EGFR抑制劑耐藥拮抗策略在非小細胞肺癌治療中的進展

何沛敏，童 欣，李冠武

（汕頭大學醫(yī)學院腫瘤分子生物學開放實驗室，廣東 汕頭 515041）

肺癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，也是死亡率最高，對人類健康威脅最大的惡性腫瘤，其目前的5年生存率只有18.2%.根據組織學特征，肺癌中約85%屬于非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）.在臨床上，由于缺乏早期發(fā)現的有效手段，大部分非小細胞肺癌患者被確診時已處于晚期，不能進行手術切除，只能選擇放療和化療，但效果不理想.近年來，在深入了解腫瘤發(fā)生的分子機制基礎上產生的靶向治療越來越受到重視.對比于傳統(tǒng)的化療和放療，靶向治療對腫瘤細胞更有針對性，具有副作用少、毒性低等優(yōu)勢.目前，針對晚期NSCLC 最成熟的靶向治療點有表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）、棘皮動物微管結合蛋白4（echinoderm micmtubule associated protein hke 4，EML4）和間變淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合基因.而表皮生長因子受體- 酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）就是針對表皮生長因子受體（EGFR）敏感突變的NSCLC 患者，臨床上治療效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的放化療.故對攜有EGFR 基因敏感突變的晚期NSCLC 患者，靶向類藥物EGFR-TKI 是首選治療方案，特別是不吸煙的亞裔女性肺腺癌患者.EGFR-TKI 的一線治療藥物有吉非替尼（gefitinib）等，而厄洛替尼（erlotinib）和?？颂婺幔╥cotinib）等可作為二、三線治療的藥物.

然而經過一段時間治療后，患者易對EGFR-TKI 產生耐藥性，耐藥的產生極大地限制了靶向治療的發(fā)展.有研究表明獲得性耐藥的產生主要跟EGFR-TKI 誘導的自噬（autophagy）活性增強有關.所以，克服EGFR-TKI 的耐藥性，要先了解自噬對耐藥形成的作用，并針對地干預腫瘤細胞的自噬活性來延緩耐藥形成，尋找和發(fā)現相關藥物（例如自噬誘導劑或抑制劑）來拮抗EGFR-TKI 的耐藥性.解決EGFR-TKI 的耐藥問題是一個艱辛而有意義的科研任務，研究者可以從自噬誘導或抑制層面獲得啟發(fā)，尋找能拮抗靶向藥EGFR-TKI 耐藥的方法.本文基于EGFR-TKI 在非小細胞肺癌治療中的作用機制、其耐藥機制及可用自噬調節(jié)劑逆轉耐藥性方面作如下綜述.

1 EGFR、自噬與EGFR-TKI的作用機制

EGFR 基因位于人類7 號染色體短臂的12-14 區(qū)，包含28 個外顯子，其中18～24外顯子可以編碼該受體的酪氨酸激酶部分.但超過90%的EGFR 突變是發(fā)生在19～21外顯子，尤其是19 外顯子，約占所有突變的60%.而外顯子19 堿基缺失和外顯子21的點突變往往是對EGFR-TKI 治療敏感的.突變后EGFR 可不依賴表皮生長因子EGF，進行自激活，活性增強.EGFR 作為一種酪氨酸蛋白激酶受體，與相應配體結合后激活酪氨酸激酶（TK），使其磷酸化，激活下游的P13K-Akt-mTOR 通路和SOS-Ras-RAFMEK-MAPK 通路等使自噬減少，同時加速分泌轉化生長因子（Transforming growth factor，TGF）、IL-8、Bfgf 和VEGF 等來促進腫瘤生長，使腫瘤細胞獲得不死性，進入“瘋長- 分裂”的惡性循環(huán)模式.所以，EGFR 的過表達或活性增強（突變后）會使得細胞生長加快，自噬受到抑制，導致腫瘤的產生.而靶向藥物EGFR-TKI 正是靶向瞄準EGFR 的酪氨酸激酶胞內區(qū)，使其活性減弱，增加自噬，達到治療目的.

自噬是細胞在自噬相關基因（Autophagy associated genes，ATGs）的精密調控下，通過迅速批量分解細胞器和蛋白等細胞內容物以實現物質重新利用，提高在缺氧、饑餓、化療和靶向藥物存在等的不利環(huán)境下存活的一種手段[1].在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，自噬起著雙刃劍作用.一方面，自噬可以作為人體的自我保護機制，通過清除受損的細胞器，維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，保護細胞正常生長，并在腫瘤細胞產生后經自噬性細胞死亡等抑制腫瘤的發(fā)生；另一方面，自噬可以作為腫瘤細胞生長過程中的一種自我保護反應，在處于缺氧、饑餓、靶向藥EGFR-TKI 等不利環(huán)境中時，腫瘤細胞通過快速上調自噬水平，分解無用或不急需的蛋白質和細胞器，減慢生長速度，降低消耗，適應改變，這也是EGFR-TKI 產生耐藥性的重要原因.

EGFR-TKI 通過可與三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）競爭地結合EGFR 的酪氨酸激酶，也可作為酪氨酸的類似物，阻斷酪氨酸激酶的活性，阻止EGFR 磷酸化，進而通過其下游的蛋白激酶B（proteinase B，PKB，又稱AKT）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactived protein kinase，MAPK）途徑，阻斷EGFR 信號通路，抑制腫瘤的生長與轉移.

2 EGFR-TKI耐藥的分子機制

2.1 EGFR的T790M基因二次突變

在獲得性耐藥機制中，約50%病例發(fā)生T790M 基因突變，減弱了EGFR-TKI 對腫瘤細胞的殺傷作用.EGFR 基因20 外顯子的T790M 發(fā)生堿基C-T 替換，導致EGFR 中原本的蘇氨酸（T）被占位較大的蛋氨酸（M）取代，形成空間位阻，恢復激酶區(qū)，使與ATP 的親和力增加[2].另外，作為管家基因的第790 位密碼子，在調節(jié)ATP 結構域特異性抑制劑方面起重要作用，而這種突變會使得已有L858R 突變的激酶對ATP 的親和力更強于EGFR-TKI，從而競爭性抑制了EGFR-TKI 與突變區(qū)域的結合，減少了EGFR-TKI 對下游信號傳導的阻斷，產生EGFR-TKI 的獲得性耐藥[3].但關于T790M 基因突變還有另一種說法是選擇性模式，即T790M 突變耐藥克隆原本就存在腫瘤組織中，經EGFR-TKI 的篩選治療后敏感的克隆被殺滅，而含有T790M 突變的耐藥克隆部分得以存活下來，使腫瘤整體上呈現耐藥性[4].

2.2 C-Met基因擴增

約有5%-20%的獲得性耐藥是由c-Met基因擴增造成的[5].c-Met基因擴增會使肺癌細胞繞開EGFR 這一靶點，通過增多的C-Met 蛋白跨膜受體與ErbB3 的結合，使下游的P13K/AKT 信號通路增強，促進腫瘤細胞增殖、浸潤和轉移，同時抑制自噬，從而降低對EGFR-TKI 的敏感性.

2.3 表型轉變

Sequist 等人發(fā)現有14%原本對EGFR-TKI 反應良好的NSCLC 晚期患者發(fā)生耐藥是由于轉化為了小細胞肺癌SCLC[6].而40%耐藥病人會出現上皮細胞化生為間質細胞，即上皮細胞間質化（epithelial mesenchymal transition，EMT），從而形成腫瘤干細胞，降低了EGFR 信號的依賴性.然而，NSCLC 患者對EGFR-TKI 耐藥，不僅是因為獲得性耐藥，還有一部分是自始至終就對EGFR-TKI 不敏感，即原發(fā)性耐藥.一方面，沒有對EGFR 基因敏感突變的NSCLC 患者對EGFR-TKI 天然不敏感；另一方面，即使對EGFR 敏感突變的患者，仍有20%-30%的患者對EGFR-TKI 原發(fā)性耐藥，如EGFR 基因20 外顯子和18外顯子的突變、BIM多態(tài)性缺失、K-ras 基因突變、EML4-ALK 融合基因突變、PTEN 抑癌基因缺失等.

EGFR-TKI的獲得性耐藥機制除了有以上的T790M基因二次突變、C-Met基因擴增和細胞表型從非細胞細胞肺癌轉化為小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）[7].相對少見的機制還有HER2 擴增[8]、胰島素樣生長因子-1 受體、BRAF 突變和MAK 擴增.

3 TKI耐藥后的應對策略

由于EGFR-TKI 耐藥的機制很多，目前針對EGFR-TKI 耐藥還沒有一個標準的治療方案.T790M 突變是EGFR-TKI 最常見的耐藥機制，而突變后腫瘤細胞的增殖仍依賴EGFR 信號傳導通路，因此阻斷EGFR 信號傳導通路是逆轉耐藥性的重要環(huán)節(jié)，目前相關的研究有EGFR-TKI 聯(lián)合EGFR 西妥昔單抗、不可逆的HER-TKI 抑制劑、EGFR-TKI與c-Met 抑制劑聯(lián)合、T790M 突變特異性抑制劑及熱休克蛋白90 抑制劑（CH5164840）.其中針對T790M 突變的特異性抑制劑有雷帕霉素、AP26113、C0-1686、WZ4002 等.目前也有研究表明CH5164840 聯(lián)合使用厄洛替尼，可以較好的緩解厄洛替尼耐藥.針對HGF/MET 信號通路研究藥物也是靶向治療研究的一個熱點，根據抑制的傳導水平不同，可分為兩種：一種是在HGFR 的配體或受體水平阻斷該信號通路，代表藥有：抗HGF 的單抗（AMG-102 和AV-29 9）和抗HGFR 單抗（Met Mab）[9].另有一種是通過抑制MET 酪氨酸激酶區(qū)進而抑制該通路即MET-TKI：Foretinib（XL880）、Tivantinib（ARQ 197）和Cabozantinib（XL184）[10].另外，Xuan Xianglan 等試驗證實c-MET 抑制劑（SU11274）聯(lián)合EGFR-TKI 類藥物吉非替尼或厄洛替尼可通過抑制EGFR 信號通路，進而有效抑制EGFR-TKI 耐藥的肺癌細胞增殖并促進其凋亡[11].目前c-MET 抑制劑及MET 單克隆抗體如apmatinib（ICN280）聯(lián)合吉非替尼、Emibetuzumab（LY2875358）[12]聯(lián)合厄洛替尼的臨床試驗正在進行中.

4 通過調節(jié)腫瘤細胞自噬，可以延緩TKI耐藥

自噬在腫瘤的治療中也是起著雙刃劍的作用.一方面，腫瘤細胞由于自我保護反應引起的自噬會促進EGFR-TKI 耐藥的形成，近年來研究證實高水平的自噬可以幫助腫瘤細胞在EGFR-TKIs 治療中存活下來[13]，此時抑制自噬可有效地降低耐藥性，增加EGFR-TKI 的細胞毒性作用，提高治療效果.但另一方面，也有研究表明，在治療過程中，自噬可介導細胞發(fā)生自噬性死亡，這種情況下，可通過誘導自噬，提高EGFR-TKI 治療效果.由于細胞信號通路網的復雜性，一條通路的抑制會使得細胞另外的通路調節(jié)性增強，以及細胞本身突變的多樣性，不同患者的癌細胞所處的狀態(tài)不同以及耐藥機制不同，使得促進自噬還是抑制自噬才能起著殺滅癌細胞作用，需要針對個體分別處理.這些研究為治療輔助藥物的研發(fā)提供了方向，根據不同情況聯(lián)合使用自噬誘導劑或抑制劑調節(jié)自噬水平，是一個很有希望克服EGFR-TKI 耐藥，提高治療效果的新型治療方案.

4.1 聯(lián)合使用自噬誘導劑

聯(lián)合使用自噬誘導劑，通過誘導細胞發(fā)生自噬性死亡，從而來提高EGFR-TKI 的治療效果.基于P53 基因多態(tài)性與NSCLC 患者的耐藥性形成的研究，Yaara Gorzalczany 等發(fā)現EGFR-TKI 類藥物厄洛替尼聯(lián)合使用自噬誘導劑雷帕霉素可利于提高NSCLC 患者對EGFR-TKI 的反應[14].Eun Ju Kim 等也發(fā)現mTOR 抑制劑（依維莫司everolimus/RAD001和雷帕霉素rapamycin）通過誘導自噬，使得PTEN 缺失的非小細胞肺癌細胞重獲對靶向治療藥EGFR-TKI 和放射治療的敏感[15].最近Kenneth K.W.To 等的研究表明PPARγ 激動劑可通過誘導ATG5 基因沉默的PTEN 缺失細胞的自噬性細胞死亡，進而有助于減緩耐藥性.因此，PPARγ 激動劑（羅格列酮rosiglitazone、吡格列酮pioglitazone、替米沙坦telmisartan）和EGFR-TKIs 聯(lián)合使用可作為一種新型的治療手段，用以規(guī)避由于PTEN 缺失產生的EGFR-TKI 耐藥[16].

然而Yongjie Wei 等認為目前有關用自噬誘導劑拮抗EGFR-TKI 耐藥性的實驗有一定的局限性，缺乏說服力，因為他們實驗用的是EGFR 高表達細胞株，而不是對EGFR-TKI 敏感的EGFR 突變細胞，由于需要足夠多的藥量才可誘導自噬的發(fā)生，所以對比臨床用藥，實驗中誘導劑的用量多，這些實驗都是基于線粒體活動，只反映了細胞增殖和死亡，而不是說明細胞生存中自噬的作用，還缺乏體內實驗的支持[17].

4.2 聯(lián)合使用自噬抑制劑

與前述通過誘導細胞自噬，抑制EGFR-TKI 耐藥相反，Yuan-yuan Li 發(fā)現在對Erlotinib 敏感的NSCLC 細胞中自噬水平被誘導，抑制自噬誘導凋亡可以進一步增強對EGFR 突變（外顯子19 缺失）的NSCLC 中erlotinib 的敏感性，提示通過抑制自噬以提高細胞對EGFR-TKI 的敏感性，可解決獲得性耐藥的問題[18].該研究也說明使用自噬誘導劑或抑制劑取決于是否存在EGFR 突變.

來自加州大學的Jasmine G.Lee 和Reen Wu 等研究發(fā)現：在使用厄洛替尼的基礎上，加用自噬抑制劑—順鉑，可通過靶向下調Atg3 介導的自噬和誘導凋亡來抵抗厄洛替尼的耐藥形成[19].除此之外，Zou 等人聯(lián)合使用另外一種自噬抑制劑氯喹（chloroquine，CQ）或羥氯喹（hydroxychloroquine，HCQ）也可以達到抑制腫瘤生長，加強厄洛替尼的腫瘤細胞殺傷作用.他們進一步的分析發(fā)現其凋亡水平明顯提高，但細胞周期和EGFR 下游信號通路活性沒有明顯的改變[20].2017年，Xiangxiang Hu 等聲明Akt/mTOR 和Erk 信號通路與二代EGFR-TKI 藥阿法替尼（afatinib）引起的自噬有關，聯(lián)合使用該通路的抑制劑氯喹和3- 甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）可有效阻斷自噬，很有希望用于作為EGFR 突變激活肺腺癌個體耐藥和提高對afatinib 敏感性的新策略[21].

5 治療NSCLC的潛在新藥或輔助藥物

近年來，不斷有新的自噬誘導劑被發(fā)現，并用于治療非小細胞肺癌的研究，其中相當一部分的研究靶點是針對肺癌細胞的PI3K/AKT/mTOR 通路.2015年，Ruolin Zhao等認為他們的實驗首次證明了桔梗皂苷-D（Platycodin-D）可以通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，激活JNK 和p38 MAPK 信號通路來誘導自噬，并因此推斷桔梗皂苷-D可成為非小細胞肺癌的替代治療藥物，但其具體作用機制和抗癌效果還沒完全研究清楚[22].在miR-16 mimics 可作為一種自噬誘導劑，增強喜樹堿等抗癌藥的抗癌效果的基礎上，Hui Wang等驗證了miR-16 mimics 靶向結合耐藥肺癌細胞內高表達的ATG3，激活自噬，抑制了TGF-β1 介導的EMT，減緩NSCLC 中的癌細胞轉移[23].另外，Aili Wang等表示姜黃素（Curcumin）也可作為mTOR 的抑制物，可抑制PI3K/mTOR 通路的活性，從而誘導細胞自噬，抑制非小細胞肺癌的發(fā)展，但其研究缺乏體內研究和臨床效用調查[24].

近年來越來越多的研究發(fā)現某些化合物也可作為克服NSCLC 的EGFR-TKI 耐藥性的輔助藥物.Teng Zhao 等認為藤黃酸（Gambogic acid）可在癌細胞已形成抗凋亡的情況下，促進細胞自噬性死亡，因此可作為非小細胞肺癌患者的一種輔助治療手段[25].而Hengyi Chen 等研究發(fā)現聯(lián)合使用二甲雙胍和伏立諾他可以通過誘導BIM 依賴的凋亡來克服EGFR-TKI 耐藥，有待成為一個新的克服EGFR-TKI 耐藥的方向[26].此外，Hyungmin Jeong 等通過體外系統(tǒng)篩選實驗發(fā)現從蔬菜，水果提取的多酚類化合物（包括兒茶酚水合物、咖啡酸、白藜蘆醇等）在克服NSCLC 的EGFR-TKI 耐藥性方面具有潛在的有效作用，可作為長期EGFR-TKI 治療肺癌病人的輔助藥物[27].其中，Michael Yousef等通過總結目前的體外和體內實驗結果，表明白藜蘆醇可以抑制癌細胞的增殖，誘導細胞周期阻滯和凋亡，有很好的抗癌作用[28].然而，對于多酚類化合物在非小細胞肺癌的EGFR-TKI 耐藥中的治療作用和拮抗EGFR-TKI耐藥的分子機制仍未得到充分研究.

與正常細胞相比，腫瘤細胞主要進行無氧酵解，因此需要消耗的葡萄糖更多，而有研究證明，多重耐藥腫瘤細胞會過表達與糖酵解有關的蛋白，更加依賴糖酵解存活.而低氧或葡萄糖缺乏的情況下，自噬會增加.利用這一點，Mingtong Ye 等用實驗證明，erlotinib 耐藥的肺癌細胞ER1-6 比敏感的肺癌細胞更依賴無氧酵解，提出抑制糖酵解可以克服EGFR-TKI 耐藥性，可在AKT 或自噬通路抑制劑的基礎上進行氧氣或葡萄糖剝奪可能作為新型的抵抗肺癌的EGFR-TKI 獲得性耐藥性方案的解決方法[29].

6 針對耐藥機制開發(fā)的新藥

最近有研究表明設計一個納米顆粒的藥物輸送系統(tǒng)- 多重耐藥基因1 抗體修飾的幾丁聚糖納米粒子（mAb MDR1-modified chitosan nanoparticles）來運載吉非替尼抗癌藥和自噬抑制劑氯喹，同時通過阻斷MDR1 受體，可以達到克服耐藥的目的.這種新方法既加強了抗癌藥和自噬調節(jié)劑的傳遞，使靶向治療定位更準確，同時可以抑制多重耐藥受體活性，使治療效果更明顯，是個重要的拮抗EGFR-TKI 耐藥的輔助策略[30].

通過對分子機制的研究，Yosuke Togashi，MD 等研究發(fā)現EGFR 突變的NSCLC細胞會出現較高表達水平的β-Catenin.應用β-Catenin 抑制劑XAV939 可以抑制與EGFR-TKI 耐藥形成相關的腫瘤干細胞的特性，增強EGFR-TKIs 在EGFR 突變的NSCLC 細胞系中的敏感性，提示β-Catenin 可能成為攜帶T790M 突變的NSCLC 新的治療靶點.

7 總結與展望

綜上所述，不同的NSCLC 患者患肺癌的分子機制不盡相同，EGFR-TKI 耐藥的機制也有所不同，但均與腫瘤細胞的自噬活動密切相關，因此通過分子檢查手段，深入到患者個體的耐藥機制，應用相關自噬抑制劑或誘導劑來拮抗EGFR-TKI 的耐藥性，才可以提高治療效果，避免盲目用藥.但目前許多關于抗非小細胞肺癌藥物的研究，其分子機制還不是很明確，是通過自噬影響腫瘤還是其他機制（例如凋亡），這方面的缺陷就還需研究者去填補，并建立有關數據庫，及時收錄和更新目前NSCLC 的藥物研究和新致癌基因、新通路數據，為研究者提供新的思路.臨床上，由于細胞信號通路的復雜性，抑制了腫瘤的某些信號通路，另一些通路卻代償性上調.因此，抑制信號通路的靶向治療應該是多靶點聯(lián)合用藥，效果可能會更好.尤其是長期用藥患者，聯(lián)合用藥可降低耐藥性.但耐藥后的治療目前仍沒有標準的治療方案，對各種不同耐藥機制的病人實現個體化治療將是最有效的治療手段.