50味中藥及其復(fù)方與抗生素對(duì)河流弧菌的體外抑菌作用

徐曉津，李秀華，馬一帆，何 俊，李慧耀，祁 欣，張蕉南，王云才，趙玲敏，鄢慶枇

(1.集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建天馬科技股份集團(tuán)有限公司，福州 350308；3.廈門醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 中醫(yī)科，福建 廈門 361021；4.廈門大學(xué) 海洋與地球?qū)W院，福建 廈門 361005)

河流弧菌(Vibrofluvialis)是引起石斑魚產(chǎn)生細(xì)菌性疾病的重要病原菌[1]，其廣泛分布于沿岸海域， 可致魚類、蝦蟹類和貝類產(chǎn)生細(xì)菌性疾病，引起敗血癥、腐皮病和膿皰病等癥狀，死亡嚴(yán)重[1-3]，能引起大黃魚[3]、文蛤、石斑魚等產(chǎn)生疾病[1]，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。河流弧菌還能引起人類感染，產(chǎn)生腹泄等病癥，表現(xiàn)為急性胃腸炎。目前，河流弧菌的防治已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問題之一。隨著抗生素在治療細(xì)菌性疾病中的廣泛應(yīng)用，產(chǎn)生了細(xì)菌耐藥性、導(dǎo)致藥物殘留等問題[4]，而中藥可增強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物免疫力，中藥復(fù)方對(duì)細(xì)菌體外抑制效果較好[5-6]。采用現(xiàn)代化制藥技術(shù)制成的中藥顆粒劑，既保持中藥藥性，使用安全性也較高。目前已有200多種中草藥作為飼料添加劑，學(xué)者們已開展中草藥對(duì)羅非魚、虹鱒、鰻魚等病害防治的研究[7-9]。因此，中藥與抗生素在防治魚病方面各有優(yōu)勢(shì)，研究中西藥聯(lián)合治療魚病具有重要意義。目前尚未見石斑魚等魚類中藥防治配方篩選的研究，也未見中藥抑制河流弧菌、中藥抑制菌篩選及復(fù)方中藥與西藥聯(lián)用治療魚病系統(tǒng)的研究。筆者以石斑魚致病菌河流弧菌為研究對(duì)象，用50種中藥，進(jìn)行中藥體外抑菌試驗(yàn)，篩選出能有效抑制該菌的單方中藥，并在此基礎(chǔ)上篩選出藥效較強(qiáng)的 二聯(lián)與三聯(lián)復(fù)方中藥配方，同時(shí)進(jìn)行抗生素對(duì)河流弧菌的藥敏實(shí)驗(yàn)，篩選出藥效強(qiáng)的抗生素，減少抗生素的用量及藥物殘留問題，旨在為石斑魚河流弧菌病的中西藥聯(lián)合治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌種河流弧菌與實(shí)驗(yàn)菌種標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌菌液由集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存[3]。河流弧菌為石斑魚常見的致病弧菌，分離自患病石斑魚，將保存的金黃色葡萄球菌與河流弧菌分別用LB 液體培養(yǎng)基，28 ℃下恒溫培養(yǎng)8～12 h，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液。PBS 緩沖液調(diào)整菌液OD值0.5 (含菌量約為108mL-1)，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存，備用。

1.2 中藥對(duì)河流弧菌體外抑制實(shí)驗(yàn)

1.2.1 單方中藥的選取與藥液制備選擇水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)上有報(bào)道的50種中藥進(jìn)行石斑魚常見細(xì)菌病河流弧菌體外抑菌實(shí)驗(yàn)，篩選藥效強(qiáng)的中藥。中藥配方顆粒包括：艾葉、魚腥草、大黃、黃柏、黃連、黃芩、連翹、板藍(lán)根、白茅根、苦參、金銀花、梔子、蒲公英、地錦草、千里光、烏梅、檳榔、榧子、使君子、柴胡、青蒿、槐花、木香、貫眾、炒川楝子、大蒜、螺旋藻、刺五加、黃芪、杜仲葉、穿心連、白芍、醋五味子、黨參、苦楝皮、枸杞子、石榴皮、甘草、馬齒莧、白頭翁、五倍子、地榆、訶子、茯苓、鉤藤、虎杖、冬凌草、郁金、木賊草、野菊花均購自江陰天江藥業(yè)有限公司。實(shí)驗(yàn)者將中藥配方顆粒溶解于無菌蒸餾水中，置于玻璃小管中，再置于盛有沸水的燒杯，并隔水加熱0.5 h，讓中藥充分溶解。中藥顆粒劑溶液相當(dāng)于生藥的質(zhì)量濃度為240 mg·mL-1。

1.2.2 復(fù)方二聯(lián)中藥的選取與藥液制備選擇單方中藥體外抑制圈較大的22種中藥(訶子、黃連、烏梅、大黃、黃柏、白芍、醋五味子、檳榔、梔子、青蒿、黃芩、連翹、炒槐花、甘草、板藍(lán)根、黃芪、木香、艾葉、炒川楝子、蒲公英、貫眾、野菊花；下同)中藥配方顆粒，根據(jù)藥物的特性及養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中復(fù)方中藥治療細(xì)菌病的研究結(jié)果[6-8,11-17]，制定復(fù)方二聯(lián)中藥。按1.2.1溶解中藥配方顆粒方法配制成中藥顆粒劑溶液，復(fù)方中藥二聯(lián)按1∶1比例，中藥最終濃度相當(dāng)于生藥的質(zhì)量濃度為240，60 mg·mL-1。

1.2.3 復(fù)方三聯(lián)中藥的選取與藥液制備選擇單方中藥體外抑制圈較大的22種中藥配方顆粒，根據(jù)藥物的特性及養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中復(fù)方中藥治療細(xì)菌病的研究結(jié)果[6-8,11-17]，制定復(fù)方三聯(lián)中藥。按1.2.1溶解中藥配方顆粒方法配制成中藥顆粒劑溶液，復(fù)方中藥三聯(lián)按1∶1∶1比例，中藥最終濃度相當(dāng)于生藥的質(zhì)量濃度為240，60 mg·mL-1。

1.2.4 體外抑菌活性的測(cè)定分別進(jìn)行河流弧菌與金黃色葡萄球菌體外抑制實(shí)驗(yàn)，包括50種單方中藥、復(fù)方二聯(lián)中藥、復(fù)方三聯(lián)中藥。采用牛津杯法，在平板中倒入10 mL滅菌后的LB固體培養(yǎng)基，待凝固后，用鑷子輕輕在每個(gè)培養(yǎng)皿中等距離放入4 個(gè)牛津杯浸入培養(yǎng)基中，取15 mL的LB培養(yǎng)基混勻倒入平板上，待凝固后，用鑷子輕輕取下牛津杯，將河流弧菌和金黃色葡萄球菌稀釋至1.0×108mL-1，用移液槍吸取0.1 mL菌懸液，滴入平板，用涂布器涂勻，用移液槍在1個(gè)孔中加入200 μL的無菌水為對(duì)照，在另3個(gè)孔中用移液槍加入含生藥240 mg·mL-13種不同藥液的200 μL中，置于28 ℃條件下，恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察抑菌圈，并用SupcreG1菌落計(jì)數(shù)/篩選/抑菌圈測(cè)量聯(lián)用儀(杭州迅數(shù)科技有限公司)測(cè)量抑菌圈大小，每個(gè)實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)。計(jì)算平均值，進(jìn)行對(duì)比研究， 根據(jù)抑菌圈直徑大小判定其抑菌能力的強(qiáng)弱。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):抑菌直徑≥ 20 mm為極敏感，表示為“+ + +”；15 mm≤抑菌直徑< 20 mm為高敏，表示為“+ +”；10 mm≤抑菌直徑< 15 mm為中敏，表示為“+”；抑菌直徑< 10 mm低敏或無效，表示為“-”。

1.3 抗生素對(duì)河流弧菌的藥敏試驗(yàn)用牛津杯法，參照WHO推薦的K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法[10]中恩諾沙星(興化市恒威生物技術(shù)有限公司)、鹽酸多西環(huán)素(河南海天生物科技有限公司)、土霉素(河南佰吉特生物科技有限公司)、磺胺嘧啶(山東亞康藥業(yè)股份有限公司)、氟苯尼考(上海瑞博丘)生物工程有限公司、硫酸新霉素(宜興市蘇亞達(dá)生物有限公司)、硫酸慶大霉素(青島富坤獸藥原料有限公司)、磺胺甲噁唑(廣州駿杰生物技術(shù)有限公司)藥敏紙片的藥物濃度，在每孔中加入K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法推薦的抗生素濃度藥物。將河流弧菌與金黃色葡萄球菌分別用0.85%生理鹽水稀釋至1.0×108mL-1，分別取200 μL 菌懸液均勻涂布于LB培養(yǎng)基平板上，每個(gè)平板放4個(gè)牛津杯，每個(gè)孔分別加入抗生素藥液。28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，并用SupcreG1菌落計(jì)數(shù)/篩選/抑菌圈測(cè)量聯(lián)用儀(杭州迅數(shù)科技有限公司)測(cè)量抑菌圈大小， 每個(gè)平板做3 個(gè)重復(fù)。根據(jù)CLSI M100 的最新標(biāo)準(zhǔn)(郭世富，2019)判定結(jié)果。測(cè)量抑菌圈直徑，判定河流弧菌與金黃色葡萄球菌的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同中藥對(duì)河流弧菌的體外抑制效果

2.1.1 不同中藥單方對(duì)河流弧菌的體外抑制效果黃連、訶子對(duì)河流弧菌抑菌作用明顯， 為極敏感。烏梅、黃柏、板藍(lán)根、黃芪、梔子對(duì)河流弧菌抑菌作用較明顯，為高敏。青蒿、醋五味子、大黃抑菌效果為中敏。滅菌作用以黃連最強(qiáng)(表1)。參照實(shí)驗(yàn)菌種標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌對(duì)河流弧菌抑菌直徑數(shù)據(jù)，說明本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度強(qiáng)。由于中藥濃度為240 mg·mL-1，在這較低的中藥濃度下，包括白芍、檳榔、梔子、黃芩、連翹、炒槐花、甘草、木香、艾葉、炒川楝子、蒲公英、貫眾、野菊花、魚腥草、白茅根、苦參、金銀花、地錦草、千里光、榧子、使君子、柴胡、五倍子、槐花、大蒜、螺旋藻、刺五加、杜仲葉、穿心連、黨參、枸杞子、大蒜、白頭翁、茯苓、鉤藤、虎杖、郁金、炒槐花等共40種中藥無抑菌效果。

表1 240 mg·mL-1質(zhì)量濃度下有效10味單方中藥對(duì)河流弧菌的抑菌作用

注：結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):抑菌直徑≥ 20 mm為極敏感“+ + +”；15 mm≤抑菌直徑< 20 mm為高敏“+ +”；10 mm≤抑菌直徑< 15 mm為中敏“+”；抑菌直徑< 10 mm低敏或無效“-”。下同

Note: Sensibility of bacteriostatic activity according to the diameter of inhibition zone: Diameter of inhibition zone larger or equal to 20 mm means extreme sensitivity“+ + +”; diameter of inhibition zone from 15 mm to 20 mm means high sensitivity “+ +”; diameter of inhibition zone from 10 mm to 15 mm means moderate sensitivity “+”; diameter of inhibition zone less than 10 mm means low or no sensitivity“-”. Similarly hereinafter

2.1.2 不同復(fù)方二聯(lián)中藥對(duì)河流弧菌的體外抑制效果在60 mg·mL-1低藥物質(zhì)量濃度時(shí)，黃柏、黃連組成復(fù)方對(duì)河流弧菌抑菌作用為極敏感，大黃、黃連復(fù)方對(duì)菌抑菌作用為高敏(表2)。訶子+白芍、訶子+烏梅、黃連+醋五味子、訶子+醋五味子、黃連+訶子、黃柏+板藍(lán)根、黃芩+黃連、黃柏+白芍、黃柏+醋五味子、黃芩+訶子、黃柏+訶子、板藍(lán)根+訶子、大黃+黃柏、大黃+黃芩、黃柏+黃芩、黃柏+烏梅、板藍(lán)根+烏梅、訶子+烏梅、黃芩+板藍(lán)根、黃芩+烏梅、白芍+醋五味子、烏梅+白芍22種復(fù)方中藥無藥效。在240 mg·mL-1藥物濃度時(shí)，黃柏、黃連等組成9個(gè)復(fù)方中藥對(duì)河流弧菌抑菌作用屬極敏感，抑菌直徑大于20 mm(表3)，烏梅、醋五味子等組成9個(gè)復(fù)方中藥對(duì)河流弧菌抑菌作用屬高敏，槐花、大黃組成復(fù)方中藥、 蒲公英組成復(fù)方中藥、五味子組成復(fù)方中藥五味子、苦參組成復(fù)方中藥抑菌效果為中敏，訶子+烏梅、黃柏+板藍(lán)根、黃柏+醋五味子、黃柏+白芍、黃芩+訶子、黃芩+黃連、板藍(lán)根+訶子、黃柏+訶子、貫眾+白芍、黃芩+板藍(lán)根、黃芪+白芍、黃芪+大黃、槐花+黃柏、大黃+黃柏、大黃+黃芩、黃柏+黃芩、白芍+醋五味子、梔子+大黃、梔子+黃芩、連翹+黃芩、梔子+連翹、連翹+黃柏、槐花+大黃、黃連+木香、艾葉+黃連、蒲公英+野菊花、蒲公英+黃連、蒲公英+五味子、蒲公英+苦參、蒲公英+板藍(lán)根、貫眾+黃芪、貫眾+連翹、野菊花+板藍(lán)根、苦參+五味子組成復(fù)方中藥等34個(gè)復(fù)方中藥無藥效(表3)。參照實(shí)驗(yàn)菌種標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌對(duì)河流弧菌抑菌的直徑數(shù)據(jù)，說明本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度高(表2，3)。相對(duì)于一聯(lián)中藥，二聯(lián)中藥的藥效更強(qiáng)，選擇性能功效相類似的藥物配合應(yīng)用，能增強(qiáng)療效。

表2 60 mg·mL-1質(zhì)量濃度下有效二聯(lián)中藥對(duì)河流弧菌的抑菌作用

表3 240 mg·mL-1質(zhì)量濃度下有效二聯(lián)中藥對(duì)河流弧菌的抑菌作用

2.1.3 不同復(fù)方三聯(lián)中藥對(duì)河流弧菌的體外抑制效果在60 mg·mL-1低濃度藥物時(shí)，黃連、訶子、黃柏組成復(fù)方中藥、黃連、烏梅、黃柏組成復(fù)方中藥抑菌效果為中敏(表4)。蒲公英+五味子+訶子、訶子+白芍+蒲公英、訶子+醋五味子+板藍(lán)根、訶子+醋五味子+蒲公英、蒲公英+野菊花+訶子、訶子+烏梅+板藍(lán)根、烏梅+黃柏+訶子、烏梅+黃芩+訶子、黃連+板藍(lán)根+黃柏、黃連+醋五味子+黃芪、黃連+白芍+黃柏、訶子+醋五味子+甘草、烏梅+白芍+訶子、訶子+白芍+板藍(lán)根、烏梅+醋五味子+訶子、黃連+醋五味子+黃柏、黃連+黃芪+黃柏、黃連+白芍+黃芪、黃連+板藍(lán)根+黃芪、黃連+大黃+黃芪、黃連+連翹+黃芪、訶子+烏梅+甘草、訶子+烏梅+蒲公英、黃連+連翹+黃柏、板藍(lán)根+訶子+甘草、蒲公英+苦參+訶子、大黃+梔子+白芍、訶子+白芍+甘草、黃連+大黃+黃柏、黃連+烏梅+黃芪、烏梅+醋五味子+黃連、烏梅+黃柏+黃連、烏梅+白芍+黃連、烏梅+板藍(lán)根+黃連、烏梅+黃芩+黃連、烏梅+板藍(lán)根+訶子、白芍+醋五味子+大黃、大黃+槐花+白芍、大黃+黃芪+白芍、白芍+貫眾+大黃、黃柏+訶子+黃芪、黃連+訶子+黃芪、苦參+五味子+白芍、黃芩+訶子+黃芪、蒲公英+木香+訶子、黃芩+連翹+黃芪、黃芩+板藍(lán)根+黃芪、黃柏+醋五味子+黃芪48種復(fù)方中藥均無抑菌效果。在240 mg·mL-1藥物濃度時(shí)，黃連、板藍(lán)根、黃柏組成復(fù)方中藥、黃連、烏梅、黃柏組成復(fù)方中藥、黃連、白芍、黃柏組成復(fù)方中藥、黃連、黃芪、黃柏組成復(fù)方中藥、黃連、烏梅、黃芪組成復(fù)方中藥對(duì)河流弧菌的抑菌作用明顯，抑菌直徑大于20 mm，為高敏。黃連、醋五味子、黃柏組成復(fù)方中藥，黃連、大黃、黃芪組成復(fù)方中藥，黃連、醋五味子、黃芪組成復(fù)方中藥，黃連、連翹、黃柏組成復(fù)方中藥，黃連、白芍、黃芪組成復(fù)方中藥，黃連、連翹、黃芪組成復(fù)方中藥，黃連、訶子、黃柏組成復(fù)方中藥，黃連、板藍(lán)根、黃芪組成復(fù)方中藥，烏梅、醋五味子、黃連組成復(fù)方中藥，烏梅、黃柏、黃連組成復(fù)方中藥，烏梅、白芍、黃連組成復(fù)方中藥，烏梅、板藍(lán)根、黃連組成復(fù)方中藥，對(duì)河流弧菌的抑菌作用較明顯，為高敏。黃連、大黃、黃柏組成復(fù)方中藥，烏梅、黃芩、訶子組成復(fù)方中藥，烏梅、黃芩、黃連組成復(fù)方中藥，對(duì)河流弧菌的抑菌效果為中敏(表5)。蒲公英+五味子+訶子、訶子+白芍+蒲公英、訶子+醋五味子+板藍(lán)根、訶子+醋五味子+蒲公英、蒲公英+野菊花+訶子、訶子+烏梅+板藍(lán)根、烏梅+黃柏+訶子、訶子+醋五味子+甘草、烏梅+白芍+訶子、訶子+白芍+板藍(lán)根、烏梅+醋五味子+訶子、訶子+烏梅+甘草、訶子+烏梅+蒲公英、板藍(lán)根+訶子+甘草、蒲公英+苦參+訶子、訶子+白芍+甘草、大黃+梔子+白芍、烏梅+板藍(lán)根+訶子、白芍+醋五味子+大黃、大黃+槐花+白芍、大黃+黃芪+白芍、白芍+貫眾+大黃、黃柏+訶子+黃芪、黃連+訶子+黃芪、苦參+五味子+白芍、黃芩+訶子+黃芪、蒲公英+木香+訶子、黃芩+連翹+黃芪、黃芩+板藍(lán)根+黃芪、黃柏+醋五味子+黃芪30種復(fù)方無抑菌效果。參照實(shí)驗(yàn)菌種標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌對(duì)河流弧菌抑菌直徑數(shù)據(jù)，說明本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度強(qiáng)(表4，5)。相對(duì)于一聯(lián)中藥，二聯(lián)中藥的藥效，三聯(lián)的中藥抑菌作用強(qiáng)的中藥復(fù)方總數(shù)增加較多，說明選擇性能功效相類似的藥物配合應(yīng)用，中藥數(shù)增加能較大增強(qiáng)療效。

表460mg·mL-1濃度下有效三聯(lián)中藥對(duì)河流弧菌的抑菌作用

Tab.4 Results ofinvitrobacteriostatic experiment of combined prescriptions with 3 species of traditional

Chinese medicinal plants (60 mg·mL-1) on Vibro fluvialis

2.2 8種抗生素藥物敏感試驗(yàn)河流弧菌對(duì)恩諾沙星、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考、土霉素及磺胺嘧啶5種藥物高度敏感，對(duì)硫酸新霉素中度敏感，對(duì)硫酸慶大霉素及甲氧芐啶/磺胺甲噁唑2種藥物耐藥，具體見表6。

表5 240 mg·mL-1質(zhì)量濃度下有效三聯(lián)中藥對(duì)河流弧菌的抑菌作用

表6 河流弧菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

注：S，高度敏感；I，中度敏感；R，耐藥

Note: S, Highly sensitive; I, Moderately sensitive; R, Resistant

3 討 論

河流弧菌是一種可常見于海水養(yǎng)殖動(dòng)物(如青石斑Epinephelusawoara)中的嗜鹽性致病菌，具有較強(qiáng)的致病性，能引起多種養(yǎng)殖動(dòng)物包括石斑魚的疾病[3]，發(fā)病，病理變化主要表現(xiàn)為腹部膨大，死亡率高等，易造成較大損失。

3.1 單方中藥的抗菌作用中藥具有顯著的抗菌作用，具有顯著而廣譜的抗菌活性。中藥抑制細(xì)菌主要通過破壞其酶活性與繁殖，使菌蛋白質(zhì)變性、失活。中藥已廣泛用于多種魚類疾病治療，為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展做出重要貢獻(xiàn)[11]， 多位學(xué)者進(jìn)行中藥細(xì)菌體外抑制研究，黃連、黃柏、黃芩等清熱燥濕藥抑菌效果最好[12]，雞源多殺性巴氏桿菌(PasteurellaMultocida)對(duì)五味子、黃連、烏梅、黃柏、艾葉4 種藥物極敏[13]。在32 味中藥中， 五倍子、梔子、五味子、烏梅、黃芩、黃連、對(duì)嗜水氣單胞菌具有較強(qiáng)抑菌活性[14]。黃芩、連翹、黃連、金銀花對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌 (Acinetobacterbaumannii)有不同程度的體外抑菌作用，黃連的抑菌作用最強(qiáng)[15]。五倍子、大黃、虎杖和黃芩單用對(duì)養(yǎng)殖病鰻中的嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)均有較好的抑菌作用[16]。采用平板牛津杯法研究中藥對(duì)溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)的抑菌結(jié)果，在30 種中藥中，五倍子、白芍、對(duì)溫和氣單胞菌具有較強(qiáng)抑菌活性[8]，黃芩優(yōu)于金銀花，雞源多殺性巴氏桿菌對(duì)五味子、黃連、烏梅藥物極敏感。黃連、黃柏、艾葉對(duì)禽多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)敏感[17]。鰻鱺致病性氣單胞菌抑菌強(qiáng)弱依次為五倍子>石榴皮>大黃>黃芩>虎杖>黃連[7]。由此表明，因不同致病菌對(duì)不同中藥所含有效抗菌成分的敏感度不同。以上學(xué)者研究得出較強(qiáng)抑菌活性的中藥與本研究結(jié)果相似。本研究50種中藥對(duì)河流弧菌抑菌結(jié)果表明，單味中藥質(zhì)量濃度為240 mg·mL-1時(shí)，黃連、訶子、烏梅、黃柏、板藍(lán)根、黃芪、梔子對(duì)河流弧菌抑菌效果較強(qiáng)。與彭金菊研究結(jié)果相似，訶子、黃連也對(duì)嗜水氣單胞菌具有較強(qiáng)抑菌活性[14]。實(shí)驗(yàn)菌種標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌及河流弧菌抑菌直徑數(shù)據(jù)與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近，說明本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度高。目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者僅對(duì)少數(shù)幾種單藥的細(xì)菌體外抑制進(jìn)行研究，而本研究首次進(jìn)行50種藥物對(duì)細(xì)菌體外抑制比較研究，并篩選出抑菌有效藥物。

3.2 復(fù)方中藥的抗菌作用中藥復(fù)方是按君臣佐使的原則配伍而成。單味藥組成復(fù)方后可呈現(xiàn)協(xié)同抑菌作用，通過合理配制組方篩選，協(xié)同增效，取得更好的抑制細(xì)菌效果。復(fù)方藥物體外抑菌效果主要取決于藥物配比及各成分的濃度。本研究不同復(fù)方二聯(lián)中藥對(duì)河流弧菌的體外抑制效果，在240 mg·mL-1藥物濃度時(shí)，黃柏與黃連、黃連與烏梅等組成復(fù)方中藥對(duì)河流弧菌的抑菌作用明顯，為極敏感；訶子、白芍等3個(gè)復(fù)方中藥對(duì)河流弧菌抑菌作用為高敏；槐花與大黃組、五味子與苦參組成復(fù)方中藥抑菌效果為中敏，板藍(lán)根、訶子等30個(gè)復(fù)方中藥無藥效。參照實(shí)驗(yàn)菌種標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌對(duì)河流弧菌抑菌直徑數(shù)據(jù)，說明本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度高。相對(duì)于一聯(lián)中藥，二聯(lián)中藥的藥效更強(qiáng)，選擇性能功效相類似的藥物配合應(yīng)用，能增強(qiáng)療效。

三聯(lián)復(fù)方中藥比雙聯(lián)復(fù)方中起更顯著協(xié)同增效的體外抑菌效果[22-24]，較大增強(qiáng)復(fù)方中單味中藥的抑菌作用。彭金菊等測(cè)得五倍子分別與黃連、訶子，大黃、同時(shí)五倍訶子與其他多種中藥組成的復(fù)方抗菌作用增強(qiáng)[14]，與本研究結(jié)果相似。按一定比例組成的復(fù)方的抑菌及殺菌活性都強(qiáng)過組成復(fù)方的各單味藥，并且抑菌及殺菌活性都強(qiáng)過大黃、芩藍(lán)散、黃連解毒散和青蓮散[14]。國(guó)內(nèi)學(xué)者進(jìn)行少數(shù)藥物的復(fù)方研究，尚未見將22種有效單味藥進(jìn)行不同組合的抑菌研究，本研究不同復(fù)方三聯(lián)中藥對(duì)河流弧菌的體外抑制效果，在藥物60 mg·mL-1低質(zhì)量濃度時(shí)，黃連、訶子、黃柏組成復(fù)方中藥，黃蓮、烏梅、黃柏組成復(fù)方中藥，抑菌效果為中敏，其他如蒲公英、五味子、訶子組成的復(fù)方中藥等48種復(fù)方中藥均無抑菌效果；在藥物240 mg·mL-1質(zhì)量濃度時(shí)，黃連、板藍(lán)根、黃柏三聯(lián)中藥及黃連、醋五味子、黃柏組成復(fù)方中藥對(duì)河流弧菌的抑菌作用較明顯，為高敏。另黃柏、訶子、黃芪組成的復(fù)方中藥，黃連、訶子、黃芪組成的復(fù)方中藥等30種復(fù)方無抑菌效果。參照實(shí)驗(yàn)菌種標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌對(duì)河流弧菌抑菌直徑數(shù)據(jù)，說明本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度強(qiáng)。相對(duì)于一聯(lián)中藥，二聯(lián)中藥的藥效，三聯(lián)的中藥抑菌作用強(qiáng)的中藥復(fù)方增加較多。本研究結(jié)果對(duì)于河流弧菌感染性石斑魚疾病的中藥治療有一定的意義。

3.3 抗生素藥物的抑菌作用抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中廣泛且不合理應(yīng)用，使細(xì)菌的耐藥性日趨嚴(yán)重，給治療帶來了困難[18]。病原菌對(duì)抗生素的藥敏試驗(yàn)具有重要意義，秦蕾等[19]研究發(fā)現(xiàn)腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)對(duì)恩諾沙星較敏感，長(zhǎng)吻鮠(Leiocassislongirostris) 鮰愛德華氏菌(Edwardsvilleictaluri)對(duì)恩諾沙星、鹽酸多西環(huán)素、敏感[20]，虹鱒魚源氣單胞菌(Aeromonasspp.)對(duì)鹽酸多西環(huán)素和氟喹諾酮類藥物較為敏感，耐藥率均低于10%。其中鹽酸多西環(huán)素為最敏感的藥物，敏感率為100%[9]。磺胺嘧啶常作為一種飼料添加劑用于預(yù)防動(dòng)物疾病，單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)對(duì)其的耐藥率非常高，達(dá)到了46. 15%[21]，氟苯尼考容易使病原菌短時(shí)間產(chǎn)生較高的耐藥性，并且耐藥性消失較慢[20]。以上學(xué)者研究結(jié)果與本研究結(jié)果相似，河流弧菌對(duì)恩諾沙星、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考、土霉素及磺胺嘧啶5種藥物高度敏感。國(guó)內(nèi)尚無學(xué)者進(jìn)行多種養(yǎng)殖生產(chǎn)常用抗生素的細(xì)菌藥敏比較研究，本研究中河流弧菌對(duì)硫酸慶大霉素及甲氧芐啶/磺胺甲噁唑產(chǎn)生了耐藥。為減少耐藥性產(chǎn)生，在防治河流弧菌引起的疾病過程中，應(yīng)注意輪換使用不同抗生素。

河流弧菌耐藥機(jī)制多樣，尤其是抗生素被廣泛應(yīng)用以來，細(xì)菌耐藥性迅速增加，耐藥機(jī)制也變得越來越復(fù)雜,養(yǎng)殖戶和生產(chǎn)人員在養(yǎng)殖過程中，要在國(guó)家允許的藥物使用范圍內(nèi)，選取敏感藥物用于病害防治。合理使用抗生素類藥物，對(duì)防治日益嚴(yán)重的感染、減少耐藥菌的產(chǎn)生以及控制耐藥菌的傳播均具有十分重要的意義。中藥療效好，同時(shí)能增強(qiáng)魚體的免疫力，對(duì)于抗生素有抗藥性的細(xì)菌，中藥有良好抑菌作用。而抗生素具有治療效果快，用藥量少，是養(yǎng)殖中病害防治常用藥。使用中藥復(fù)方藥物，或中西藥聯(lián)用藥物，可降低抗生素用量，可減少魚類抗生素殘留，有利于出口創(chuàng)匯，同時(shí)可治療多種生產(chǎn)上長(zhǎng)期使用抗生素已無法治愈的魚病，達(dá)到較好的治療魚病效果，促進(jìn)我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。