檳榔內(nèi)生真菌的分離與鑒定

易天鳳 吳友根 于靖 張軍鋒 楊東梅 姚廣龍 卓小壘

【摘?要】?目的：對檳榔根、葉和果的內(nèi)生真菌進行分離及鑒定，并對其多樣性分析。方法：采用平板分離法分離內(nèi)生真菌，采用ITS序列分析鑒定內(nèi)生真菌菌屬。結(jié)果：從檳榔的根、葉和果中分離獲得53株內(nèi)生真菌，并鑒定為9個屬，分別為曲霉屬Aspergillus、刺盤孢屬Colletotrichum、鐮刀菌屬Fusarium、毛雙孢屬Lasiodiplodia、Meyerozyma?sp.、青霉屬Penicillium、擬莖點霉屬Phomopsis、Pleosporales?sp.、木霉屬Trichoderma;其中優(yōu)勢菌屬為木霉屬Trichoderma;葉部內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)（1.11）要高于根（0.87）和果（0.87）;葉（0.57）比根（0.41）和果（0.41）的均勻度高;且檳榔根與葉、根與果、果與葉之間的內(nèi)生真菌相似程度較高。結(jié)論：檳榔內(nèi)生真菌的多樣性將為檳榔內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物活性研究及新化合物的開發(fā)和挖掘，進而充分發(fā)揮其藥用價值。

【關(guān)鍵詞】?檳榔;內(nèi)生真菌;木霉屬

【中圖分類號】R285.5?【文獻標(biāo)志碼】?A【文章編號】1007-8517（2019）23-0022-06

Isolation?and?Identification?of?Endophytic?Fungi?from?Areca?catechu?L.

YI?Tianfeng?WU?Yougen*?YU?Jing?ZHANG?Junfeng?YANG?Dongmei?YAO?guanglong?ZHUO?Xiaolei

College?of?Horticulture，?Hainan?University，?Haikou?570228，?China

Abstract：Objective?To?isolate?and?identify?endophytic?fungi?from?the?roots，?leaves?and?fruits?of?Areca?catechu?L?.，?and?analyze?its?diversity.?Methods?Endophytic?fungi?were?isolated?by?plate?separation?method，?and?endophytic?fungi?were?identified?by?ITS?sequence?analysis.?Results?53?endophytic?fungi?were?isolated?from?the?roots，?leaves?and?fruits?of?betel?nut，?which?belonged?to?9?genus?of?Aspergillus，?Colletotrichum，?Fusarium，?Lasiodiplodia，?Meyerozyma?sp.，?Penicillium，?Phomopsis，?Pleosporales?sp.，?Trichoderma.?The?dominant?genus?is?Trichoderma.?The?endophytic?fungi?diversity?index?（1.11）?is?higher?than?root?（0.87）?and?fruit?（0.87）.The?uniformity?of?leaf?（0.57）?radix?（0.41）?and?fruit?（0.41）?High，?and?endophytic?fungi?between?roots?and?leaves，?roots?and?fruits，?fruits?and?leaves?have?higher?level?of?similarity.?Conclusion?The?diversity?of?endophytic?fungi?in?Areca?catechu?L?.?will?for?the?study?of?endophytic?fungal?metabolite?activity?and?the?development?and?excavation?of?new?compounds，?so?as?to?give?full?play?to?its?medicinal?value.

Keywords：Areca?catechu?L?.，?Endophytic?fungus，?Trichoderma

檳榔（Areca?catechu?L?.）為棕櫚科檳榔屬常綠喬木，原產(chǎn)于東南亞，目前主要種植于我國的海南省，產(chǎn)量已經(jīng)占總產(chǎn)量的90%以上，是海南省除橡膠產(chǎn)業(yè)之外的第二大支柱產(chǎn)業(yè)[1-2]。經(jīng)國家批準(zhǔn)，檳榔在海南省已經(jīng)被列入生態(tài)經(jīng)濟林樹種。檳榔還具有重要的藥用價值，位居中國四大南藥之首，其果實、種子、皮、花均可入藥。

植物內(nèi)生真菌是指那些能在健康植物的不同組織或者細胞內(nèi)生存，對植物組織不會引起病害癥狀的真菌[3]。一些內(nèi)生真菌可形成與宿主植物具有明顯區(qū)別的代謝系統(tǒng)，進而產(chǎn)生具有很多豐富作用的次生代謝產(chǎn)物[4]。而藥用植物的內(nèi)生真菌的研究是從1993年開始，由于能從短葉紫杉的樹皮中分離出紫杉醇，這給尋找功能性植物內(nèi)生真菌提供了一個可靠的依據(jù)。種類豐富的內(nèi)生真菌，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多種多樣，作用十分豐富的次生代謝產(chǎn)物，這給今后其他植物的病蟲害防治提供一個新的思路[5-7]。由于內(nèi)生真菌與宿主之間的聯(lián)系與作用，使得在植物中內(nèi)生真菌的研究具有十分重要的優(yōu)勢。利用現(xiàn)代的技術(shù)手段，提高目標(biāo)化合物的產(chǎn)量，避免了資源浪費，同時還可以保護環(huán)境[8]。因此，在人們探索生物活性物質(zhì)資源時，內(nèi)生真菌具有其獨特優(yōu)勢。

目前，有關(guān)檳榔內(nèi)生真菌分離鑒定及其次生代謝產(chǎn)物相關(guān)的研究報道很少。宋薇薇等[9]從檳榔根、葉、花中分離純化得到47株內(nèi)生真菌，鑒定屬于8個屬。很多研究報告發(fā)現(xiàn)木霉屬真菌可產(chǎn)生一些生物堿以及其他活性物質(zhì)，可見，研究檳榔內(nèi)生真菌對新活性物質(zhì)的收集有良好的前景。本研究以檳榔根，葉，果為研究對象，根據(jù)ITS序列分析鑒定組織內(nèi)生真菌，為進一步開展檳榔內(nèi)生真菌資源收集與藥用價值開發(fā)。

1?材料與方法

1.1?實驗材料?本研究的植物材料采自2018年9月份萬寧市山根鎮(zhèn)（N18°58′8.52″，?E110°28′56.28″）和萬寧市北大鎮(zhèn)（N18°91′8.50″，?E110°29′64.30″）健康的檳榔樹（Areca?catechu?L?.）。主要試劑：PDA固體培養(yǎng)基;馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）液體培養(yǎng)基;8?%次氯酸鈉溶液;75?%酒精;真菌基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶Solarbio科技有限公司）;測序引物序列為ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3;ITS1F：5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3（由天一輝遠生物科技有限公司合成）。

1.2?檳榔內(nèi)生真菌分離?采取健康新鮮的檳榔根、葉、果，用超純水沖洗干凈后使用2.6%次氯酸鈉和75%乙醇浸泡，浸泡時間設(shè)置5個梯度25個組合（次氯酸鈉設(shè)置時間梯度：?30s、45s、60s、75s、90s;?乙醇設(shè)置時間梯度：?30s、60s、90s、120s、150s），再用無菌水沖洗3～5次。根用消毒手術(shù)刀切去頭尾，再把中間部位切成0.5～1cm長的小段;用消毒手術(shù)刀將葉邊緣部分去除，切分成0.5cm×0.5cm大小的組織塊;用消毒手術(shù)刀將果縱切后橫切為0.5cm×0.5cm。將配好的PDA培養(yǎng)基進行滅菌，滅菌均采用LDZX-50KBS高溫高壓滅菌鍋（生產(chǎn)于上海申安有限公司），滅菌條件為121℃、20min。把各組織塊分別放在滅菌的PDA固體培養(yǎng)基平板上，2min后取出放入另外干凈PDA固體培養(yǎng)基平板上，再將最后一次清洗組織塊的無菌水用移液槍吸取少量滴入PDA培養(yǎng)基中，并在實驗過程中放入空白對照，于溫度25℃恒溫箱中培養(yǎng)5d左右，多次純化后試管保存。

1.3?測序鑒定?從保存的試管中刮取菌絲體接種到馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）液體培養(yǎng)基中，放入50rpm/min恒溫?fù)u床在25℃、黑暗條件下進行培養(yǎng)，參照真菌基因組DNA提取試劑盒的使用方法提取檳榔內(nèi)生真菌DNA，再進行PCR反應(yīng)（反應(yīng)體系設(shè)置為25μL，反應(yīng)條件為94℃?5min;?94℃?40s，55℃?40s，?72℃?55s，?35個循環(huán);72℃?10min，?4℃?∞）。采用AGT9601PCR擴增儀（生產(chǎn)于杭州安杰思醫(yī)學(xué)科技有限公司）進行擴增，PCR擴增產(chǎn)物送往鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進行測序。

1.4?數(shù)據(jù)處理?用Excel?2016軟件處理數(shù)據(jù)，NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行序列比對，MEGA5.2軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2?結(jié)果與分析

2.1?檳榔內(nèi)生真菌分離及DNA擴增?通過平板分離法對檳榔內(nèi)生真菌進行分離純化，表面消毒檢測情況顯示對照組無明顯菌落長出，表明試驗材料表面已消毒徹底，分離獲得的菌株來自檳榔組織內(nèi)部。將分離得到的檳榔內(nèi)生真菌進行DNA提取及rDNA-ITS序列PCR擴增，1.0?%瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴增序列條帶在600bp左右。如圖1所示。

2.2?檳榔內(nèi)生真菌鑒定?經(jīng)過測序鑒定獲得了53株檳榔內(nèi)生真菌，從根、葉和果中分離獲得到的內(nèi)生真菌分別占14株、25株和14株（表1、表2）。通過BLAST比對初步鑒定為9個屬，分別為曲霉屬Aspergillus、刺盤孢屬Colletotrichum、鐮刀菌屬Fusarium、毛雙孢屬Lasiodiplodia、Meyerozyma?sp.、青霉屬Penicillium、擬莖點霉屬Phomopsis、Pleosporales?sp.、木霉屬Trichoderma。基于ITS序列分析將G9-1-2、F20、G14、Y27、F13、F28、G21建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），各菌株與其相似菌株的支持度可達100?%。木霉屬Trichoderma在檳榔內(nèi)生真菌中為優(yōu)勢菌屬，菌株比例達到了26.42%?（表2）;葉部優(yōu)勢菌屬也為木霉屬;而根部的優(yōu)勢菌屬為曲霉屬Aspergillus。

2.3?檳榔內(nèi)生真菌多樣性分析?根據(jù)Shannon-Wiener?多樣性指數(shù)（H′），檳榔根、葉和果的H′值分別為0.86、1.11和?0.86，其中葉部內(nèi)生真菌的多樣性最高;葉（0.57）比根（0.41）和果（0.41）的E值高，表明葉部內(nèi)生真菌較為豐富且分布均勻。從根、葉和果3個部位的內(nèi)生真菌種類的相似性指數(shù)來看，Cs都在0.8以上，說明各部位之間的真菌種類極為相似（表3）。從檳榔根、葉、果中分離得到的53株內(nèi)生真菌中曲霉屬Aspergillus、刺盤孢屬Colletotrichum、Meyerozyma?sp.、青霉屬Penicillium、木霉屬Trichoderma在三個部位都存在;而鐮刀菌屬Fusarium只在葉和果中獲得，毛雙孢屬Lasiodiplodia只分布于根和果中，擬莖點霉屬Phomopsis只在根與葉中存在，Pleosporales?sp.則在分離于根和果，說明同一菌屬在不同部位分布存在差異（表2）。

3?討論

自20世紀(jì)70年代，內(nèi)生真菌被廣泛研究，尤其在經(jīng)濟林木及藥用植物，包括一些藻類、蕨類都發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生真菌[10]。而且在同一種植物中可分離出數(shù)十種內(nèi)生真菌，多則上百種，尤其從熱帶雨林植物中分離獲得的內(nèi)生真菌多樣性突出。本實驗在檳榔不同根、葉、果中分離鑒定了53株內(nèi)生真菌，鑒定為9個屬，其中優(yōu)勢菌屬為木霉屬Trichoderma，且檳榔各組織的內(nèi)生真菌分布也有差異，其葉部內(nèi)生真菌分布較為豐富;而一些菌屬存在于特定組織，例如毛雙孢屬Lasiodiplodia只分布于根和果中。大量的研究也表明，內(nèi)生真菌存在于植物組織內(nèi)，不僅表現(xiàn)了普遍性，而且表現(xiàn)出多樣性。本試驗中根、葉和果3個部位的內(nèi)生真菌種類的相似性指數(shù)Cs都在0.8以上，說明各部位之間的真菌種類極為相似。而大多數(shù)植物內(nèi)生菌分布于植物不同的組織和器官內(nèi)，并且宿主植物和內(nèi)生真菌的種屬往往決定了它們的分布情況[11-12]。本實驗在檳榔不同部位分離的內(nèi)生真菌種屬存在差異，這樣的實驗結(jié)果可能表明檳榔不同組織結(jié)構(gòu)以及不同的營養(yǎng)條件而導(dǎo)致植物體內(nèi)微環(huán)境有差異[13]。木霉屬從檳榔中分離的比例較高，達到了26.42%，且該屬主要分布于葉部說明該屬內(nèi)生真菌表現(xiàn)出不同的器官或組織偏好性[14]。這與宋薇薇[9]的研究結(jié)果有差異，宋薇薇從檳榔根、葉和花中分離獲得的青霉屬（31.91%）和鐮刀菌屬（27.66%）為優(yōu)勢菌屬，這可能由于種植環(huán)境條件及分離部位的差異造成[15]。

目前，很多學(xué)者對藥用植物的內(nèi)生真菌進行深入探索，大量研究表明植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生和宿主植物相同、類似或結(jié)構(gòu)新穎的次級代謝產(chǎn)物，目前在藥用研究及應(yīng)用上有很大的前景。張杰[16]從蛇足石杉莖中分離得到1株產(chǎn)生物堿的內(nèi)生真菌菌株LYS081，初步鑒定也為木霉屬（Trichoderma）。檳榔中檳榔生物堿是主要活性物質(zhì)，而檳榔生物堿有改善胃腸功能，治療糖尿病，促進神經(jīng)興奮，預(yù)防癌癥和保護血管等作用[17]。這為有效挖掘檳榔藥用價值提供了重要線索。因此，本研究對檳榔內(nèi)生真菌的分離鑒定將為檳榔內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物活性研究及新化合物的開發(fā)和挖掘提供了前提條件。

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（收稿日期：2019-09-24?編輯：劉?斌）

基金項目：海南省自然科學(xué)基金項目（201608364）。

作者簡介：易天鳳（1993-），女，漢族，碩士，研究方向為藥用植物資源開發(fā)與應(yīng)用。E-mail：ytf9316@163.com

通信作者：吳友根（1975-），男，漢族，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為南藥植物資源開發(fā)與利用。E-mail：?wygeng2003@163.com