葛根中葛根素提取工藝研究

孫艷雪 王玉華 楊 易 張 燁

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110

葛根[1]是豆科植物甘葛藤(粉葛)PuerariathomsoniiBenth.或野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi.的根。味甘、辛，性涼。 歸脾、胃、肺經(jīng)。有[2-4]解肌退熱、透疹、生津止渴、升陽止瀉、通經(jīng)活絡(luò)、解酒毒之功效。常用于外感頭痛發(fā)熱、項背強痛、麻疹不透、口渴、消渴、熱痢、泄瀉、眩暈頭痛、中風(fēng)偏癱、胸痹心痛、酒毒傷中。葛根中含有多種有效成分，主要為葛根素。近代有關(guān)研究表明，葛根素對突發(fā)性耳聾以及心腦血管疾病等有較好的療效[5-6]。隨著人們對葛根的藥理作用進行深入研究，將其當(dāng)作原料加工制作的各類食品藥品廣受國內(nèi)外民眾好評。目前常用于葛根素提取的方法有醇提法、水提法、微波輔助萃取法、超聲波輔助法等。

1 材料與方法

1.1 儀器 TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；電子天平TA1003(上海菁海儀器有限公司)；HH-2恒溫水浴鍋(常州市江南實驗儀器廠)；N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYEL4)。

1.2 試藥 葛根飲片購于國藥控股國大藥房內(nèi)蒙古有限公司，用粉碎機超微粉化后，用密封袋分兩次包裝備用；葛根素標(biāo)準(zhǔn)品(來源于中國食品藥品檢定研究院)。95%乙醇、實驗過程中所用蒸餾水、無水乙醇。

2 方法與結(jié)果

2.1 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱量葛根素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于50 mL的容量瓶中，加30%乙醇定容，即配制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的葛根素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL置于25 mL容量瓶中，加30%乙醇定容。以30%乙醇作空白對照，在波長為250 nm處測定吸光度，并繪制吸光度和質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇濃度對葛根素提取率的影響 精密稱取3份10.000 g的葛根粉，分別加入相95%乙醇、75%乙醇和50%乙醇(固液比1∶20 g/mL)，在90 ℃恒溫水浴下用索氏提取器回流提取60 min，所得溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑后用30%乙醇稀釋，取樣，在250 nm處測定吸光度并記錄數(shù)據(jù)。

2.2.2 提取時間對葛根素提取率的影響 稱取3份10.000 g的葛根粉，按照固液比1∶20(g/mL)加入相應(yīng)量的95%乙醇，在90℃恒溫水浴下分別用索氏提取器回流提取90 min、75 min、60 min，所得溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑后用30%乙醇稀釋，取樣，在250 nm處測定吸光度并記錄數(shù)據(jù)。

2.2.3 提取溫度對葛根素提取率的影響 稱取3份10.000 g的葛根粉，按照固液比1∶20(g/mL)加入相應(yīng)量的95%乙醇，分別在90℃、85℃、80℃恒溫水浴下用索氏提取器回流提取60 min，所得溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑后用30%乙醇稀釋，取樣，在250nm處測定吸光度并記錄數(shù)據(jù)。

2.2.4 乙醇濃度對葛根素提取率的影響 稱取3份10.000 g的葛根粉，分別按照固液比1∶15、1∶20、1∶25(g/mL)加入相應(yīng)量的95%乙醇，在90℃恒溫水浴下用索氏提取器回流提取60 min，所得溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑后用30%乙醇稀釋，取樣，在250 nm處測定吸光度并記錄數(shù)據(jù)。

2.3 正交試驗 葛根素提取的因素很多，通過單因素試驗確定了各因素的最優(yōu)水平。但考慮到各因素之間的相互影響，以紫外分光光度法測得的葛根素含量為參考指標(biāo)，采用正交L9(34)試驗設(shè)計，研究葛根素的最佳提取條件。正交試驗因素水平見表1。

2.4 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線 以葛根素質(zhì)量吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，可獲得線性回歸方程：y=0.1313x-0.101(R2=0.9982) 式中：y為吸光度；x為質(zhì)量濃度(μg/mL)。結(jié)果表明，葛根素質(zhì)量濃度在1.6～9.6 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。如圖1所示。

表1 正交試驗因素水平

2.5 單因素試驗

2.5.1 乙醇濃度對葛根素提取率的影響 選擇最合適的溶劑從樣品基質(zhì)中提取目標(biāo)分析物是開發(fā)提取方法的基礎(chǔ)步驟。離子液體作為一種環(huán)境友好的綠色溶劑，在過去的幾十年中得到了越來越多的關(guān)注。然而，離子液體也有一些缺點，包括太昂貴而不能大規(guī)模用于商業(yè)生產(chǎn)，難以再生和有一些毒性等。為此，對不同濃度乙醇對葛根素提取率的影響進行研究。前人對不同乙醇濃度下超聲法提取葛根素的提取率進行了研究，發(fā)現(xiàn)50%乙醇才是最佳選擇。而從表1、圖2可以看出當(dāng)乙醇濃度為75%時提取出的葛根素濃度最高，由此可知，增加乙醇濃度可以提高提取效率。

2.5.2 提取時間對葛根素提取率的影響 如表2、圖3所示，隨著提取時間的延長，葛根素的提取率75 min達(dá)到最大值，隨后提取時間越長，提取率越低，這可能是由于在較長時間的加熱過程中部分葛根素被破壞所致。而前人同樣對不同提取時間下超聲法提取葛根素的提取率進行了研究，發(fā)現(xiàn)75 min是最優(yōu)選擇。

表1 乙醇濃度對葛根素提取率的影響

表2 提取時間對葛根素提取率的影響

2.5.3 提取溫度對葛根素提取率的影響 圖4表明，在 85 ℃溫度時，葛根素的產(chǎn)率達(dá)到頂峰，這可能是由于升高溫度導(dǎo)致細(xì)胞基質(zhì)的打開，從而提高葛根素的提取效率，也可能是在高溫下，溶劑粘度降低，擴散系數(shù)增大，從而提高了提取效率。而在 90 ℃時，葛根素的產(chǎn)率反而下降，這可能是高溫下葛根素的分解和燒焦所致。而前人同樣對不同溫度下超聲法提取葛根素的提取率進行了研究，發(fā)現(xiàn) 85 ℃是最優(yōu)工藝條件。

2.5.4 固液比對葛根素提取率的影響 固液比是提高葛根素提取率的一個重要因素。一般來說，溶劑體積越大，提取率越高,然而較高的溶劑體積會使操作困難，導(dǎo)致不必要的浪費。采用不同的固液比進行了一系列實驗，以評價固液比的影響。從表4、圖5可以看出葛根素提取率在固液比1∶25時達(dá)到頂峰。

表3 提取溫度對葛根素提取率的影響

表4 固液比對葛根素提取率的影響

2.6 正交試驗 對表5數(shù)據(jù)進行極差分析可得，極差最大的因素是乙醇濃度，葛根素濃度提取率最高的乙醇濃度為75%，這與單因素試驗的結(jié)果一致，說明乙醇濃度的最佳選擇為75%；其次是提取溫度，根據(jù)上述結(jié)果，單因素試驗確定在 85 ℃時葛根素提取率最高，而由于各因素間的相互作用，正交試驗最終決定采用 90 ℃作為最佳提取溫度；再次是固液比，從單因素試驗結(jié)果可以看出，葛根素提取率在固液比1∶20時達(dá)到頂峰，但同樣由于各因素間的相互作用，同時考慮到試驗誤差的影響，最終選用1∶25為最佳固液比；極差最小的因素是提取時間，單因素試驗與正交試驗一致得出了提取時間為 75 min時提取效果最佳。綜上所述，在乙醇濃度為75%、提取溫度為 90 ℃、固液比為 1∶25的條件下提取75 min所得葛根素濃度最高，提取率最高。

表5 正交試驗表

2.7 驗證實驗 在最佳提取條件(即乙醇濃度為75%、提取溫度為 90 ℃、固液比為1∶25、提取時間為75 min)下，重復(fù)3次，所得結(jié)果見表6。

表6 驗證實驗表

結(jié)論：經(jīng)過驗證，該工藝有效可靠。

3 討論

本實驗經(jīng)過單因素試驗與正交試驗相結(jié)合的方法并計算K值與R值，結(jié)果表明影響葛根素提取效率的因素按值依次遞減為A>D>C>B，因此，當(dāng)乙醇濃度、提取時間、固液比、提取溫度分別為A2、B2、C3、D1(即75%、75 min、1∶25、90℃)時，可獲得最高的葛根素濃度。

本實驗所得結(jié)果與前人超聲波輔助提取葛根黃酮的工藝進行對比，研究發(fā)現(xiàn)，乙醇熱回流法提取葛根素的提取率比超聲法略高，但二者相比，乙醇熱回流法溶劑用量大，耗時長、能耗高、且由于經(jīng)常需要加熱處理，可能會造成原料的浪費，操作難度大；而超聲法具有效率高、耗時短、雜質(zhì)少、溶劑用量少、成本低、綠色環(huán)保等特點，所以其在葛根等藥材提取的工業(yè)化生產(chǎn)上更加具有良好的應(yīng)用前景。

葛根藥理活性良好，毒副作用較少，其化學(xué)成分葛根素除了具有心肌保護作用和缺血再灌注損傷的保護作用外，還具有抗氧化、降血糖，降血壓及降血脂等作用[7-12]。因此葛根是一種發(fā)展?jié)摿薮蟮乃幬?，如何高效綠色，工業(yè)化的對葛根有效成分進行提取成為當(dāng)今人們的熱門話題。本實驗通過對乙醇熱回流法提取葛根素的工藝條件進行優(yōu)化，同時與超聲法進行對比，以期為其他葛根素提取研究提供理論依據(jù)。