遠(yuǎn)志抗驚厥活性部位的研究△

何希瑞，趙澤豐，陳旭飛，付有蘭，田雪，李永生，畢學(xué)苑*

1.遵義醫(yī)科大學(xué) 珠海校區(qū)生物工程系，廣東 珠海 519041；2.西北大學(xué) 西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710069；3.西安交通大學(xué) 附屬紅會(huì)醫(yī)院，陜西 西安 710054

遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志PolygalatenuifoliaWilld.或卵葉遠(yuǎn)志PolygalasibiricaL.的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。性辛、味苦，歸心、腎、肺經(jīng)，有益智安神、祛痰開(kāi)竅以及消散癰腫之效，主治由于痰阻心竅而致神志恍惚癲癇發(fā)狂等癥。近年來(lái)研究表明，遠(yuǎn)志的主要活性成分包括寡糖酯類(lèi)、皂苷類(lèi)及有機(jī)酸類(lèi)化合物等[1]，使得本品具有改善記憶[2]、保護(hù)神經(jīng)[3]、抗癡呆[4]以及抗抑郁[5]等功效。此外，遠(yuǎn)志還具有抗驚厥的活性[6-7]，但對(duì)其抗驚厥作用的活性部位鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)制備遠(yuǎn)志的70%乙醇提取物，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯與甲醇萃取，得到4種萃取物，并建立小鼠驚厥模型評(píng)價(jià)各萃取物的抗驚厥活性，篩選出遠(yuǎn)志抗驚厥的活性部位，明確其抗驚厥的物質(zhì)基礎(chǔ)，以期為遠(yuǎn)志在臨床抗驚厥中的應(yīng)用及藥物開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

XS105電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；YSD-4G電刺激儀(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)；XZC-4B旋轉(zhuǎn)棒疲勞儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站)；R206D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；98-1-N電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

遠(yuǎn)志藥材購(gòu)自西安同仁堂，由西安交通大學(xué)附屬紅會(huì)醫(yī)院副主任中藥師魏桂芳鑒定。戊四唑(阿法埃莎化學(xué)有限公司，批號(hào)：10180463)；3-巰基丙酸(北京百靈威科技有限公司，批號(hào)：LH40O138)；卡馬西平(北京百靈威科技有限公司，批號(hào)：LLA0P07)；聚山梨酯-80(天津市登峰化學(xué)試劑廠)；石油醚(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；乙酸乙酯(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；二氯甲烷(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；甲醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；95%乙醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；0.9%氯化鈉注射液(西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性昆明小鼠，體質(zhì)量(24±2.0) g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(陜)2007-001。飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度45%～65%，自由飲水和攝食。

2 方法

2.1 供試藥品制備

稱取遠(yuǎn)志藥材36.0 g，用70%乙醇溶液于索氏提取器中回流提取3次，合并提取液，回收溶劑得到粗提物13.5 g，分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯與甲醇萃取3次[8]，合并萃取液后減壓濃縮，分別得到石油醚萃取物(PE)1.3 g；二氯甲烷萃取物(DCM)1.8 g；乙酸乙酯萃取物(EA)2.2 g；甲醇萃取物(ME)2.4 g。臨用前配制成含5%吐溫-80的萃取物水溶液。

2.2 Ⅰ期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 最大電休克(Maximal Electroshock，MES)致驚厥模型 使用20 V、60 Hz、0.25 s的交流電，于小鼠雙耳尖部涂抹0.9%氯化鈉溶液，連接電極后給予電刺激，小鼠后肢強(qiáng)直時(shí)認(rèn)定為驚厥[9]。正式實(shí)驗(yàn)前一天進(jìn)行預(yù)篩，出現(xiàn)驚厥的小鼠用于實(shí)驗(yàn)。取篩選過(guò)的小鼠36只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，每組6只[10]。分別為0.9%氯化鈉溶液(NS)組(5%聚山梨酯-80)、陽(yáng)性藥物對(duì)照組(卡馬西平53 mg kg-1)、PE組(300 mg kg-1)、DCM組(300 mg kg-1)、EA組(300 mg kg-1)及ME組(300 mg kg-1)。分別于腹腔注射藥物0.5、1、2、3、4 h后，記錄小鼠的驚厥數(shù)，初步評(píng)價(jià)各萃取物的抗驚厥活性。

2.2.2 戊四唑(Pentylenetetrazole，PTZ)致驚厥模型 分組及給藥劑量同2.2.1項(xiàng)下方法，各組小鼠給藥后0.5 h皮下注射PTZ 85 mg kg-1。按照Racine標(biāo)準(zhǔn)[11]，造模后小鼠出現(xiàn)頸部肌肉及前肢痙攣視為陣攣性發(fā)作，出現(xiàn)后肢僵直(持續(xù)5 s或以上)，失去平衡并伴有四肢抽動(dòng)視為強(qiáng)直性發(fā)作。小鼠獨(dú)自置于籠中觀察30 min，記錄陣攣性發(fā)作數(shù)，強(qiáng)直性發(fā)作數(shù)，潛伏時(shí)間以及病死數(shù)。同時(shí)計(jì)算陣攣性發(fā)作率，強(qiáng)直性發(fā)作率和病死率。

2.3 Ⅰ期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.3.1 最大電休克模型半數(shù)有效量測(cè)定(MES ED50) 根據(jù)Ⅰ期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)在300 mg kg-1下有效的萃取物進(jìn)行Ⅱ期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。取小鼠24只，分為6組，每組4只。分別為NS組(5%聚山梨酯-80)、卡馬西平組和有效萃取物組(50、100、150、200 mg kg-1)，于腹腔注射藥物0.5 h后進(jìn)行電刺激，記錄小鼠的驚厥數(shù)，用Probit法計(jì)算0.5 h的ED50。

2.3.2 戊四唑模型半數(shù)有效量測(cè)定(PTZ ED50) 分組同2.3.1項(xiàng)下方法，有效萃取物(300、400、500、600 mg kg-1)腹腔注射0.5 h后皮下注射PTZ 85 mg kg-1，強(qiáng)直性發(fā)作持續(xù)時(shí)間小于5 s視為藥物具有保護(hù)作用。小鼠獨(dú)自置于籠中觀察30 min，記錄強(qiáng)直性發(fā)作數(shù)，潛伏時(shí)間以及病死數(shù)，計(jì)算注射PTZ后小鼠強(qiáng)直性發(fā)作數(shù)的ED50。

2.3.3 3-巰基丙酸模型半數(shù)有效量測(cè)定(3-Mercaptopropionic acid，3-MP ED50) 分組及給藥劑量同2.3.2項(xiàng)下方法，腹腔注射有效萃取物后0.5 h皮下注射3-MP 60 mg kg-1，強(qiáng)直性發(fā)作持續(xù)時(shí)間小于5 s視為藥物具有保護(hù)作用。小鼠獨(dú)自置于籠中觀察30 min，記錄強(qiáng)直性發(fā)作數(shù)，潛伏時(shí)間以及病死數(shù)，計(jì)算注射3-MP后小鼠強(qiáng)直性發(fā)作數(shù)的ED50。

2.3.4 神經(jīng)毒性測(cè)定(Neurotoxicity，NT) 采用旋轉(zhuǎn)棒法評(píng)價(jià)各萃取物的神經(jīng)毒性[12]。正式實(shí)驗(yàn)前一天對(duì)小鼠進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練和篩選。將小鼠置于直徑2.54厘米，24 r min-1的木棒上，3 min內(nèi)從木棒上掉落小于3次者用于正式實(shí)驗(yàn)。取篩選后的小鼠16只，分為四組，每組4只。分別為有效萃取部位(600、800、1000、1200 mg kg-1)進(jìn)行腹腔注射，3 min內(nèi)從木棒上掉落3次以上者認(rèn)為有神經(jīng)毒性，反之認(rèn)為無(wú)神經(jīng)毒性，記錄毒性反應(yīng)小鼠只數(shù)，計(jì)算給藥后0.5 h對(duì)小鼠的半數(shù)中毒量(TD50)。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

3 結(jié)果

3.1 Ⅰ期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 最大電休克模型結(jié)果 MES實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，在300 mg kg-1劑量下，相比于NS、PE與DCM對(duì)抗電刺激引起的驚厥效果不明顯；EA表現(xiàn)出一定的抗驚厥活性，而ME抗驚厥活性較為顯著(P<0.01)。值得注意的是，與陽(yáng)性藥卡馬西平(Carba) 相比，ME的保護(hù)活性在給藥1 h后明顯下降，3 h后無(wú)保護(hù)作用，而卡馬西平在3 h后仍具有保護(hù)作用。我們推測(cè)可能由于甲醇萃取物所含極性成分在體內(nèi)代謝較快所致。

表1 遠(yuǎn)志不同萃取物的抗驚厥活性篩選Ⅰ期實(shí)驗(yàn)(n=6)

注：n1/n2表示驚厥數(shù)/實(shí)驗(yàn)小鼠總數(shù)；驚厥數(shù)的統(tǒng)計(jì)采用χ2檢驗(yàn)；**表示與模型組相比，P<0.01；—表示給藥相同體積的0.9%氯化鈉溶液(含5%聚山梨酯-80)。

3.1.2 戊四唑模型結(jié)果 PTZ實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，在300 mg kg-1劑量下，相比于NS組，PE與DCM對(duì)抗戊四唑誘導(dǎo)的驚厥差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示遠(yuǎn)志PE與DCM萃取物的抗驚厥作用不明顯，EA(P<0.05)與ME(P<0.01)對(duì)驚厥發(fā)生的潛伏時(shí)間延長(zhǎng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表現(xiàn)出顯著的抗驚厥活性。與NS相比，ME延長(zhǎng)潛伏時(shí)間達(dá)100%以上(P<0.01)(圖1A)，且能降低小鼠的病死率(P<0.05)(圖1B)。綜上所述，我們選取甲醇萃取物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

3.2 Ⅱ期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Ⅱ期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2和表3。遠(yuǎn)志甲醇萃取物在MES、PTZ及3-MP模型下的ED50值分別為143.3、517.1、469.9 mg kg-1，表明遠(yuǎn)志甲醇萃取物在上述模型下均能夠表現(xiàn)出顯著的抗驚厥活性。神經(jīng)毒性結(jié)果顯示，ME對(duì)小鼠的神經(jīng)毒性較低，TD50值為890.54 mg kg-1，根據(jù)ED50與TD50值計(jì)算得到MES模型下的保護(hù)指數(shù)(Protective index，PI)(ED50/TD50)為6.2，陽(yáng)性藥卡馬西平的PI為6.4。

4 討論

《神農(nóng)本草經(jīng)》記載遠(yuǎn)志具有祛痰開(kāi)竅，安神益智，多用于心悸失眠、健忘等癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志還具有顯著的抗驚厥活性，但其抗驚厥活性部位尚未闡明。本研究采用索氏提取器對(duì)遠(yuǎn)志用70%乙醇進(jìn)行提取，得到的提取物依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯與甲醇萃取，得到不同極性的萃取物。采用MES模型及PTZ模型對(duì)遠(yuǎn)志4個(gè)不同極性的萃取物的抗驚厥活性進(jìn)行系統(tǒng)篩選。結(jié)果表明甲醇萃取物的抗驚厥活性最好。進(jìn)而，本研究采用MES，PTZ及3-MP模型對(duì)甲醇萃取物進(jìn)行了進(jìn)一步的抗驚厥活性評(píng)價(jià)，研究發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志甲醇萃取物具有顯著的抗驚厥活性。

注：潛伏時(shí)間采用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)，發(fā)作率和病死率采用χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)。*與模型組相比，P<0.05，**與模型對(duì)照組相比，P<0.01。圖1 遠(yuǎn)志不同萃取物抗PTZ致小鼠驚厥實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 遠(yuǎn)志甲醇萃取物的抗驚厥活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：模型中n1表示驚厥數(shù)組，n2表示實(shí)驗(yàn)小鼠數(shù)，n3表示產(chǎn)生神經(jīng)毒性的小鼠數(shù)。*與模型對(duì)照組相比，P<0.05，**與模型對(duì)照組相比，P<0.01；—表示給藥相同體積的0.9%氯化鈉溶液(含5%聚山梨酯-80)。

表3 定量評(píng)價(jià)遠(yuǎn)志甲醇萃取物的抗驚厥活性

注：ED50是根據(jù)給藥0.5 h后未發(fā)生驚厥的小鼠只數(shù)計(jì)算的；括號(hào)內(nèi)數(shù)字為95%置信區(qū)間。

藥物在MES模型的作用機(jī)制被認(rèn)為與抑制Na+通道的過(guò)度放電[14]有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，遠(yuǎn)志甲醇萃取物對(duì)MES誘導(dǎo)癲癇小鼠具有顯著保護(hù)活性，提示甲醇萃取物可能含有抑制電壓依賴性Na+通道的化學(xué)成分。

值得注意的是，遠(yuǎn)志的毒副作用被廣泛報(bào)道，高劑量遠(yuǎn)志水提物具有明顯的肝毒性及腎毒性[19]。遠(yuǎn)志中的皂苷類(lèi)成分也被報(bào)道具有胃腸毒性[20]。研究發(fā)現(xiàn)小鼠腹腔注射1000、1200 mg kg-1的遠(yuǎn)志甲醇萃取物后，小鼠出現(xiàn)明顯的鎮(zhèn)靜以及共濟(jì)失調(diào)現(xiàn)象，但1200 mg kg-1劑量組小鼠腹腔注射后在24 h內(nèi)全部病死，表現(xiàn)出較大的毒副作用，這在新藥開(kāi)發(fā)中是不容忽視的問(wèn)題。本研究中，雖然甲醇萃取物的抗驚厥保護(hù)指數(shù)(PI=6.2)與陽(yáng)性藥卡馬西平(PI=6.4)接近，但進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行減毒增效的研究是非常必要的。