動脈壓力升高、肺血管阻力增加，其形態(tài)學(xué)特征是肺動脈血管結(jié)構(gòu)重建和右心室肥大。肺動脈高壓本身不是疾病，而是由平均肺動脈壓超過正常上限定義的病理生理參數(shù)，即靜息時(shí)＞25 mmHg。慢性肺疾病引起的持續(xù)性肺動脈高壓的機(jī)制十分復(fù)雜，缺氧是各種肺動脈高壓發(fā)生的最主要因素，雖然對肺動脈高壓的研究已經(jīng)有許多年，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，而且目前的治療措施也很匱乏。因此，對肺動脈高壓的研究刻不容緩［2-3］。制備缺氧性肺動脈高壓動物模型，選擇標(biāo)準(zhǔn)化及與實(shí)驗(yàn)?zāi)康南噙m應(yīng)的實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，是進(jìn)行有關(guān)缺氧性肺動脈高壓發(fā)病機(jī)制或藥物治療研究成功的關(guān)鍵所在［4］。

1 肺動脈高壓模型方法

肺動脈高壓模型的建立方法主要有以下幾種：①利用低氧誘導(dǎo)肺動脈高壓模型；②利用藥物、異物誘導(dǎo)肺動脈高壓模型；③通過手術(shù)分流建立肺動脈高壓模型；④借助基因工程建立肺動脈高壓模型；⑤混合干預(yù)建立晚期肺動脈高壓模型等［3］，以慢性缺氧性肺動脈高壓模型應(yīng)用較多。

1.1 常壓缺氧致肺動脈高壓模型

將大鼠置于改進(jìn)的常壓低氧裝置內(nèi)，通入氮?dú)猓米詣訙y氧儀調(diào)控氧濃度至（10±0.5）%。當(dāng)艙內(nèi)氧濃度低于9%時(shí)，報(bào)警裝置啟動，使大鼠大致因低氧死亡。CO2傳感器可反饋控制鈉石灰裝置的電磁閥門，使艙內(nèi)CO2始終維持在0.03%。溫度傳感器及其控制電路可維持艙內(nèi)溫度始終恒定在22℃～24℃。艙內(nèi)空氣干燥，水蒸氣由變色硅膠吸收（烘干后可反復(fù)使用），缺氧組每天6 h 連續(xù)6周［4-5］。

本低氧裝置能準(zhǔn)確、方便地復(fù)制低氧肺動脈高壓模型，穩(wěn)定性好，獨(dú)立性強(qiáng)，不受外界環(huán)境影響，整個(gè)缺氧過程做到完全自動化，省時(shí)省力，經(jīng)濟(jì)高效，能較好滿足常壓低氧條件需要，較常規(guī)方法更接近于常壓單純低氧所致的肺動脈高壓。

1.1.1 家豬常壓缺氧致肺動脈高壓模型

孫依萍等人［6］將豬常規(guī)麻醉后行氣管切開插管術(shù)，接入呼吸機(jī)，先進(jìn)行正常通氣，吸入氧濃度為50%，潮氣量為80～100 mL，呼吸頻率30～35次·min-1，進(jìn)行機(jī)械通氣。經(jīng)右側(cè)頸外靜脈插入5F 四腔漂浮導(dǎo)管至肺動脈，監(jiān)測肺動脈收縮壓、心率，用熱稀釋法測定心搏指數(shù)，經(jīng)右股動脈插入導(dǎo)管監(jiān)測動脈收縮壓，并由此抽動脈血送檢血?dú)?。?jīng)右股靜脈插管建立靜脈通道。正常通氣1 h 后，測定肺動脈收縮壓、股動脈收縮壓、心搏指數(shù)、血?dú)夥治龊挽o脈血一氧化氮（nitric oxide，NO）含量。進(jìn)行低氧通氣，即吸入氧濃度14.7%的氧氣與氮?dú)饣旌蠚怏w。30 min 后缺氧模型建立。

1.1.2 家兔常壓缺氧致肺動脈高壓模型［7-8］

阮營輝等人用10% 烏拉坦（10 mL·kg-1）腹腔內(nèi)注射麻醉后，分離兔右側(cè)頸外靜脈，一端從頸外靜脈插入，另一端與多導(dǎo)生理儀連接并和壓力傳感器、監(jiān)護(hù)儀及記錄儀相連以測定并記錄平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）和右室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP）。隨之氣管插管，接?jì)雰喝斯ず粑鼨C(jī)記錄基礎(chǔ)MAP，SRVP 值。實(shí)驗(yàn)家兔依次編號1～30，隨機(jī)分組，對照組（10只）家兔FiO 0%～225%常氧通氣，缺氧PAH組（20只）家兔送檢血?dú)夥治龊?，改Fi 29%～15% 低氧通氣。待SRVP 上升4 h 后立即分離左側(cè)頸總動脈，將3F 聚乙烯導(dǎo)管塑料導(dǎo)管一端從頸總動脈插入，另一端與三通連接，便于用肝素生理鹽水（100 U·kg-1）沖洗導(dǎo)管和抽血。先分別抽取動脈和靜脈血送檢。然后在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)分別采用左右心導(dǎo)管術(shù)測定肺動脈、右心室壓力和左心室血液動力學(xué)指標(biāo)。

1.1.3 大鼠常壓缺氧致肺動脈高壓模型［9-11］

劉銀花等人24只清潔級雄性SD 大鼠，體質(zhì)量207～235 g，隨機(jī)分為3組（每組8只）：①正常對照組，低O2高CO2+生理鹽水組（normal saline，NS）和低O2高CO2+HA組（HA）。②將HA組和NS組置于常壓低O2高CO2：艙中，通過N2和CO2：調(diào)節(jié)艙內(nèi)O2和 CO2濃度，使O2濃度控制在9%～11%，CO2濃度在5%～6%，溫度控制在23℃～27℃，濕度在7%～50%，每天6 h，每周8 d，共4周。大鼠自由攝食攝水。每天將大鼠放人氧艙前，HA組腹腔注射羥胺溶液（12.5 ms·kg-1，1 mL，NS組腹腔注射1 mL 生理鹽水。定期稱量動物體重，根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整藥物用量［11］。

1.2 減壓缺氧致肺動脈高壓模型

將動物置于全自動調(diào)節(jié)低壓低氧艙（大氣壓約50 kPa，氧濃度10%）內(nèi)，進(jìn)行間斷性低氧，每天8 h，連續(xù)4周，模擬海拔5 000～5 500 m 高度的氣壓環(huán)境，建立低壓低氧性肺動脈高壓模型；分別于1周（8只）、2周（8只）、4周（8只）給大鼠腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉40 mL·kg-1進(jìn)行麻醉。

此方法在整個(gè)缺氧過程中艙內(nèi)氧濃度始終維持在10%左右，艙內(nèi)空氣干燥，溫度與室溫基本一致，重要的是，在缺氧開始階段和結(jié)束階段由于有緩沖艙，使低壓低氧艙中的壓力能夠平穩(wěn)的下降和上升，并且大鼠在低氧過程中的死亡率幾乎為零。裝置低壓低氧艙容積大，可容8只大鼠，能準(zhǔn)確、方便地復(fù)制低壓低氧性肺動脈高壓模型，穩(wěn)定性好，整個(gè)低氧過程中做到了完全自動化、省時(shí)省力［12-14］。另外，本裝置也可經(jīng)簡單調(diào)整后，模擬不同高度的高原的氣壓環(huán)境。

1.2.1 豚鼠減壓缺氧致肺動脈高壓模型

李留樹等人［15］用豚鼠40只，體質(zhì)量400 g 左右，雌雄各半，其中30只為實(shí)驗(yàn)組，另10只為對照組。按上述方法復(fù)制肺動脈高壓模型。分別于缺氧第1、2和4周最后一次缺氧試驗(yàn)后用10%烏拉坦腹腔麻醉，以穿刺法經(jīng)頸外靜脈插管直到肺動脈、經(jīng)P23 壓力換能器接多道生理記錄儀，分別測肺動脈壓（pulmonary arterial pressure，PAP）和右心室壓（right ventricular pressure，RVP），然后取血測心鈉素和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE），測定方法為放射免疫法和分光光度法。放血后，將動物開胸，取出心臟，剪去心房組織，沿室間隔邊緣剪下右心室、左心室和室間隔并稱重，以右室（左室+室間隔）將重量比和右心室重/體重表示右心室重量的變化，確定有無右心肥厚，若有右心室肥厚，則建模成功。

1.2.2 大鼠減壓缺氧致肺動脈高壓模型［16-19］

吳東紅等人用清潔級雄性SD 大鼠40只，隨機(jī)取組法分成4組：正常對照組（NC）、低 O2高 CO21周組（1 HH）、低O2高CO22周（2 HH）和低 O2高 CO24周組（4 HH）。將后3組動物放入常壓低 O2高 CO2艙內(nèi)，使O2濃度維持在9%～11%，CO2濃度維持在5%～6%，每天8 h，每周6 d，連續(xù)4周。對照組大鼠除吸入空氣外，其他飼養(yǎng)條件與各低 O2高 CO2組相同。動物飼養(yǎng)到規(guī)定時(shí)間后，用戊巴比妥鈉（35 mL·kg-1）腹腔麻醉，右心導(dǎo)管法測定平均肺動脈壓（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）。放血處死動物，迅速剪開胸腔取出心肺，右下肺置于4%多聚甲醛-PBS 液（含0.1% DEPC）中固定。剪去右心房組織，沿室間隔邊緣剪下右心室，分別稱取右心室游離壁和左心室加室間隔的重量，并計(jì)算出它們的重量比，作為右室肥大的指標(biāo)，若有右心室肥厚，則建模成功。

1.3 野百合堿皮下注射肺動脈高壓模型［20-23］

雄性Wistar 大鼠，將野百合堿性結(jié)晶配成2%溶液，以50 mL·kg-1一次性肩胛區(qū)皮下注射。于注射后12，16，24 天分批處死動物。測定右心室和肺動脈壓力，以及進(jìn)行心肺病理檢查確定肺動脈高壓的指標(biāo)包括功能和形態(tài)學(xué)兩方面，其中最直接的證據(jù)是肺動脈壓力升高。也可將野百合堿脫氫處理成脫氫野百合堿，經(jīng)心導(dǎo)管注入犬右心房制作肺動脈高壓動物模型，與注射藥物后4周、8周測定肺動脈壓力等血液動力學(xué)參數(shù)，并行肺組織病理學(xué)檢查?；蛘撸捎靡鞍俸蠅A復(fù)合左肺切除法建立慢性肺動脈高壓大鼠模型［20］。

野百合堿復(fù)合左肺切除法建立慢性肺動脈高壓大鼠模型特點(diǎn)：大鼠價(jià)格低廉、手術(shù)過程相對簡單、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，5周內(nèi)即可完成慢性肺動脈高壓模型建立，明顯短于既往的單純分流方法，適用于肺動脈高壓實(shí)驗(yàn)研究。

1.3.1 犬野百合堿皮下注射肺動脈高壓模型

趙永紅等人［21］用氯胺酮5 mL·kg-1靜脈注射麻醉動物犬，保持清醒狀態(tài)，經(jīng)股靜脈穿刺5F 導(dǎo)管入右心房右心室，肺動脈主干及右下肺動脈測定中心靜脈壓、右室收縮壓、肺動脈收縮壓、肺動脈平均壓，于左下肺動脈遠(yuǎn)端測定楔壓等壓力參數(shù)，經(jīng)股動脈檢測體循環(huán)。野百合堿組經(jīng)右心房注入野百合堿組經(jīng)右心房注入野百合堿，對照組注入等量DMF。動物飼養(yǎng)到4周、8周時(shí)，重復(fù)測定上述部位壓力。8周時(shí)隨機(jī)抽取對照組6只，實(shí)驗(yàn)室6只動物處死。氯胺酮5 mL·kg-1肌肉注射誘導(dǎo)麻醉，速眠新1 mL·kg-1靜脈注射，氣管插管接呼吸機(jī)，經(jīng)第5 肋間進(jìn)胸，與肺門處理10 mm×10 mm×5 mm 大小的肺組織，以4%的中性甲醛固定72 h 后，石蠟包埋，經(jīng)HE 和VG 改良法染色做病理檢查，建立肺動脈高壓動物模型。

1.3.2 大鼠野百合堿皮下注射肺動脈高壓模型［3，22-23］

馬凱等人用清潔級雄性大鼠75只，體質(zhì)量（160～180）g，隨機(jī)分為C組、M1組、M2組、M3組和M4組，每組各15只。分別腹腔注射不同劑量野百合堿4周后檢測各項(xiàng)指標(biāo)。其中組大鼠一次性腹腔注射野百合堿，劑量分別為（30、40、50、60）mL·kg-1，誘導(dǎo)建立肺動脈高壓動物模型。

1.4 血管分流術(shù)致肺動脈高壓模型

實(shí)行麻醉大鼠腹主動脈和下腔靜脈分流手術(shù)，制作肺動脈高壓動物模型。手術(shù)歷時(shí)1 h 左右，術(shù)后約30 min，大鼠出現(xiàn)抬頭、四肢蠕動等蘇醒征侯，后出現(xiàn)翻身活動。術(shù)后6周，大鼠肺動脈壓力明顯升高，右心室肥厚。同時(shí)肺血管結(jié)構(gòu)發(fā)生重建，肺動脈中膜增厚、肌化程度增加和內(nèi)膜細(xì)胞增生，術(shù)后11周肺動脈高壓形成。此外，還有家兔、大鼠右頸總動脈和頸外靜脈用套管連接法連接制作大鼠頸部肺動脈高壓動物模型。

有資料表明，大鼠心臟機(jī)能、心血管系統(tǒng)的生物學(xué)特性與人類有著極大的相似性，且大鼠體積小，價(jià)格低廉。腹主動脈和下腔靜脈分流使回心血量增多，肺循環(huán)血流量相應(yīng)增加，影響了肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能和代謝，進(jìn)而促進(jìn)肺動脈高壓的形成。較既往的左向右分流型先天性心臟病動物模型的制備相對簡單，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，動物死亡率低，因此用大鼠作為該模型的首選動物十分合適。但是，不能除外高血流對下腔靜脈的影響導(dǎo)致全身體液失衡進(jìn)而促進(jìn)肺動脈高壓的形成，對此尚有待進(jìn)一步研究。

1.4.1 家兔血管分流術(shù)致肺動脈高壓模型

張鳳偉等人［24］向兔耳緣靜脈注射2.5%戊巴比妥鈉（30 mL·kg-1），麻醉成功后，仰臥固定于手術(shù)板上，頸部皮膚去毛并消毒。采用頸部正中切口，長約3 cm。顯露右側(cè)頸外靜脈，耳緣靜脈注射肝素1 mL·kg-1抗凝后，在頸外靜脈第一個(gè)屬支下方結(jié)扎其遠(yuǎn)端。游離右側(cè)頸總動脈，近心端用小血管夾阻斷血流，在頸內(nèi)、外動脈分叉處下方約0.5 cm 處結(jié)扎并斜行切斷頸總動脈。用小血管夾阻斷頸外靜脈近心端，于頸外靜脈內(nèi)側(cè)適當(dāng)位置做一約2 mm 切口，在顯微鏡下使用7-0 Prolene線行頸動—靜脈端側(cè)吻合。先后松開頸外靜脈和頸總動脈近心端的血管夾，如發(fā)現(xiàn)頸外靜脈近心端充盈并出現(xiàn)搏動性鮮紅色血流，證明吻合口通暢良好。切口內(nèi)放入少許青霉素粉劑預(yù)防感染，逐層縫合皮下組織及皮膚。以肺動脈收縮壓＞30 mmHg，平均肺動脈壓＞20 mmHg為制模成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.2 犬血管分流術(shù)致肺動脈高壓模型

左順慶等人［25］選擇健康雜種犬6 條，體質(zhì)量（10～20）kg，雌雄不限。動物在全麻插管下經(jīng)左側(cè)第4 肋間開胸。血管吻合方法：2 條犬利用左肺動脈上葉分支近端與降主動脈行端側(cè)吻合，4 條犬利用左鎖骨下動脈與左肺動脈行端側(cè)吻合，吻合口4～6 mm，吻合完畢肺動脈側(cè)向近心、遠(yuǎn)心端均有明顯震顫。吻合前測定肺動脈、體動脈平均壓作正常對照。術(shù)后常規(guī)籠中飼養(yǎng)4～6個(gè)月。

1.4.3 大鼠血管分流術(shù)致肺動脈高壓模型［26-27］

周菁等人向大鼠腹腔內(nèi)注射4% 的水合氯醛（100 g·kg-1）麻醉。取腹正中切口，用兩根棉簽將大鼠腸腔拖出腹壁外，予生理鹽水濕紗布包裹，保持組織濕潤，以防水分蒸發(fā)。用兩根棉簽鈍性分離后腹膜，充發(fā)暴露腹主動脈和下腔靜脈，用雙極電凝對腹主動脈兩邊的髂腰動靜脈以及到脊柱的向后的3 根細(xì)小動脈進(jìn)行電凝。肝素抗凝后，用細(xì)線于左腎動脈起始部下方以及髂總動靜脈上方將腹主動脈和下腔靜脈阻斷。以腹主動脈的左腎動脈起始部至其末段的下2/3 處之左側(cè)壁為造瘺處，用自制刮胡刀片的尖刃在腹主動脈壁上劃出1 mm 長的刀口以動脈三層刀口對齊為好，可在顯微鏡下清楚看見稍呈藍(lán)色的對側(cè)壁，用20 G 靜脈穿刺套管針在對側(cè)壁輕輕刺出一破口，用顯微鑷子的一側(cè)尖頭刺入相鄰的下腔靜脈內(nèi)，再用顯微鑷子的兩個(gè)尖頭刺入相鄰的下腔靜脈內(nèi)，輕輕擴(kuò)大瘺口，再用20 G靜脈穿刺套管針的外套管再次擴(kuò)大瘺口，此步操作需輕柔，勿穿破下腔靜脈對側(cè)壁。用7-0 線縫合腹主動脈壁的穿刺口。松解兩端用以阻斷的細(xì)線，顯微鏡下若可觀察到下腔靜脈增粗、顏色由暗變紅或血流有波動，則證實(shí)分流存在，即可縫合腹壁，則建模成功。

1.4.4 豬血管分流術(shù)致肺動脈高壓模型

Jiang Y Y 等人［28］建立了仔豬左向右分流致PAH模 型（n=9；4月齡；體質(zhì) 量（22.8±2.3）kg；公 母比 例4∶5）。肌肉注射鹽酸西拉嗪（2 mL·kg-1）。2 2F 穿刺針建立耳廓靜脈通路后，靜脈注射丙戊酸（1 mL·kg-1）和芬太尼（5 mL·kg-1），羅庫溴銨（0.5 mL·kg-1）靜脈滴注，機(jī)械通氣。左四肋間隙切口顯露胸降主動脈和肺動脈干。用6-0 聚丙烯臨時(shí)夾閉胸主動脈降主動脈，縫合直徑6 mm 的人造血管。移植物的另一端與肺動脈吻合。術(shù)中測定分流前后收縮期肺動脈壓、舒張期肺動脈壓及肺動脈壓。然后關(guān)閉胸腔，將仔豬送回飼養(yǎng)室，并進(jìn)行6個(gè)月的隨訪。

1.5 慢性血栓栓塞性肺動脈高壓模型

采用自體血栓連續(xù)注射法建立慢性血栓栓塞性肺動脈高壓動物模型。犬麻醉后取血50 mL，加入凝血酶，形成血栓，將血栓剪成直徑3～5 mm，長8～10 mm 圓柱形備。切開頸外靜脈插入7F 導(dǎo)管，向頸外靜脈內(nèi)注射自體血栓，直至肺動脈平均壓達(dá)到45 mmHg，快速推注生理鹽水10 mL。達(dá)到實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)后，縫合靜脈切口及皮膚切口，給予抗生素，動物飼養(yǎng)15，30，60 天后，重復(fù)上述麻醉和注栓實(shí)驗(yàn)步驟。所有動物分別于第一次注栓前和注栓后第90 天，記錄平均肺動脈壓、肺毛細(xì)血管嵌壓、心輸出量、呼吸頻率、潮氣量、氣體流速、胸內(nèi)壓［29］。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⑼耆７铝松铎o脈血栓脫落后多次肺栓塞事件的發(fā)生。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)靜脈血栓的形狀、性狀、數(shù)量和流入速度決定肺栓塞的面積和肺動脈壓力升高的情況。放棄了傳統(tǒng)血栓模型股靜脈入路而采用頸靜脈入路是為了縮短栓子在體循環(huán)血管的行程，減少破碎的機(jī)會。動物模型建立成功率為83%，用自體血栓連續(xù)注射法建立慢性血栓栓塞性肺動脈高壓動物模型有較高的可行性。

1.5.1 家豬慢性血栓栓塞性肺動脈高壓模型［30-31］

Ehlermann 等人采用健康家豬，體質(zhì)量20～30 kg，雌雄不限。抽取豬自體靜脈血5 mL 注入直徑為4 mm的聚乙烯管中，置于冰箱中冰存24 h，形成血栓，洗滌后備用。實(shí)驗(yàn)前15 min 分別肌注氯胺酮（20 mL·kg-1），地西泮10 mg 和阿托品15 mg 進(jìn)行麻醉，觀察家豬睫毛反射消失后，固定于自制木板架上。用右心導(dǎo)管置于右肺動脈遠(yuǎn)端的大分支處，在 X 射線單向影像系統(tǒng)的監(jiān)視下，向肺動脈推注事先準(zhǔn)備好的同樣劑量的人工血栓，造成人工肺動脈栓塞的動物模型。此模型注入的栓子除自體血凝塊外還可以使用明膠海綿塊，亦可直接從頸靜脈插管注入自體血凝塊，還可用右心導(dǎo)管置于右肺動脈遠(yuǎn)端的大分支處，在X 射線單向影像系統(tǒng)的監(jiān)視下，向肺動脈推注事先準(zhǔn)備好的由折疊多重的線圈和組織粘合劑制成的栓子，或者葡聚糖凝膠G-50制成的栓子，反復(fù)三四次，造成人工肺動脈栓塞的動物模型。

1.5.2 大鼠慢性血栓栓塞性肺動脈高壓模型

王海龍等人［32］采用大鼠，體質(zhì)量200～250 g，雄性，應(yīng)用1%戊巴比妥（40 mL·kg-1）腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，置含有200 U·mL-1凝血酶的無菌玻璃平皿中靜置過夜，棄血清后，生理鹽水沖洗，剪成0.5 mm左右大小的栓子，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)頸靜脈用1.5 mL 生理鹽水緩慢注入栓子 27～30個(gè)，制備肺栓塞模型；對照組經(jīng)頸靜脈注入生理鹽水1.5 mL。2周后以同樣方法進(jìn)行二次栓塞。2次術(shù)后3 d 內(nèi)均肌肉注射慶大霉素0.1 萬單位·kg-1預(yù)防感染，1次·d-1；全程腹腔注射氨甲環(huán)酸（12.5 mL·kg-1），1次·d-1，建模成功。

1.5.3 犬慢性血栓栓塞性肺動脈高壓模型

Zhang YM 等人［33］選用健康雜種犬，性別不限，體質(zhì)量13～19 kg，所有犬給予50 g·L-1戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉，劑量為0.6 mL·kg-1。麻醉后仰臥位固定于手術(shù)臺。氣管內(nèi)插入氣管插管固定。頸部剪毛后，碘伏消毒，暴露頸外靜脈，在無菌條件下取血50 mL，加入500 U 凝血酶后于平皿內(nèi)混勻，室溫下靜置約1 h，形成血栓，將血栓剪成直徑3～5 mm 圓柱形備用。切開頸外靜脈，插入7F 標(biāo)準(zhǔn)三腔漂浮導(dǎo)管，另一切口插入7F 導(dǎo)管深度15～18 cm 至右心房，接傳感器監(jiān)測肺動脈壓。經(jīng)7F 導(dǎo)管緩慢注入先前制備的血栓5～10 min，直至肺動脈平均壓達(dá)到45 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）?？焖偻谱⑸睇}水10 mL，以防栓子滯留于導(dǎo)管或頸靜脈內(nèi)。手術(shù)結(jié)束后，用7-0 線縫合血管插管口，縫合手術(shù)切口。蘇醒后放回動物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，溫度23℃，空氣濕度60%。并給予肌肉注射青霉素預(yù)防感染。在第1次注栓后15，30，60 d，重復(fù)上述麻醉和注栓步驟，建模成功。

2 制備肺動脈高壓模型注意事項(xiàng)

常壓低氧裝置中水蒸氣要除盡，艙內(nèi)氣體用小風(fēng)扇不斷混勻且艙內(nèi)的二氧化碳和水蒸氣分別用鈉石灰和氯化鈣吸收。低壓低氧艙中變色硅膠是用來干燥低壓低氧艙中的大鼠呼出的濕氣和CO，保證了從低氧艙抽出的氣體經(jīng)干燥后進(jìn)入緩沖艙中，同時(shí)也保證了低壓低氧艙中的環(huán)境的干燥。手術(shù)操作宜輕柔、迅速，盡可能減少對動物的創(chuàng)傷。

手術(shù)中，暴露的腸管需用生理鹽水濕紗布包裹，保持組織濕潤，以防水分蒸發(fā)。在造瘺時(shí)，最好從動脈向靜脈進(jìn)行，動脈壁彈性好，易于縫合。靜脈壁薄，易撕裂。動脈切口以動脈三層刀口對齊為好。用20G 靜脈穿刺套管針擴(kuò)大瘺口時(shí)操作需輕柔，勿穿破下腔靜脈對側(cè)壁。松解細(xì)線解除阻斷時(shí)，先稍松解下端細(xì)線，用棉簽輕壓下端細(xì)線遠(yuǎn)端，這樣可壓碎一些小血栓，防止小血栓凝成大血栓，堵塞大血管，導(dǎo)致大鼠死亡。然后徹底松解下端細(xì)線，血液立刻充盈阻斷部位血管，在腹主動脈切口縫合處，可形成細(xì)小血栓，防出血，亦可加用小塊明膠海棉，蓋在腹主動脈切口縫合處，增加止血效果。然后稍松解上端細(xì)線，同樣用棉簽輕壓上端細(xì)線近端。最后徹底松解上端細(xì)線，因腹主動脈壓力大，阻斷處一下沖開，兩條大血管重新貫通。外科操作要求準(zhǔn)確、嫻熟，手法輕柔、到位，否則易引起大出血等意外情況。

在制栓過程中添加凝血酶，是為了使栓子能夠?qū)狗屋^強(qiáng)的血栓自溶能力而不易破碎，以提高成功率。栓子被剪成小圓柱型緩慢多次注入，是為了避免血栓聚集成團(tuán)塊，堵塞肺動脈主干引起廣泛肺栓塞，造成實(shí)驗(yàn)動物死亡。注栓時(shí)監(jiān)測平均肺動脈壓，使其達(dá)到45 mmHg，因?yàn)橛匈Y料表明急性肺栓塞時(shí)平均肺動脈壓越高發(fā)展為慢性肺動脈高壓的危險(xiǎn)性越大。

總之，動物實(shí)驗(yàn)對于研究人類疾病的病因、發(fā)病機(jī)制、病理生理、臨床治療和藥物試驗(yàn)等均有極其重要的意義。通過肺動脈高壓動物實(shí)驗(yàn)，可了解并深入研究肺動脈高壓疾病的發(fā)病機(jī)理，完善治療方法?？v觀目前現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)方法學(xué)，很多動物模型尚需進(jìn)一步完善，許多觀察指標(biāo)的量化及標(biāo)準(zhǔn)化研究有待深入。