腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞形態(tài)學研究方法進展

許 英,謝明征,梁國剛

許英,謝明征,梁國剛,大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腹部急癥外科/大連醫(yī)科大學中西醫(yī)結(jié)合研究院 遼寧省大連市 116000

核心提要：腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞(enteric glial cells,EGCs)是腸神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分,在胃腸道吸收、屏障、運動、分泌等功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用.研究發(fā)現(xiàn)其形態(tài)類似于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的星形膠質(zhì)細胞,在腸道中與鄰近的腸神經(jīng)元、腸上皮細胞、腸分泌細胞等都存在著密切的關系.胃腸道功能障礙時,EGCs形態(tài)會發(fā)生改變,研究其解剖位置及形態(tài)學變化,有助于揭示與其相鄰近細胞之間作用關系并且進一步提示其發(fā)揮功能作用的機制.

0 引言

Dogiel在1899年首次觀察并描述了腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞(enteric glial cells,EGCs)[1].1972年Gabella[2]確定EGCs是一種獨特的神經(jīng)膠質(zhì)細胞,不同于周圍神經(jīng)系統(tǒng)的其它部分,具有獨立的特征(其胞體比腸神經(jīng)元胞體小,有許多突起,在膠質(zhì)細胞體和突起中有大量膠質(zhì)絲).

1 腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞生理形態(tài)

Rühl[3]以成年豚鼠回腸為研究對象,在電子顯微鏡下觀察肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)節(jié)發(fā)現(xiàn)此處有非常緊湊的結(jié)構,周圍有基板,與結(jié)締組織和血管分離.所有的間隙由腸神經(jīng)和膠質(zhì)元素占據(jù),形成致密的神經(jīng)纖維網(wǎng),相鄰細胞膜之間有20 nm的間隙.EGCs在神經(jīng)節(jié)和神經(jīng)從連接處數(shù)量較多,其細胞核數(shù)量是神經(jīng)元細胞的2-3倍,膠質(zhì)細胞比神經(jīng)元細胞小,細長型,胞體界限不清楚,核橢圓形,有深深的凹痕,核外膜上附著大塊致密物質(zhì).其胞質(zhì)中含有豐富的核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細絲微管.膠質(zhì)細絲很突出,但其數(shù)量和密度是可變的.中心粒部分突出,有時會有纖毛.線粒體呈橢圓形,具有橫嵴和致密的嵴間基質(zhì).細胞核和線粒體的形態(tài)學特征為膠質(zhì)細胞的鑒定提供了良好的標準.膠質(zhì)細胞體大小、形狀不規(guī)則,典型線粒體存在,膠質(zhì)細胞絲和微管的出現(xiàn)是膠質(zhì)細胞識別的主要特征.

Hanani等[4]運用膠質(zhì)細胞穿刺灌注賴根過氧化物酶檢測,研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細胞的形態(tài)取決于它們在腸道中所處的位置和微環(huán)境狀態(tài),并且首次提出根據(jù)EGCs的形態(tài)學差異對膠質(zhì)細胞群體提出分類：神經(jīng)節(jié)內(nèi)的膠質(zhì)細胞與中樞神經(jīng)星形膠質(zhì)細胞相似呈星形,擁有非常短的不規(guī)則的突起,這種類型與中樞神經(jīng)系統(tǒng)灰質(zhì)內(nèi)的原生質(zhì)星形膠質(zhì)細胞非常相似,稱為“原生質(zhì)”或Ⅰ型腸膠質(zhì)細胞.神經(jīng)節(jié)間纖維束內(nèi)的膠質(zhì)細胞類似于中樞神經(jīng)纖維性星形膠質(zhì)細胞,與節(jié)間纖維束相平行性延長,并且很少的分支,稱為“纖維型”或“Ⅱ型腸膠質(zhì)細胞”.

Bohórquez等[5]用掃描電鏡與共聚焦顯微鏡聯(lián)合觀察并鑒定腸道分泌細胞,從三維角度研究其超微結(jié)構,發(fā)現(xiàn)腸內(nèi)分泌細胞的神經(jīng)莢膜由EGCs護衛(wèi).觀察到在固有層內(nèi)有腸膠質(zhì)細胞,并且所觀察EGCs形態(tài)的特征：長而薄的足突從細胞體和神經(jīng)元纖維呈放射狀延伸;在平面細胞體內(nèi)典型的細長核;這些突起在神經(jīng)纖維周圍形成獨特的神經(jīng)鞘.膠質(zhì)細胞從固有層由上皮下基層纖維形成的基板的開窗進入上皮.膠質(zhì)細胞突觸內(nèi)含有可見的小的透明的分泌小泡,類似于突觸末端,而神經(jīng)膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子可以促進腸內(nèi)分泌細胞神經(jīng)莢膜的發(fā)育.

相關研究進一步發(fā)現(xiàn)EGCs在腸道內(nèi)廣泛分布于腸道的黏膜層、黏膜下神經(jīng)叢、肌間神經(jīng)叢和肌層,腸外也分布于胃黏膜固有層[6,7].EGCs在腸黏膜上皮與黏膜下層的腸神經(jīng)系統(tǒng)之間形成網(wǎng)絡,其一端與腸上皮緊密接觸,另一端則緊密包繞腸神經(jīng),從而將腸上皮細胞與腸神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)系起來,貫穿整個腸壁[8].免疫組化也顯示,在小腸絨毛中,膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)陽性的膠質(zhì)細胞胞體和突觸緊鄰腸上皮,延伸至絨毛頂端[9].EGCs網(wǎng)絡分為三層：與腸上皮細胞緊密相連的為第一層,其足突與腸上皮細胞形成類似神經(jīng)突觸樣的特殊結(jié)構;EGCs彼此之間形成第二層,其通過足突形成的縫隙鏈接彼此相連;EGCs網(wǎng)絡延伸至黏膜深層,密切包繞神經(jīng)元及突觸間隙,形成第三層[10].

隨著研究不斷深入,發(fā)現(xiàn)EGCs在腸道微環(huán)境中呈現(xiàn)不同的形態(tài)特征,迄今為止分為四種形態(tài)類型：Ⅰ型或“原漿”和Ⅱ型或“纖維型”如前所述;Ⅲ型或“黏膜型”EGCs是上皮下的神經(jīng)膠質(zhì)細胞,有幾個長分枝;Ⅵ型或“肌肉內(nèi)”的EGCs是細長的膠質(zhì)細胞運行在肌肉組織的神經(jīng)纖維中[1,11,12].EGCs形態(tài)結(jié)構特征或許與其所處的微環(huán)境有關,根據(jù)所處位置還可以分為黏膜神經(jīng)膠質(zhì)、神經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)、肌內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì),而不同位置的膠質(zhì)細胞具有不同的生理功能[1].

2 EGCs病理學形態(tài)改變

一系列研究發(fā)現(xiàn)EGCs與胃腸道功能密切相關,在不同的胃腸道病理狀態(tài)下其形態(tài)會發(fā)生不同改變.

Fujikawa等[13]首次在腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)中觀察到EGCs發(fā)生的形態(tài)學的改變(即從絲狀到葉狀改變),EGCs結(jié)構的變化可能反映了其膠質(zhì)活性的改變.在IBS動物模型中免疫熒光觀察：大部分EGCs(GFAP免疫陽性)分布于腸道神經(jīng)元(HuCD免疫陽性)周圍,正常組可見少量與神經(jīng)元重疊的EGCs,然而這些EGCs密度增生即與神經(jīng)元重疊的EGCs增生密度在模型組(壓力增加)大鼠中逐漸增加.在不同壓力情況下,膠質(zhì)細胞根據(jù)其末端結(jié)構分為絲狀(沒有明顯頸部或球狀末端腫脹)和葉狀(頸部有球狀末端腫脹區(qū)).實驗組葉狀突起與每個神經(jīng)節(jié)總突起的比值高于對照組,在急性應激過去4 wk后,上述結(jié)構發(fā)生逆轉(zhuǎn).在應對應激反應中,增生的EGCs(尤其是球狀腫脹)表現(xiàn)與神經(jīng)元顯著重疊[14].

研究者應用免疫熒光染色觀察肌間神經(jīng)叢發(fā)現(xiàn),正常條件下EGCs包繞在神經(jīng)節(jié)周圍,扁平外突清晰光滑,連續(xù)延伸,熒光度偏低;失血性休克后出現(xiàn)變形,外突變得模糊,有些出現(xiàn)中斷,熒光度增強;電針足三里穴可以減輕失血性休克后EGCs的形態(tài)異常,外突比模型組清晰光滑,熒光度更強[15,16].在應用透射電鏡對IBS患者EGCs進行超微結(jié)構的觀察,電鏡結(jié)果顯示IBS患者EGCs異染色質(zhì)明顯減少(此為轉(zhuǎn)錄激活的信號),線粒體數(shù)目明顯增多,糖原顆粒明顯增多,鏡下粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及多核糖體經(jīng)肉眼觀察也多于對照組,表明IBS患者存在EGCs功能異?；钴S[17].

應用HE染色觀察慢傳輸便秘結(jié)腸黏膜形態(tài)學改變,發(fā)現(xiàn)對照組(正常組)EGCs及其突起組成神經(jīng)節(jié),細胞排列整齊均勻.模型組(慢傳輸便秘)EGCs明顯減少尤其以黏膜下環(huán)肌層表面和環(huán)肌層區(qū)域更加突出,神經(jīng)纖維空泡樣變性且排列紊亂,大部分模型動物結(jié)腸壁肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)叢的腸神經(jīng)元數(shù)量較空白對照組明顯減少.電鏡觀察對照組可見EGCs核染色質(zhì)分布均勻,核膜清晰,形態(tài)正常,胞質(zhì)內(nèi)線粒體,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),核糖體等細胞器結(jié)構清晰.模型組可見細胞核染色質(zhì)聚集,部分核固縮,細胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張[18].

采用消化道全層鋪片(whole mount stretch preparation)的方法研究缺血再灌注損傷時EGCs變化,發(fā)現(xiàn)正常狀態(tài)下動物腸肌間神經(jīng)叢EGCs縱橫交織呈網(wǎng)格狀包繞在腸神經(jīng)節(jié)周圍,與節(jié)間神經(jīng)連接,包繞軸突,延伸出的扁平外突把神經(jīng)元與神經(jīng)節(jié)外細胞不完全隔離,呈連續(xù)性分布,形成了一個巨大的網(wǎng)絡結(jié)構;而在缺血再灌注后,腸黏膜受到不同程度損傷,肌間神經(jīng)叢EGCs細胞也受到一定程度的受損,鈣結(jié)合蛋白S100β陽性細胞數(shù)量明顯減少,連續(xù)性條帶消失,網(wǎng)格變得模糊[19].

觀察EGCs在不同病理狀態(tài)下形態(tài)學的改變,對于揭示其在腸道中發(fā)揮的作用具有很重要的意義,提示EGCs在維護腸道屏障功能,改善腸道炎癥等方面發(fā)揮著重要的作用.

3 EGCs形態(tài)學研究方法

腸神經(jīng)系統(tǒng)在神經(jīng)胃腸病學中被稱為“腸腦”,主要由腸神經(jīng)元和EGCs組成,EGCs作為腸神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分,引起廣泛關注[20].研究者從不同的角度運用不同的研究方法研究EGCs在胃腸道中發(fā)揮的作用.其中對EGCs形態(tài)學的研究主要運用HE染色、免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)、免疫細胞技術、透射電鏡技術等,從大體觀到微觀結(jié)構觀察EGCs在生理和病理情況下的形態(tài)學改變.揭示了EGCs參與到胃腸道功能調(diào)節(jié),并且發(fā)揮著重要作用.

3.1 IHC技術 IHC是生命科學,尤其是現(xiàn)代病理學診斷、鑒別診斷、腫瘤特異性分子靶標篩選、鑒定的最重要技術手段之一,IHC技術于1941年Coons等[21]采用熒光素標記抗體檢測肺炎雙球菌研究時產(chǎn)生.隨著技術的不斷更新發(fā)展,產(chǎn)生了酶標抗體技術、賴根過氧化物酶標記抗體過氧化物酶技術、ABC法,快速ABC法、二步ABC法等等,隨著抗原修復技術的出現(xiàn),IHC技術的敏感性、特異性大幅度提高,靶標的定位更為準確、背景愈加清晰.此外,由于單克隆抗體技術的發(fā)展,IHC可檢測分子靶標譜和適用樣本范圍大幅度擴展,越來越多的指標可采用IHC在冷凍切片、細胞爬片、細胞滴片和常規(guī)福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣本中檢出[22,23].研究發(fā)現(xiàn),EGCs分泌膠質(zhì)原纖維酸性蛋白GFAP、鈣結(jié)合蛋白S100β、Sox8/9/10等[11,24],因此通常以GFAP或S100β免疫陽性作為EGCs標志物,檢測其在胃腸標本中整體表達和分布情況,并進行半定量分析.但研究發(fā)現(xiàn),GFAP、S100β抗體在免疫組化染色模式下不能很好地區(qū)分單個細胞,而且其在腸道組織中免疫反應不規(guī)則及片狀化,不允許進行一定的定量IHC研究.Sox8/9/10免疫陽性完全局限于膠質(zhì)細胞核,能夠清楚明確地辨別單個細胞,從而能夠較容易而可靠地實現(xiàn)對EGCs定量[25].在研究神經(jīng)膠質(zhì)細胞和腸神經(jīng)元凋亡在難治性慢傳輸型便秘的神經(jīng)病理學中的作用時,研究者運用免疫組化染色發(fā)現(xiàn)與正常組相比,慢傳輸型便秘患者腸內(nèi)神經(jīng)元和ICC細胞明顯減少,但EGCs(S100標記)減少的更加明顯,可能進一步削弱本已不穩(wěn)定的神經(jīng)腸內(nèi)平衡[26].為進一步了解EGCs在人類胃腸道疾病中的作用,任何腸全層活檢的組織病理學研究不僅評估神經(jīng)元,而且應該查看腸神經(jīng)膠質(zhì)網(wǎng)絡的異常變化.

3.2 免疫熒光染色技術 免疫熒光染色技術是將抗體或抗原在不影響其免疫學特性的條件下,以化學方法同熒光素相結(jié)合,然后將標記有熒光素的抗體(或抗原)作為試劑,在特定的條件下與相應抗原(或抗體)進行反應,再借助熒光顯微鏡觀察特異性免疫熒光現(xiàn)象的一種免疫標記技術免疫熒光技術特點：快速性、敏感性、廣泛適應性、定位性.缺點：不能對組織細胞進行細微結(jié)構的觀察,不易鑒別細胞種類,難以制備永久性標本,熒光容易消退.免疫熒光染色特點是可在細胞水平上對特異性抗原或抗體 定位的一種通用手段.其中多重免疫熒光染色技術利用抗原-抗體特異性結(jié)合的原理,可對細胞中多種蛋白進行可視化定量、定性及共定位.間接免疫熒光技術,一直以來同種來源的抗體染色會發(fā)生相互串色,造成結(jié)果誤判,而運用間接多重免疫熒光染色可避免這種情況.基于免疫過氧化物-免疫熒光序貫技術的圖像編輯系統(tǒng),該方法采用數(shù)字圖像編輯技術將兩個獨立采集的圖像合并為一個合并圖像,采用間接免疫過氧化物酶,然后依次進行間接免疫熒光、數(shù)字圖像采集和圖像編輯.可以實現(xiàn)在不同細胞中識別不同抗原以及在同一細胞中共定位抗原.與雙重免疫熒光相比,能更好觀察組織形態(tài)結(jié)構,很容易在同一個細胞中定位兩個不同抗原[27].

通過免疫熒光技術標記GFAP來檢測EGCs,結(jié)果顯示正常EGCs胞體內(nèi)含有大量大小、形狀不同的突觸,其圍繞著細胞核呈現(xiàn)清晰、連續(xù)、細長的形態(tài),分布在細胞體邊緣[28].在對功能性消化不良患者十二指腸活檢進行免疫熒光染色觀察發(fā)現(xiàn)正常組黏膜下神經(jīng)叢內(nèi)EGCs(S100標記)包繞腸神經(jīng)元(HuCD免疫陽性)并在神經(jīng)節(jié)內(nèi)形成清晰的網(wǎng)絡結(jié)構,為腸神經(jīng)提供網(wǎng)絡結(jié)構和功能支持.而功能性消化不良組黏膜下神經(jīng)叢內(nèi)腸神經(jīng)元周圍膠質(zhì)細胞反應性增生,體積增大,網(wǎng)絡結(jié)構紊亂,單個細胞無法識別.此觀察結(jié)果是功能性消化不良疾病黏膜下神經(jīng)叢腸神經(jīng)功能和結(jié)構異常的直接證據(jù),可能對功能性消化不良具有預測和診斷的價值[29].

3.3 全層鋪片技術 消化道全層鋪片即整裝撕片.根據(jù)消化道管壁內(nèi)神經(jīng)叢的結(jié)構特點,分縱層肌、環(huán)層肌、黏膜下層等分層撕開鋪片,以暴露不同的壁內(nèi)神經(jīng)叢,是研究腸壁內(nèi)神經(jīng)形態(tài)和分布的有效實驗手段.可以直接暴露肌間神經(jīng)叢,能完整觀察神經(jīng)叢的形體和結(jié)構,另外,神經(jīng)元和神經(jīng)纖維的數(shù)量較大,可以提高神經(jīng)叢上待測物質(zhì)的陽性率[30,31].神經(jīng)叢為扁平網(wǎng)狀結(jié)構,使用全層鋪片技術與IHC染色相結(jié)合可以直觀、全面顯示所要觀察細胞的形態(tài)、整體結(jié)構或多細胞間的相互關系及位置變化.研究大鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢內(nèi)EGCs時,在體式顯微鏡下逐層剝離黏膜層、黏膜下層,環(huán)形肌,清楚顯示位于縱、環(huán)肌之間的肌間神經(jīng)叢,將組織撕片附于載玻片上,獲得腸肌間神經(jīng)叢全層鋪片標本.再與神經(jīng)膠質(zhì)細胞特異性標志物鈣結(jié)合蛋白S100β免疫熒光組織化學染色相結(jié)合,可清晰顯示肌間神經(jīng)叢EGCs的形態(tài),即從胞體發(fā)出的突起伸展填充在神經(jīng)元胞體及其突起之間[32].全層鋪片技術可以很好補充冰凍切片或石蠟切片在實驗觀察中的不足.制備全層鋪片后再進行細胞學或免疫細胞化學染色,能較好地顯示胃腸道環(huán)形肌、縱形肌、肌間神經(jīng)叢及其周圍細胞的形態(tài)與結(jié)構,便于觀察疾病時腸神經(jīng)系統(tǒng)及其周圍細胞的形態(tài)結(jié)構與重塑[33].

3.4 電鏡技術 透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)能夠在超微結(jié)構水平上觀察生物組織、細胞及細胞器的形態(tài)結(jié)構[34].透射電鏡技術在各組織超微結(jié)構病理學觀察中發(fā)揮著無可替代的作用,它是以電子束為“光源”通過電磁透鏡成像的電子光學儀器,放大倍數(shù)可達幾十萬倍[35].應用透射電鏡觀察EGCs的超微結(jié)構染色質(zhì)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器結(jié)構,是研究EGCs生理病理情況下超微結(jié)構變化最常用的方法.但透射電鏡對樣本制作及儀器的操作要求極高,其中透射電鏡制樣過程中樣本超微結(jié)構的保存受多種因素的影響[36].

另外掃描電子顯微鏡可以將特定細胞的精細超微結(jié)構在三位空間中被揭示出來,使細胞和組織的超微結(jié)構在三維中以常規(guī)和自動化的方式呈現(xiàn).掃描電子顯微鏡在神經(jīng)科學中已經(jīng)非常流行,它有助于揭示神經(jīng)回路的特定突觸連接.用掃描電鏡觀察到在固有層內(nèi)腸膠質(zhì)細胞,以三維視角可看到更為清晰的特征：(1)長而薄的足突從細胞體和神經(jīng)元纖維呈放射狀延伸;(2)在平面細胞體內(nèi)典型的細長核;(3)這些突起在神經(jīng)纖維周圍形成獨特的神經(jīng)鞘.膠質(zhì)細胞從固有層由上皮下基層纖維形成的基板的開窗進入上皮.膠質(zhì)細胞突觸內(nèi)含有可見的小的透明的分泌小泡,類似于突觸末端[5].

4 結(jié)論

EGCs形態(tài)學的研究是對其進行鑒別以及分子特征和功能特征研究的前提,也是充分了解EGCs在胃腸道功能和疾病中發(fā)揮作用的前提,有效的形態(tài)學研究方法尤為重要.EGCs的形態(tài)取決于它們在胃腸道中所處的位置和微環(huán)境狀態(tài),在病理狀態(tài)下還可以發(fā)生表型改變和重塑,以應對營養(yǎng)、機械、疾病相關的損傷.大量研究已經(jīng)揭示了EGCs在胃腸道中不僅僅局限于營養(yǎng)、支持腸神經(jīng),還參與胃腸道穩(wěn)態(tài)、腸道黏膜屏障、胃腸道運動、胃腸道免疫等功能的調(diào)節(jié).對于未來的研究更多傾向于研究EGCs起作用的復雜的分子信號機制.集中于研究EGCs與腸上皮細胞、腸神經(jīng)元、腸道免疫細胞、腸道分泌細胞相互之間作用機制,影響調(diào)節(jié)腸道的許多功能,如運動、分泌、屏障功能.采用有效的研究方法,從形態(tài)學角度揭示EGCs及與鄰近細胞形態(tài)學變化將對其作用機制的研究有很大的提示作用.此外,運用有效的形態(tài)學研究方法觀察病理狀態(tài)下EGCs數(shù)量及形態(tài)結(jié)構的改變對于臨床診斷和評估胃腸道疾病具有重要的意義.除了傳統(tǒng)的免疫熒光、電鏡等技術外,較前沿的基因嵌合分析與免疫染色雙標相結(jié)合等方法,對EGCs進行高分辨率的形態(tài)學表征的研究,擴展了先前關于EGCs形態(tài)學的研究.技術不斷發(fā)展,那么更精準的形態(tài)學研究方法有待于進一步探索.