宿主miRNA-2127靶向p53促進禽流感病毒H9N2亞型體外復制的分子機制

張玉霞 袁小遠 楊金興 孟凱

摘要：為研究雞體內miRNA-2127對低致病性禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）H9N2復制的影響，本研究將化學合成的gga-miR-2127模擬物和抑制劑分別轉染DF-1細胞，接種H9N2亞型病毒，檢測細胞中病毒含量變化，發(fā)現(xiàn)gga-miR-2127能夠顯著促進病毒的復制。為探索其中的分子機制，用生物信息學軟件預測gga-miR-2127的調控位點位于p53基因mRNA的3′UTR區(qū)，并用雙熒光素酶報告系統(tǒng)對其靶向關系進行了驗證。熒光定量RT-PCR法和Western blot試驗表明，gga-miR-2127過表達時p53的mRNA水平不變而p53蛋白表達水平降低，細胞天然免疫機能下降。據(jù)此推測gga-miR-2127促進H9N2復制的分子作用機理是在p53基因的mRNA轉錄后，通過gga-miR-2127與其mRNA的3′UTR區(qū)結合，抑制p53蛋白的翻譯從而抑制抗病毒作用和細胞的天然免疫機能。

關鍵詞：H9N2亞型禽流感病毒;gga-miR-2127;分子機制

中圖分類號：S852.65+7?文獻標識號：A?文章編號：1001-4942（2019）12-0091-05

Abstract?To study the effect of miRNA-2127 on the replication of low pathogenic AIV?（avian influenza virus） subtype H9N2 in vitro， chemically synthesized gga-miR-2127 mimic and inhibitor were transfected into DF-1 cells inoculated with H9N2 subtype， and the changes of virus content in cells were detected. It was found that gga-miR-2127 could significantly promote the replication of AIV virus. In order to explore the molecular mechanism， the regulatory site of gga-miR-2127 was predicted as 3′UTR region of mRNA of p53 gene by bioinformatics software， and the targeting relationship was validated by double luciferase reporting system. Fluorescence quantitative RT-PCR and Western blot assay showed that the mRNA of p53 gene remained unchanged while the expression of p53 protein decreased under the condition of?overexpressing gga-miR-2127， and the innate immune function of cells decreased. It was speculated that the molecular mechanism of gga-miR-2127 promoting H9N2 replication was through inhibiting the translation of p53 protein by binding with the 3′UTR region of p53 gene after transcription， so the antiviral effect and the realization of cell innate immune function were inhibited.

Keywords?H9N2 subtype avian influenza virus; gga-miR-2127; Molecular mechanism

H9N2型低致病性禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）自1994年在廣東省首次分離到以來，一直是危害我國雞群的主要低致病性AIV亞型。該病毒不僅能引起禽呼吸道系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)疾病，造成蛋禽產蛋率下降，肉禽生長緩慢，同時引起患病機體免疫抑制并激發(fā)其他病原微生物混合感染，造成家禽死亡[1]。

AIV感染家禽后，病毒與機體免疫系統(tǒng)的互相作用直接關系到家禽的預后，研究探索如何提高機體抗病毒的免疫機能，調控感染家禽向健康方向發(fā)展非常必要。p53蛋白是一種分子量為53 kD的磷酸化蛋白，在機體上皮和造血細胞中廣泛表達，除了作為熱門的腫瘤抑制蛋白被大量研究之外，p53蛋白在抗病毒[2]及增強宿主的先天及獲得性免疫力[3]方面也有重要作用。因此，如何激活p53蛋白表達，使其發(fā)揮抗病毒作用，是一項值得深入研究的課題。2006年，Voorhoeve等[4]首次發(fā)現(xiàn)miRNA參與p53信號通路，是p53信號通路調控網(wǎng)絡中關鍵的分子。近幾年，miRNA在人類抗病毒治療中已開展了廣泛的研究。目前雞體內已發(fā)現(xiàn)miRNA幾千種之多，但是對其功能卻知之甚少。本研究根據(jù)前期研究中H9N2感染DF-1細胞后miRNA的差異表達，篩選了顯著升高的miRNA-2127，觀察其對p53蛋白的影響以及與H9N2病毒復制的關系，并試圖闡明背后的分子調控機制，以期為抗擊禽流感病毒提供更深層次的解讀，為開發(fā)更廣譜的抗病毒基因藥物及尋找新抗病毒靶點奠定理論基礎。

1?材料與方法

1.1?毒株和試劑

病毒RNA提取試劑盒，反轉錄試劑盒，一步法RT-PCR試劑盒，購自大連TaKaRa公司;轉染試劑Iipofectamine 3000，購自Invitrogen 公司;pmiR-RB-REPORTTM雙熒光素酶報告載體及檢測試劑盒，購自Promega公司;兔抗p53蛋白抗體，購自Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基，opti-DMEM培養(yǎng)基，犢牛血清，均為Gibico產品。

H9N2亞型1402毒株，由華南農業(yè)大學動物醫(yī)學院惠贈;DF-1細胞，為本實驗室保存。

gga-miR-2127分子的模擬物與抑制物，購自廣州市銳博生物科技有限公司。模擬物能模擬細胞內成熟miRNA的高水平表達，以增強內源性miRNA的調控作用;抑制物可以特異地與成熟miRNA結合而抑制其作用，削弱細胞中miRNA導致的基因沉默效應，從而進行miRNA功能缺失性研究。

1.2?gga-miR-2127對H9N2病毒復制的影響試驗

預鋪DF-1細胞于24孔板，轉染前細胞密度達到50%以上。按Iipofectamine 3000說明書用opti-DMEM培養(yǎng)液分別稀釋gga-miR-2127模擬物與抑制物和轉染試劑，二者混合置室溫孵育20 min，分別轉染DF-1細胞，24 h后接種H9N2禽流感病毒，1 h后棄去病毒液，加含2%犢牛血清的DMEM培養(yǎng)液37℃繼續(xù)培養(yǎng)。于病毒感染24、36、48 h后分別收集細胞各3孔。按照病毒RNA提取試劑盒說明書提取細胞內的病毒RNA，利用反轉錄試劑盒將其轉為cDNA，-80℃保存?zhèn)溆?。參考GenBank發(fā)布的多株H9N2禽流感病毒M基因序列，設計特異性引物（H9N2-M-F/H9N2-M-R）（表1），由北京六合華大基因科技有限公司合成，熒光定量PCR法檢測細胞內H9N2病毒含量，并同步設立gga-miR-2127抑制物轉染組、NC對照組（轉染時只加等量opti-DMEM培養(yǎng)液）。

1.3?gga-miR-2127調控H9N2病毒復制的分子機制分析

1.3.1?gga-miR-2127靶基因預測與驗證?利用生物信息學方法（TargetScan、PicTar、miRanda），并參考miRNA數(shù)據(jù)庫（http：//www.mirbase.org）分析預測gga-miR-2127的靶基因及其結合位點。

預測發(fā)現(xiàn)，gga-miR-2127的靶基因結合位點位于p53基因mRNA的3′UTR區(qū)，為對此靶向關系進行驗證，通過全基因合成方法合成了該結合位點的野生型與突變型模板，并分別將其克隆到pmiR-RB-REPORTTM雙熒光素酶報告載體中，構建該結合位點的野生型與突變型重組雙熒光素酶報告質粒。將野生型報告質粒、突變型報告質粒分別與gga-miR-2127共轉染DF-1細胞，同步設立陰性質粒與gga-miR-2127共轉染DF-1細胞對照組，利用雙熒光素酶檢測試劑盒分析各組中熒光素酶活性的變化。

1.3.2?gga-miR-2127分別對p53在基因水平和蛋白水平上表達的影響檢測?將gga-miR-2127轉染DF-1細胞，接種H9N2亞型病毒1402毒株，在接種24、36、48 h后用TRIZOL收集細胞，-80℃保存?zhèn)溆?。參考GenBank發(fā)布的p53基因序列，設計特異性熒光定量PCR引物（p53-F/p53-R）（表1）。TRIZOL法提取不同時間點細胞中的RNA，熒光定量分析不同時間點細胞內p53基因mRNA的表達水平。

收集轉染過gga-miR-2127并接種H9N2 亞型病毒的DF-1細胞培養(yǎng)物，采用Western blot方法[5]檢測p53蛋白在細胞中的表達水平，同步設立未轉染gga-miR-2127的DF-1感染H9N2 亞型病毒的對照組。

1.3.3?gga-miR-2127對多種細胞因子、炎性因子及抗病毒天然免疫基因表達的影響檢測?通過NCBI中Primer-BLAST工具對干擾素（IFN-α）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白介素（IL-1β）、抗病毒因子OAS（2′， 5′-oligoadenylate synthetase）基因及內參基因（β-actin）設計引物（表1），檢測不同時間內轉染gga-miR-2127模擬物和抑制物對上述抗病毒天然免疫基因及細胞因子的影響。

2?結果與分析

2.1?gga-miR-2127對H9N2病毒復制的影響

對DF-1細胞內的H9N2 亞型病毒RNA進行熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)隨著PCR循環(huán)次數(shù)的增加，熒光強度也增強，gga-miR-2127模擬物能夠促進病毒的復制，與抑制物相比有顯著差異，36 h時差異最顯著（圖1）。

2.2?gga-miR-2127靶基因的生物信息預測及靶向功能驗證

生物信息法預測gga-miR-2127與p53 基因mRNA的3′UTR區(qū)結合，結合位點位于3′UTR區(qū)369 ～ 375 bp之間。根據(jù)該結合位點構建了野生型與突變型重組雙熒光素酶報告質粒，并將它們分別與gga-miR-2127共轉染DF-1細胞后監(jiān)測熒光素酶活性變化。結果顯示，共轉染野生型報告質粒與gga-miR-2127的DF-1細胞組（gga-miR-2127+野生型）與只轉染野生型報告質粒組（NC+野生型）相比熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），而突變型報告質粒與gga-miR-2127共轉染組（gga-miR-2127+突變型）較gga-miR-2127+野生型組顯著提高（P<0.05），gga-miR-2127+突變型組、NC+突變型組和NC+野生型組之間差異不顯著（P>0.05）（圖2），說明gga-miR-2127能夠靶向調控p53基因。

2.3?H9N2感染對p53活性的影響

熒光定量PCR檢測結果顯示轉染gga-miR-2127模擬物并接種H9N2病毒的DF-1細胞中p53的mRNA表達水平與轉染gga-miR-2127抑制物組及空白對照組之間差異不大，說明gga-miR-2127未對p53基因轉錄產生影響。

采用Western blot法分析兩組細胞中p53蛋白的表達含量，結果顯示，轉染gga-miR-2127模擬物組較空白對照組DF-1細胞中的p53蛋白表達量降低（圖3）。

2.4?gga-miR-2127對多種細胞因子的影響

通過對細胞培養(yǎng)物中TNF-α、IL-1β及OAS、IFN-α中的mRNA水平進行免疫熒光PCR定量分析，結果顯示，gga-miR-2127模擬物轉染組中TNF-α、IL-1β 含量高于gga-miR-2127抑制組，而OAS、IFN-α則明顯低于gga-miR-2127抑制物轉染組和空白對照組（圖4）。

3?討論與結論

miRNA是一類長度在21 ～ 25個核苷酸組成的內源性單鏈非編碼小RNA，廣泛存在于人與各種動植物體內。人體內的miRNA在抗擊口蹄疫病毒、H1N1流感病毒等多種病毒的過程中起到干擾病毒復制和調控病毒基因表達、激活干擾素等抗病毒基因的作用[6，7]。本研究結果顯示，gga-miR-2127的模擬物顯著增強了體外H9N2病毒的復制，且具有時間依賴性，在病毒接種后36 h差異最顯著。因此，gga-miR-2127可促進H9N2禽流感病毒的體外復制。

miRNA在基因調控網(wǎng)絡中有重要地位，據(jù)預測生物體內1/3的mRNA受miRNA調控。其調控方式主要有兩種：一是與mRNA直接完全互補，引起靶基因mRNA的降解[8];二是通過與靶基因的3′UTR之間形成不完全堿基互補，誘導靶基因mRNA降解或阻遏其翻譯[9]。基于miRNA靶基因的預測規(guī)則，人們開發(fā)了相應的在線軟件，也建立了完善的試驗方法驗證miRNA靶基因。本研究預測gga-miR-2127的靶基因位點位于p53基因mRNA的3′UTR區(qū)。一般條件下，miRNA跟NC對照相比，野生型載體報告熒光有所下調，則認為miRNA對報告基因有調節(jié)作用[10]。本研究共轉染結合位點的野生型+gga-miR-2127組較共轉染結合位點的野生型+NC對照組和突變型+gga-miR-2127組熒光素酶活性均明顯降低，說明gga-miR-2127確實與p53基因mRNA的3′UTR區(qū)結合，可靶向調控p53基因。

對gga-miR-2127轉染后DF-1細胞中的p53基因的mRNA含量進行檢測發(fā)現(xiàn)，gga-miR-2127含量對其無顯著影響，而p53蛋白表達與gga-miR-2127呈負相關，轉染gga-miR-2127模擬物組p53蛋白的表達含量較未轉染組表達明顯降低，表明gga-miR-2127負調控p53蛋白的表達。據(jù)此推測，gga-miR-2127是在p53基因轉錄后負調控蛋白表達。因此，gga-miR-2127與miR-1285[11]、miR-125a[12]、miR-33[13]和miR-504[14]等相同，均可直接作用于p53基因mRNA的3′UTR區(qū)，從而在轉錄水平上負調控p53蛋白的表達。

病原微生物感染宿主后，激活宿主的天然免疫應答，誘導產生多種炎性因子和抗病毒基因抵抗微生物損傷。TNF-α是一種腫瘤壞死因子，IL-1β是體內常見的炎性細胞因子，本研究表明隨著細胞內H9N2病毒含量的增加，gga-miR-2127模擬物轉染組中二者相對于gga-miR-2127抑制組和NC對照組顯著增加。OAS為抗病毒天然免疫基因，IFN-α是具有抗病毒、調節(jié)免疫功能活性的蛋白質，因此本試驗選取在機體抗病毒天然免疫中占重要地位的二者為代表研究gga-miR-2127轉染后細胞免疫機能的變化。本研究中，二者模擬物轉染組隨p53蛋白下降呈現(xiàn)抑制狀態(tài)，表明二者均受p53蛋白轉錄激活參與調控網(wǎng)絡，這與Ouyang[15]、Zuniga[16]等研究基本一致。

由于宿主體內miRNA數(shù)目繁多，一個miRNA可調控多條mRNA，病毒利用這些宿主細胞的miRNA通路可促進病毒在體內的復制，同時病毒本身也可編碼miRNA，并利用這些miRNA靶向結合宿主或病毒基因以逃避抗病毒反應。因此，病毒與miRNA的調控關系是復雜的。

綜上，gga-miR-2127體外過表達能夠促進H9N2亞型病毒體外復制，其可能的分子機制是在p53基因的mRNA轉錄后，通過與其mRNA的3′UTR區(qū)結合，抑制p53蛋白的翻譯從而抑制其抗病毒作用。因此家禽H9N2疫情感染時，通過對gga-miR-2127進行調控，以此發(fā)揮p53蛋白的抗病毒能力及提高機體先天免疫力或許是治療H9N2疫病的新途徑。

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