新疆產(chǎn)半夏的質(zhì)量評價△

邢冰，董誠明，李詢，李曼

河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450046

半夏來源于天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的干燥塊莖[1]，我國大部分地區(qū)均有分布，主產(chǎn)于四川、湖北、河南等省。半夏性溫，味辛，有毒，歸脾、胃、肺經(jīng)，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)的功效。長期以來，由于生態(tài)環(huán)境的破壞，加之根腐病害嚴(yán)重，種植成本高，半夏野生資源日趨枯竭[2-3]。目前，半夏主產(chǎn)區(qū)的產(chǎn)量已經(jīng)難以滿足市場的需求，而地域廣闊的新疆地區(qū)所產(chǎn)的半夏質(zhì)量評價的優(yōu)劣尚不清楚。單一指標(biāo)不能體現(xiàn)半夏總體質(zhì)量，故需對其進(jìn)行綜合品質(zhì)評價。甘肅省西和縣素稱為“中國半夏之鄉(xiāng)”，栽培面積大，全縣1/3的耕地是半夏適宜種植區(qū)。本研究將新疆引種半夏與甘肅半夏的質(zhì)量進(jìn)行比較，為新疆地區(qū)半夏的種植提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗材料

實驗材料為栽培半夏鮮品及加工品，在新疆、甘肅產(chǎn)地收集，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠明教授鑒定為天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.) Breit.的干燥塊莖。

1.2 儀器及試劑

Waters e2695 UV-Waters2489高效液相色譜儀(美國Waters公司)；ba410-upr熒光顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司)；FA2204N 型電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；鳥苷對照品(四川維克奇生物科技有限公司)；乙腈、甲醇為色譜純(英國 Thermo Fisher)；乙酸為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法

2.1 樣品分級

參照《76 種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》[4]，對新疆半夏加工品以大小、單品質(zhì)量、密度、色澤為指標(biāo)進(jìn)行分級。

2.2 半夏加工品水分、總灰分測定

取半夏加工品，分級處理，參照《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)中水分測定法(通則0832第二法)測定半夏藥材的水分，采用灰分測定法(通則2302)測定總灰分。

2.3 顯微鑒別及針晶含量測定

2.4 浸出物、有機酸含量測定

取半夏鮮品，去皮，低溫干燥，粉碎，另取分級后加工藥材，粉碎。水溶性浸出物參照《中國藥典》水溶性浸出物測定法(通則2201)項下的冷浸法測定，總有機酸含量參照電位滴定法(附錄Ⅷ A)測定。為使提取充分完全，有研究表明，熱浸法提取率高于冷浸法[6]。本實驗再對熱浸法使用的溶劑進(jìn)行了方法學(xué)考察，最終采用濃度為50%的乙醇，參照水溶性浸出物測定法(通則2201)中的熱浸出法進(jìn)行醇溶性成分含量的測定。

2.5 鳥苷含量的HPLC測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱XAqua C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇∶0.1%乙酸(3∶97)為流動相；檢測波長為254 nm；流速為1 mL min-1；柱溫為室溫；進(jìn)樣量10 μL。

2.5.2 對照品的制備 精密稱取鳥苷對照品約0.80 mg，加水溶解，定容于25 mL容量瓶中，配制成每1 mL含鳥苷32 μg的對照品溶液。

2.5.3 供試品的制備 取半夏藥材粉末(過四號篩)，精密稱定1.0 g，置150 mL具塞錐形瓶中，加50 mL蒸餾水浸30 min，超聲(240 W，45 kHz)提取40 min，放冷，蒸干，用10 mL水充分溶解，濾過，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.5.4 線性關(guān)系的考察 按照2.5.1項下色譜條件，將鳥苷對照品溶液稀釋為3.2、6.4、9.6、12.8、16、19.2、22.4、25.6 μg mL-1，注入高效液相色譜儀，以不同濃度鳥苷為橫坐標(biāo)，以各成分的峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，在其范圍內(nèi)得回歸方程：Y=26 963X-49 525，r=0.999 7，表明鳥苷在質(zhì)量濃度3.2～25.6 μg mL-1與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5.5 精密度試驗 取供試品溶液1份，按2.5.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，按照其色譜圖峰面積計算RSD值，結(jié)果得6次進(jìn)樣的鳥苷峰面積的RSD值為1.92%，顯示儀器精密度良好。

2.5.6 重復(fù)性試驗 精密稱定同一份樣品，制備供試品溶液6份，每份1.0 g，每份供試品溶液按2.5.1項下色譜條件進(jìn)樣，計算RSD值為1.91%，說明本方法具有良好的重復(fù)性。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在供試品溶液制備后 0、2、4、6、8、10、12 h 按2.5.1項下色譜條件進(jìn)樣檢測。RSD為1.48%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.8 加樣回收率 精密稱取鳥苷對照品0.8 mg，置于25 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。精密稱取新疆半夏粉末1.0 g，平行9份，加入上述對照品溶液0.8、1.0、1.2 mL各3份，按供試品溶液制備方法操作及上述色譜條件進(jìn)行測定。計算平均回收率為99.76%，RSD為1.50%。

2.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)經(jīng) Microsoft excel 2010整理后，采用DPS 9.0系統(tǒng)進(jìn)行新復(fù)極差法分析。運用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行相關(guān)性分析和主成分分析。

3 結(jié)果

3.1 樣品分級

對新疆半夏加工品以大小、單品質(zhì)量為指標(biāo)進(jìn)行分級，外觀均呈圓球形、半圓球形，上端圓平，中心凹陷(莖痕)，周圍有棕色點狀根痕，下面鈍圓，較平滑。質(zhì)堅實。斷面潔白或白色。粉質(zhì)細(xì)膩。氣微，味辛、麻舌而刺喉。無包殼、雜質(zhì)、蟲蛀、霉變。分級結(jié)果見表1。

表1 半夏樣品分級結(jié)果

3.2 半夏加工品水分、總灰分含量測定

半夏加工品的水分、總灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均不超過的14.0%、4.0%，符合《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。樣品含量測定結(jié)果見表2。

表2 半夏加工品水分、總灰分測定結(jié)果 %

注：同一列中不同小寫字母表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3.3 顯微鑒別及針晶含量測定

粉末為類白色，淀粉粒極多，單粒類球形或圓多角形，直徑2～20 μm，多數(shù)10～15 μm，臍點短縫狀、人字狀或星狀；復(fù)粒2～3粒多見，觀察到單粒與復(fù)粒之比約為4∶1，草酸鈣針晶較多，散在或成束存在于橢圓形粘液細(xì)胞中，長約82～104 μm，另觀察到螺紋導(dǎo)管，長約14～22 μm(見圖1)，與《中國藥典》所述“淀粉粒甚多，直徑2～20 μm，臍點裂縫狀、人字狀或星狀；針晶長20～144 μm，螺紋導(dǎo)管直徑10～24 μm”一致。

新疆半夏鮮品及加工品的針晶含量差異顯著，且新疆半夏鮮品的針晶含量顯著低于甘肅產(chǎn)地。與甘肅半夏加工品相比，新疆二級、三級加工品的針晶含量較低。實驗結(jié)果見表3。

表3 半夏針晶含量測定結(jié)果

注：同一列中不同小寫字母表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3.4 半夏鮮品及加工品的浸出物、有機酸、鳥苷含量測定

實驗測得半夏鮮品及加工品的浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)不少于9.0%、有機酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)不少于0.25%，均符合《中國藥典》要求，且加工后新疆半夏藥材的浸出物、有機酸含量均明顯下降，鳥苷含量影響不顯著(表4)。

注：圖片放大400倍；A.淀粉粒；B.螺紋導(dǎo)管；C、D.草酸鈣針晶。圖1 新疆半夏藥材粉末顯微圖

與甘肅半夏鮮品相比，新疆半夏的水溶性浸出物及有機酸含量較高。與甘肅半夏加工品相比，鳥苷含量差異不明顯，但新疆半夏一級加工品的水溶性浸出物、醇溶性浸出物、有機酸含量均較高，二級加工品的醇溶性浸出物及有機酸含量較高，三級加工品的有機酸含量較高(表4)。

表4 半夏浸出物、有機酸、鳥苷含量測定結(jié)果 %

注：同一列中不同小寫字母表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3.5 相關(guān)性分析

對影響半夏品質(zhì)的5個指標(biāo)(針晶含量、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、有機酸含量、鳥苷含量)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表5。鳥苷含量與水溶性浸出物、醇溶性浸出物、針晶含量之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表5 相關(guān)性分析結(jié)果

注：*P<0.05。

3.6 主成分分析

主成分分析是將多指標(biāo)簡化為少量綜合指標(biāo)的一種統(tǒng)計分析方法，用少數(shù)變量盡可能多地反映原來變量的信息。選取和半夏品質(zhì)相關(guān)的5個活性成分：針晶含量、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、有機酸含量、鳥苷含量，應(yīng)用主成分分析法對半夏新品及加工品的綜合品質(zhì)進(jìn)行排序，從而進(jìn)行新疆半夏質(zhì)量的初步評價。5項綜合品質(zhì)指標(biāo)有不同的量綱和數(shù)量級，為了避免量綱和數(shù)量級的影響，對指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，結(jié)果見表6。對半夏樣品中5項活性成分含量指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化值進(jìn)行主成分分析，用SPSS統(tǒng)計分析時提取2個主成分，結(jié)果見表7，特征值大于1的是前2個主成分PC1、PC2。對于主成分?jǐn)?shù)量的確定要求滿足降維同時又盡可能反應(yīng)出更多變量地信息，常用累積方差貢獻(xiàn)率(≥85%)來確定主成分的數(shù)量，本研究中前2個主成份累積貢獻(xiàn)率為88.75%，適合此方法，可用來評價半夏的質(zhì)量。結(jié)果表明PC1主要反映的是醇溶性浸出物、鳥苷、水溶性浸出物、針晶的含有量信息，PC2主要反映的是有機酸的含有量信息。因此，5個指標(biāo)(針晶含量、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、有機酸含量、鳥苷含量)均可作為評價半夏質(zhì)量的主要依據(jù)，根據(jù)不同主成分特征值的方差貢獻(xiàn)率得出綜合評價指標(biāo)F[7]。對F進(jìn)行排序，其結(jié)果也是對半夏質(zhì)量綜合評價的結(jié)果，見表8。綜合主成分F得分越高，樣品質(zhì)量越好，可見新疆半夏鮮品質(zhì)量優(yōu)于甘肅半夏鮮品，加工后新疆半夏質(zhì)量下降。

表6 半夏各單項指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化值 %

表7 各因子載荷矩陣、特征值、貢獻(xiàn)率及累積貢獻(xiàn)率

表8 主成分因子得分排序

注：F1為第一主成分得分；F2為第二主成分得分；F為主成分得分總分。

4 討論

本研究建立評價半夏質(zhì)量的方法，測得新疆半夏加工品的水分、灰分含量值均符合《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，鮮品及加工品的水溶性浸出物、有機酸含量也符合《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)量合格。核苷類成分是半夏藥材及飲片中很重要的有效成分，其中鳥苷含量較高，常作為評價半夏質(zhì)量優(yōu)劣的重要依據(jù)[8-10]。通過相關(guān)性分析，針晶含量與鳥苷含量之間、醇溶性浸出物與鳥苷含量之間均具有顯著(P<0.05)相關(guān)性，且有研究發(fā)現(xiàn)，半夏水溶性成分有鳥苷、腺苷等，醇溶性成分中有生物堿等活性物質(zhì)[11]；半夏草酸鈣針晶的含量與其刺激性有關(guān)[5]。再結(jié)合主成分分析，結(jié)果顯示針晶含量、醇溶性浸出物亦可作為評價半夏質(zhì)量的指標(biāo)。

與主產(chǎn)區(qū)甘肅相比，新疆半夏鮮品的醇溶性浸出物及鳥苷含量無明顯差異，且水溶性浸出物與有機酸含量均較高，表明本評價體系下的新疆半夏鮮品質(zhì)量較佳。比較加工品的質(zhì)量，得出新疆一級加工品的鳥苷含量與甘肅加工品間無明顯差異，且針晶、醇溶性浸出物、有機酸含量均較高；新疆二級加工品的針晶、醇溶性浸出物及鳥苷含量與甘肅加工品間無明顯差異，且有機酸含量較高。同時，經(jīng)主成分分析得出半夏質(zhì)量的綜合排序，新疆鮮品優(yōu)于甘肅鮮品。

對分級后新疆半夏加工品的活性成分進(jìn)行測定，其中，鳥苷含量無明顯差異，但樣品間針晶、浸出物及有機酸的含量差異明顯，有研究表明，半夏中醇溶性及水溶性浸出物等均與半夏的藥理作用關(guān)系密切[12]，總游離有機酸具有較強的止咳、祛痰、抗炎作用，體外有抑制腫瘤生長的作用[13]。實驗測得一級半夏加工品的針晶、水溶性浸出物和醇溶性浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.889 1%、9.785 7%、10.603 2%，二級樣品有機酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.407 4%，均明顯較其他等級樣品高，而三級樣品的針晶、浸出物及有機酸含量較低，鳥苷含量較其他等級的差異并不明顯，說明半夏樣品塊莖大小及質(zhì)地等在一定程度上影響著化學(xué)成分的含量，且經(jīng)主成分分析進(jìn)一步得出新疆半夏加工品的質(zhì)量不一。因此，在以后的實驗分析研究中，應(yīng)注意樣品分級。

實驗比較了新疆半夏鮮品及加工品的成分含量差異，發(fā)現(xiàn)加工后半夏藥材的浸出物、有機酸含量均顯著降低，鳥苷含量損失較少，測得加工后3個等級藥材的水溶性浸出物、醇溶性浸出物、有機酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值分別為9.574 3%、10.308 8%、0.382 7%，相比鮮品下降9.11%、7.73%、7.41%，因此，應(yīng)進(jìn)一步研究合適的加工工藝，注意溫度的控制，在產(chǎn)地加工工藝中減少主要成分的流失。

通過對所收集半夏樣品的觀察及查閱相關(guān)文獻(xiàn)，比較新疆及其他不同產(chǎn)地栽培半夏的外觀性狀，發(fā)現(xiàn)新疆栽培半夏塊莖類球形，且直徑普遍較大，其形狀大部分發(fā)生明顯變化，子塊莖比較多。因此，亟需一種評價栽培半夏內(nèi)在品質(zhì)差異的方法，以控制半夏的質(zhì)量，推廣規(guī)范化種植技術(shù)，保證臨床用藥的安全有效。