藥物性肝損害病因及診治研究進展

簡 鳴,陽學(xué)風(fēng),周 爽,皮益苑,雷小勇

簡鳴,周爽,皮益苑,雷小勇,南華大學(xué)藥物藥理研究所 湖南省衡陽市 421001

陽學(xué)風(fēng),南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院消化內(nèi)科 湖南省衡陽市 421002

核心提要：藥物性肝損害(drug induced liver injury,DILI)是臨床常見的一種藥物不良反應(yīng),嚴(yán)重程度從輕度血清轉(zhuǎn)氨酶升高到可發(fā)展為急性肝衰竭.本文綜述了DILI的病因、發(fā)病機制、診斷及治療,以期能對改善DILI的預(yù)防治療提供參考.

0 引言

藥物性肝損害(drug induced liver injury,DILI)是一種在藥物使用過程中因藥品本身及其代謝產(chǎn)物引起的肝臟毒性反應(yīng)或機體對藥物及其代謝產(chǎn)物發(fā)生過敏反應(yīng)所導(dǎo)致的肝臟毒性損害.一般將其分為可預(yù)測的固有型肝損害和不可預(yù)測的特異型肝損害兩類.作為發(fā)生在肝臟的一種較為常見且嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng),DILI一直是醫(yī)生在治療疾病時需要面對的最具有挑戰(zhàn)性的難題.相關(guān)流行病學(xué)研究顯示[1],DILI的年發(fā)病率為每十萬居民中有14-19例,占整個藥物不良反應(yīng)的10%-15%,死亡病例數(shù)量已位居世界第五位.在美國和歐洲一些國家,DILI已經(jīng)超過病毒性肝炎成為ALF發(fā)生的主要原因[2].DILI的發(fā)生受諸多因素影響,發(fā)病機制復(fù)雜,發(fā)病率難以確定,缺乏特異性的診斷治療方法.本文綜合相關(guān)文獻,重點介紹DILI的發(fā)病因素、診斷標(biāo)準(zhǔn)和治療方法,以加強對DILI的認(rèn)識,提高診療水平.

1 DILI發(fā)病機制

DILI不是單一的疾病,主要表現(xiàn)為多種作用機制的前后或共同作用.目前對于DILI的作用機制主要分為兩類：固有型肝損害和特異型肝損害.

1.1 固有型肝損害 又稱中毒性肝損害,一般是由藥物本身及其毒性代謝產(chǎn)物引起.在肝臟CYP450作用下,藥物轉(zhuǎn)化生成親電子基、氧自由基等活性代謝產(chǎn)物,造成肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化,破壞細(xì)胞骨架,導(dǎo)致線粒體損傷,損害程度與藥物劑量大小緊密相關(guān).常見的代表藥物有對乙酰氨基酚[3],這類病例中大約有一半是由于過量服用造成.因此由其引起的死亡在很大程度上是可以預(yù)防的.

1.2 特異型肝損害 一般有免疫系統(tǒng)和炎癥介質(zhì)的參與,可將其分為兩種亞型即代謝特異質(zhì)型和免疫特異質(zhì)型.表現(xiàn)為藥物代謝產(chǎn)物改變與肝細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)合形成新抗原,啟動機體細(xì)胞免疫或體液免疫而導(dǎo)致肝損傷.存在個體差異,大多數(shù)病例是輕微的自限性損傷,主要表現(xiàn)為停藥可恢復(fù),不可預(yù)測,動物實驗?zāi)Ｐ蜔o法復(fù)制,與用藥劑量無關(guān).特定的人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)基因型與特定的藥物之間存在許多關(guān)聯(lián),例如阿莫西林-克拉維酸是誘導(dǎo)特異型藥物肝損傷的常見原因,研究表明與HLA Ⅰ類和Ⅱ類等位基因相關(guān),為免疫介導(dǎo)的肝損傷[4].

2 DILI發(fā)病因素

多因素機制是DILI發(fā)病的基礎(chǔ).近年來關(guān)于DILI發(fā)病因素的研究有很多,主要分為藥物、宿主和環(huán)境相關(guān)的三個方面.

2.1 藥物因素

2.1.1 藥物相互作用：聯(lián)合用藥是發(fā)生DILI的重要原因.親脂性藥物和一些外源性物質(zhì)可以顯著刺激肝藥酶的合成,從而增強肝臟對其他藥物的代謝能力,可能造成DILI的發(fā)生率和致癌率增長.有數(shù)據(jù)證明,親脂性藥物是DILI的強風(fēng)險因素,目前已知的能導(dǎo)致肝損傷的親脂性藥物已經(jīng)超過兩百種(如苯妥英鈉)[5].一些藥物則能通過抑制肝藥酶活性從而延緩其他藥物的代謝,并增強這種藥物的藥理作用.研究顯示[6],丙戊酸通過抑制拉莫三嗪的葡萄糖醛酸化而延長拉莫三嗪的半衰期,肝毒性發(fā)生風(fēng)險增加.

2.1.2 藥物濃度與療程：高濃度藥物的服用易發(fā)生肝損傷,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[7],用量＞50 mg/d藥物的DILI的病例占所有特異性DILI的77%.如對乙酰氨基酚引發(fā)肝損害一般是由于過量服藥超過體內(nèi)谷胱甘肽還原能力,代謝產(chǎn)物積累引發(fā)肝細(xì)胞壞死.療程長的藥物如維生素A長期低劑量服用可導(dǎo)致嚴(yán)重肝損傷[8].

2.2 宿主因素

2.2.1 代謝基因多態(tài)性：部分研究認(rèn)為DILI的發(fā)生風(fēng)險與個體差異密切相關(guān).機體遺傳基因的變異可使得體內(nèi)藥物代謝酶如N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2、肝臟P450酶等酶系呈現(xiàn)多態(tài)性而導(dǎo)致藥物代謝能力的個體差異產(chǎn)生,這種差異能夠直接影響機體對特定藥物的敏感性強弱、藥物的作用機制和不良反應(yīng)的發(fā)生及嚴(yán)重程度.例如[9]體內(nèi)N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2水平較低時,異煙肼的代謝產(chǎn)物乙酰肼可以被CYP450進一步代謝生成毒性產(chǎn)物,若N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2水平正常,則會代謝生成毒性較小的產(chǎn)物,不易發(fā)生DILI.這種個體差異導(dǎo)致的肝損傷在不同地域和種族人群的藥物代謝能力、疾病易感性與致癌率上都有所體現(xiàn).

2.2.2 HLA基因多態(tài)性：HLA基因編碼是人類主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)的基因簇,具有抗原識別和免疫功能,在改變特異型DILI發(fā)病風(fēng)險中起到了重要作用.調(diào)查研究顯示HLA-Ⅰ、Ⅱ類基因能夠誘導(dǎo)某些DILI[10].機體內(nèi)特定的HLA基因型與特定的藥物存在許多關(guān)聯(lián),例如[11]抗菌藥阿莫西林克拉維酸鉀與HLA基因編碼是導(dǎo)致特異型DILI的常見原因,攜帶HLA-DRB1*1501的患者服用阿莫西林克拉維酸鉀有較高幾率發(fā)生肝損害;HLA-B*5701已被證實常見于氟氯西林誘導(dǎo)的DILI患者體內(nèi).

2.2.3 年齡與性別：年齡已經(jīng)被證實是DILI發(fā)生的危險因素[12],但一般僅適用于特定藥物.如兒童DILI發(fā)生率較低,但合用丙戊酸與阿司匹林時肝毒性風(fēng)險增加.50歲以上人群合用異煙肼與阿莫西林增加DILI發(fā)病率.DILI是否進展為嚴(yán)重肝損傷具有一定性別差異,研究顯示女性患DILI的風(fēng)險并未顯著高于男性,但更容易發(fā)展為急性肝衰竭.在對771名西班牙DILI患者的研究中發(fā)現(xiàn),64%發(fā)展為ALF的患者為女性[13].

2.2.4 原發(fā)疾?。禾悄虿『蜐撛诘母闻K慢性疾病均是發(fā)生嚴(yán)重DILI的獨立危險因素,這可能與藥物代謝動力學(xué)受損,肝臟CYP45等代謝酶和藥物清除率改變,藥物代謝異常有關(guān)[14].

2.3 環(huán)境因素

2.3.1 飲食類型：長期高脂與高碳水化合物的飲食會改變CYP450表達,引起脂肪氧化增多,自由基大量生成,導(dǎo)致組織損傷而影響細(xì)胞代謝,產(chǎn)生肝臟毒性發(fā)生肝損傷.

2.3.2 營養(yǎng)狀況與飲酒：機體缺乏營養(yǎng)和飲酒都會導(dǎo)致體內(nèi)如谷胱甘肽等具有保護作用分子減少,增加對DILI的易感性[15].研究顯示營養(yǎng)狀況差的患者服用抗結(jié)核藥后肝損害程度更加嚴(yán)重.營養(yǎng)過剩引起的肥胖是DILI的重要危險因素,肥胖容易患上各種肝臟疾病影響藥物代謝.

3 DILI診斷

由于缺乏特異的生物標(biāo)志物,DILI的發(fā)生與相關(guān)致病藥物聯(lián)系隱秘不易檢出.DILI的診斷主要是通過詳細(xì)的臨床病史、生化檢測和肝活檢等幾方面分析,一方面是要排除肝病產(chǎn)生的其他原因,另一方面是要將藥物和肝病聯(lián)系起來.目前國際上達成共識根據(jù)生化指標(biāo)變化將肝損害分為膽汁淤積型、肝細(xì)胞型和混合型,通過血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)與堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的比值R=(ALT/ULN)/(ALP/ULN))得出ALT≥3×ULN且R≥5為肝細(xì)胞損傷型,ALP≥2×ULN且R≤2為膽汁淤積型肝損傷,ALT≥3×ULN、ALP≥2×ULN且2＜R＜5為混合型肝損傷.這在制定DILI治療方案時具有參考意義[16].

3.1 國外診斷標(biāo)準(zhǔn) 1978年日本“藥物與肝臟”研究會的以變態(tài)反應(yīng)作為發(fā)生機制的診斷標(biāo)準(zhǔn)與1981年提出的Naranjo不良反應(yīng)量表法(adverse drug reactions probability scale,NADRPS)作為最早提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)[17].前者僅適用于過敏反應(yīng)導(dǎo)致的DILI,后者雖簡單可行,但僅用于診斷非特異型肝損傷,靈敏性低,兩者均具有一定的局限性.1988年提出的“急性DILI歐洲共識會議診斷標(biāo)準(zhǔn)”,對患者病情、癥狀,所用藥物等因素進行臨床量化分析,此診斷標(biāo)準(zhǔn)實際操作較為繁瑣[18].1993年國際共識會議上通過對此標(biāo)準(zhǔn)改良,提出了Roussel Uclaf因果關(guān)系評估法(the roussel uclaf causality assessment method,RUCAM),此標(biāo)準(zhǔn)是第一個專為肝臟損傷設(shè)計的CAM,也是目前全球最常用的DILI評估工具.1997年,Maria通過在RUCAM標(biāo)準(zhǔn)進行了簡化,制定的Maria and Victorino(M and V)標(biāo)準(zhǔn)具有更強的操作性,但其對潛伏期長、慢性肝損傷和膽汁淤積性肝損傷的診斷結(jié)果符合率較低.劉建鋒等[19]在對256例DILI患者的回顧性分析研究中發(fā)現(xiàn),相比于RUCAM評分標(biāo)準(zhǔn)診斷符合率達到97.3%,Maria診斷標(biāo)準(zhǔn)符合率只有43.7%.2004年DDW日本會議通過對RUCAM評分系統(tǒng)進行改進,包括服藥后發(fā)病時間、聯(lián)合用藥和肝外疾病等,增加了藥物淋巴細(xì)胞刺激實驗(drug lymphocyte stimulation test,DLST),制定了DDW-J(Digestive Disease Week-Japan)標(biāo)準(zhǔn).Hanatani等[20]研究顯示,相比于RUCAM標(biāo)準(zhǔn)與Maria標(biāo)準(zhǔn),DDW-J標(biāo)準(zhǔn)具有更高的準(zhǔn)確性.通過DDW-J標(biāo)準(zhǔn)將DILI病例中可能存在的其他病因與肝損傷病例進行比較,結(jié)果表明,此標(biāo)準(zhǔn)能有效地排除病毒性肝炎等替代病因.但由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)化,可重復(fù)性不足,可能導(dǎo)致一些病例DILI發(fā)生風(fēng)險被低估.此外,有關(guān)于DDW-J診斷標(biāo)準(zhǔn)的研究主要發(fā)表在日語期刊上,這使得日本以外的研究人員難以評估和研究使用DDW-J量表.

3.2 我國常用診斷標(biāo)準(zhǔn) 2015-10中華醫(yī)學(xué)會發(fā)布的《藥物性肝損傷診治指南》中推薦采用RUCAM作為我國DILI的診斷標(biāo)準(zhǔn)[21].此標(biāo)準(zhǔn)通過綜合評估藥物與肝損傷的因果關(guān)系.包含的內(nèi)容有用藥史、病程時間長短、合并應(yīng)用的其他藥物、藥物再激發(fā)反應(yīng)等.最后根據(jù)評分結(jié)果將藥物與肝損傷的因果關(guān)系分為5級：極可能(highly probable)：＞8分;很可能(probable)：6-8分;可能(possible)：3-5分;不太可能(unlikely)：1-2分;可排除(excluded)：≤0分,以此判斷患有DILI的幾率.2016年,RUCAM根據(jù)飲酒狀況和戊型肝炎病毒的生物標(biāo)志物的具體情況進行了簡化和更新,以進一步降低觀察者之間的差異性.實踐證明,RUCAM是目前全球范圍內(nèi)設(shè)計最合理、要素最全面、操作最方便、診斷準(zhǔn)確率相對較高的DILI診斷工具,這歸功于其客觀和標(biāo)準(zhǔn)化的鑒定方法[22].但RUCAM無法彌補臨床診斷中質(zhì)量低或缺失的數(shù)據(jù),這需要在臨床中不斷加強數(shù)據(jù)的完整性.

3.3 輔助診斷方法

3.3.1 病理學(xué)檢查：DILI病理學(xué)表現(xiàn)多樣,以壞死、炎癥、淤膽和變性最為常見.肝細(xì)胞脂肪變性、肉芽腫、肝炎引起的膽汁淤積、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞增多以及靜脈周圍肝細(xì)胞壞死均提示可能發(fā)生DILI[23].但由于DILI的臨床特征可以模擬幾乎所有的其他肝臟疾病,導(dǎo)致DILI的病理學(xué)診斷缺乏特異性組織學(xué)特征,例如小葉中心性炎癥壞死是DILI的發(fā)病特征,但同時也是嚴(yán)重自身免疫性肝炎的組織學(xué)特征[24].從而限制了病理學(xué)診斷在DILI診斷中的價值.

在病史不詳、停用可疑藥物癥狀無改善或無法排除其他肝損害診斷等原因的情況下,肝組織病理活檢能夠發(fā)現(xiàn)服用特定藥物后的組織學(xué)特征,例如長期服用胺碘酮導(dǎo)致的脂肪性肝炎[25],有助于排除其他原因?qū)е碌母螕p傷,是DILI診斷的重要組成部分.

3.3.2 影像學(xué)檢查：近年相關(guān)報道中,對DILI的診斷中采用影像技術(shù)可有效提升診斷的準(zhǔn)確性、優(yōu)化DILI的治療方案以及評估治療效果.衛(wèi)李等[26]對117例DILI的研究中發(fā)現(xiàn)CT技術(shù)一定程度上可以反映DILI肝細(xì)胞受損程度,主要表現(xiàn)為病灶壞死面積的變化.由于不同患者生理差異性和肝損傷組織病理學(xué)的多樣性,CT影像中對DILI表達缺少特異型,可結(jié)合MRI檢查結(jié)果進一部診斷.有研究顯示[27],超聲影像學(xué)檢查中,輕度DILI表現(xiàn)正常,臟器無器質(zhì)性改變.當(dāng)進展為中重度肝損害后,受損細(xì)胞會發(fā)生充血、壞死、變性一系列改變,這種改變能被捕捉并顯示在超聲聲像圖上.此外,超聲影像技術(shù)中的造影技術(shù)、介入超聲技術(shù)等創(chuàng)新技術(shù)可進一步量化肝損傷程度[28],為治療方案的合理選擇,準(zhǔn)確評估預(yù)后提供客觀依據(jù).

4 DILI治療方法

關(guān)于DILI的治療方法,目前推薦的主要有：(1)發(fā)生肝損傷時及時停用可疑藥物;(2)根據(jù)DILI的特異型選擇合適的藥物進行治療;(3)脫敏治療、肝臟輔助裝置等非藥物療法.

4.1 停藥 DILI臨床表現(xiàn)多樣,從輕度的ALT水平升高到嚴(yán)重的肝衰竭.FDA建議在沒有任何臨床癥狀的情況下,ALT超過正常上限(upper limits of normal,ULN)3倍,可在監(jiān)測下繼續(xù)使用.當(dāng)ALT升至ULN的8倍以上,臨床醫(yī)生需結(jié)合藥物對原發(fā)病的重要性和繼續(xù)服藥的風(fēng)險考慮是否停藥.如原發(fā)病的治療無有效地替代療法,則酌情控制用藥劑量.大多數(shù)患者停藥后恢復(fù),少數(shù)發(fā)展為慢性肝損傷,只有極少數(shù)發(fā)展為ALF等嚴(yán)重肝臟疾病.停藥后要避免再次接觸其他潛在的肝毒性藥物和酒精等易加重肝損傷的物質(zhì).

4.2 藥物治療

4.2.1 N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)：20世紀(jì)70年代,科學(xué)家發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞內(nèi)對乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)代謝的活性代謝物N-乙?；鶎Ρ锦珌啺?nacetyl-P-benzoquinoneimine,NAP-QI)能夠被細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽還原,產(chǎn)生解毒作用,但如果藥物過量使用就會導(dǎo)致代謝產(chǎn)物積累并超過谷胱甘肽的還原能力,NAP-QI與肝細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)共價結(jié)合,導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死.N-乙酰半胱氨酸作為2004年被美國FDA批準(zhǔn)用來治療APAP引起的肝損傷唯一解毒劑,能夠促進谷胱甘肽再生,起到解毒作用,需要在攝入APAP后8 h內(nèi)給藥可發(fā)揮最大作用.一項隨機對照試驗顯示預(yù)防性的服用NAC能有效降低使用抗結(jié)核藥的患者肝毒性發(fā)生率[2].在另外一項針對173名非APAP相關(guān)患者的雙盲隨機對照試驗中顯示[29],與安慰劑治療的患者相比,用NAC治療的患者在無移植存活率方面有顯著改善.然而,NAC對非APAP相關(guān)的兒童患者的ALF無效.

4.2.2 熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)：通過對大量病例報告的觀察證明[30],UDCA用于膽汁淤積性DILI患者,降低肝臟細(xì)胞的毒性,促進膽汁酸的排泄和吸收,加速肝損傷的恢復(fù).UDCA還可以縮短阿莫西林-克拉維酸導(dǎo)致的急性肝損傷的持續(xù)時間和幫助抑制膽管消失綜合征的發(fā)展.

4.2.3 水飛薊素：這是一種黃酮木脂素類化合物,主要的活性成分有水飛薊賓(Silybin)、異水飛薊賓(Isosilybin)、水飛薊亭(Silychristin)和水飛薊寧(Silydianin)等四種同分異構(gòu)體.科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)水飛薊素可以預(yù)防抗結(jié)核藥物導(dǎo)致的DILI,具有明顯的保護和穩(wěn)定肝細(xì)胞的作用[31].還能防止化學(xué)毒素、食物毒素等對肝臟造成的損傷,促進肝細(xì)胞的再生和修復(fù),被譽為“天然的保肝藥”.

4.2.4 甘草(Glycyrrhiza glabra)：具有多種活性成分,可作為單一藥物或與還原型谷胱甘肽聯(lián)合用于DILI的治療,在日本和印度常用于治療急性DILI[32].甘草甜素是甘草提取物,是目前臨床常用的保肝藥,具有抗炎、抗氧化、抗肝臟毒物、穩(wěn)定細(xì)胞膜等多種功效.

4.2.5 多烯磷脂酰膽堿：幫助受損的肝細(xì)胞功能和肝藥酶活性的恢復(fù),調(diào)節(jié)肝臟內(nèi)部的能量平衡,促進肝組織再生[33].

4.2.6 左旋肉堿 研究發(fā)現(xiàn)丙戊酸(valproic acid,VPA)過量會導(dǎo)致體內(nèi)肉堿消耗過大,長鏈脂肪酸向線粒體基質(zhì)的轉(zhuǎn)運受損,ATP減少肉堿轉(zhuǎn)運效率下降,導(dǎo)致毒性產(chǎn)物的過量產(chǎn)生和積累.補充左旋肉堿已被證明可有效治療兒童和成人的VPA過量導(dǎo)致的肝損傷[34].

4.3 其他療法

4.3.1 脫敏治療：對于某些與超敏反應(yīng)相關(guān)的且沒有替代療法卻威脅生命的疾病,如卡馬西平誘導(dǎo)的肝損傷,可選擇內(nèi)固醇類激素進行脫敏療法短期治療[35],可以繼續(xù)使用原本藥物用于疾病的治療,待緩解病情再酌情減量.此外,類固醇也可用于治療藥物誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎.

4.3.2 排出體內(nèi)藥物：急性對乙酰氨基酚過量和重金屬中毒常應(yīng)用胃灌流、導(dǎo)泄和活性炭吸附,促進體內(nèi)藥物的排出.水楊酸類等水溶性強,分子量小的藥物可選擇血液透析,抗生素,鎮(zhèn)靜催眠藥等分子量較大的藥物常用血液灌流來降低血漿藥物濃度.

4.3.3 支持療法：建議體內(nèi)脂溶性維生素缺乏或熱量攝入不足的住院重癥膽汁淤積患者,考慮口服腸內(nèi)營養(yǎng)劑,穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境,維護體內(nèi)器官的基本功能.

4.3.4 血漿置換：常用與治療急性肝衰竭.通過排出肝臟中累積的毒素和添加凝血因子以治療肝損傷引起的凝血障礙.多項研究表明血漿置換在降低含氮廢物(氨和尿素)水平、和改善肌苷酸方面具有功效[36].因此,血漿置換對DILI繼發(fā)急性肝功能衰竭患者的預(yù)后和生存價值高于單純癥狀治療.

4.3.5 人工肝和肝移植：人工肝治療用于肝功能衰竭、重型肝炎、高膽紅素血癥、肝腎綜合征等.對于合并肝性腦病或嚴(yán)重凝血障礙的肝功能衰竭,以及失常性肝硬化,可考慮肝移植[37].

5 結(jié)論

DILI作為急性肝衰竭發(fā)病的原因之一,也是臨床前研究期間停止藥物開發(fā)以及藥品撤出市場最常見的原因.DILI的發(fā)病機制復(fù)雜,發(fā)病因素多樣,日常研究中DILI的各種組織學(xué)模式以及特定組織學(xué)特征的缺乏,導(dǎo)致缺乏DILI特異性診斷已經(jīng)成為最具有挑戰(zhàn)性的臨床難題,目前常使用因果關(guān)系評估提高診斷準(zhǔn)確性.DILI的治療主要是停止使用可疑致病藥物和支持措施.臨床上用藥時要更加嚴(yán)格按照病情的需要合理選擇藥物的種類、劑量和療程,減少多藥并用.基因檢測、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和生物標(biāo)志物都能增加對DILI的預(yù)防和診斷準(zhǔn)確性和加深對DILI的理解,這需要進一步的隨機對照試驗來確定.