富血小板纖維蛋白運(yùn)用于直接蓋髓術(shù)的研究進(jìn)展

楊雪 黎淑芳

【關(guān)鍵詞】富血小板纖維蛋白;直接蓋髓術(shù);牙髓細(xì)胞

中圖分類(lèi)號(hào)：R781.05?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.12.015

直接蓋髓術(shù)是保存活髓的有效手段，將蓋髓材料覆蓋于暴露的牙髓組織上，隔絕外界刺激，誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，并為牙髓細(xì)胞提供附著空間，最終在穿髓孔處形成管狀修復(fù)性牙本質(zhì)，這是直接蓋髓術(shù)理想的組織學(xué)表現(xiàn)。牙髓細(xì)胞可在各種細(xì)胞生長(zhǎng)因子作用下向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，而富血小板纖維蛋白（Platelet-rich fibrin，PRF）可緩慢持續(xù)釋放生長(zhǎng)因子，進(jìn)一步影響和引導(dǎo)牙髓細(xì)胞的增殖、分化過(guò)程。PRF膜已廣泛應(yīng)用于口腔領(lǐng)域，應(yīng)用于直接蓋髓術(shù)具有較大臨床意義和廣泛研究前景，但仍存在大量問(wèn)題需要進(jìn)一步研究，故本文對(duì)PRF膜用于直接蓋髓術(shù)的相關(guān)研究作一綜述。

1?直接蓋髓材料簡(jiǎn)介

氫氧化鈣（Calcium hydroxide，CH）作為直接蓋髓材料長(zhǎng)期應(yīng)用于臨床，曾作為衡量其他直接蓋髓劑性能的金標(biāo)準(zhǔn)，但運(yùn)用于臨床仍有較大的局限性[1～2]。礦化三氧化聚合物（Mineral trioxide aggregate，MTA）是一種新型的蓋髓劑，具有親水性強(qiáng)、生物相容性及封閉性較好等特點(diǎn)。關(guān)于MTA與CH用于直接蓋髓術(shù)的Meta分析發(fā)現(xiàn)，MTA具有更高的成功率，因其產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)更低，而形成硬度更高的牙本質(zhì)橋[3]。新型生物陶瓷材料不僅具有良好的生物相容性和封閉性，還有顯著的抗菌作用且無(wú)細(xì)胞毒性，如iRoot BP具有與MTA相似的促進(jìn)完整牙本質(zhì)形成的能力，同時(shí)減少牙髓的炎癥反應(yīng)[4]。生長(zhǎng)因子復(fù)合蓋髓材料指生長(zhǎng)因子與一定的載體材料復(fù)合作為一種蓋髓劑，如以納米晶體硫酸鈣半水合物，羥基磷灰石和硫酸鈣半水合物作為貯庫(kù)，將轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子加入到貯庫(kù)中形成緩釋劑運(yùn)用于直接蓋髓術(shù)中，這些生長(zhǎng)因子具有促進(jìn)牙本質(zhì)形成的能力[5～7]，但這些外源性生長(zhǎng)因子難以獲得，易被體內(nèi)的蛋白酶破壞，費(fèi)用高且異體生物材料存在潛在的排異反應(yīng)。

2?PRF的制備、結(jié)構(gòu)和成分

由Choukroun提出的PRF的制備方法如下：用真空采血管（不含任何抗凝劑）抽取10 mL靜脈血，即刻在400 g（3000 r/min）離心力下離心10 min，靜置5 min;離心后血液可以分成三層：上層為無(wú)細(xì)胞血漿，中間層為PRF，下層為紅細(xì)胞層[8]。PRF的三維結(jié)構(gòu)由纖維蛋白網(wǎng)構(gòu)成，血小板和白細(xì)胞主要分布在紅細(xì)胞和PRF凝膠之間的交界處，稱(chēng)為血沉棕黃層，此區(qū)域可以釋放高濃度生長(zhǎng)因子，PRF凝膠的提取物可以時(shí)間依賴(lài)的方式加速人牙髓細(xì)胞（human Dental Pulp Cells，hDPCs）的增殖[9]。He等[10]制備的PRF-hDPCs復(fù)合體保存了PRF的結(jié)構(gòu)的完整性，而hDPCs分布于血沉棕黃層，證明此區(qū)域有可能是PRF最有效部位。在近細(xì)胞端纖維排列較致密，含大量血小板，膠原纖維排列成疏松多孔網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)，α-顆粒釋放于細(xì)胞和纖維之間，而有些α-顆粒未被釋放，被網(wǎng)狀纖維緊緊包裹，這些纖維對(duì)血小板激活起保護(hù)作用，隨著纖維蛋白逐漸降解，血小板激活釋放生長(zhǎng)因子于纖維蛋白支架中，受膠原纖維保護(hù)抵抗蛋白降解，延長(zhǎng)了生長(zhǎng)因子效應(yīng)時(shí)間。因此，PRF的纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是其相對(duì)延長(zhǎng)生長(zhǎng)因子作用時(shí)間的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，所含的大量白細(xì)胞可能具有很高的免疫學(xué)價(jià)值[11～12]。

PRF釋放大量生長(zhǎng)因子，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor，TGF-β1）影響成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，同時(shí)上調(diào)與牙本質(zhì)礦化相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的基因表達(dá)，促進(jìn)牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體形成[13]。Lin等[14]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)TGF-β1培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞，環(huán)氧合酶-2和前列腺素產(chǎn)生E2的水平升高，此作用通過(guò)ALK5/Smad2/3和MEK/ERK通路實(shí)現(xiàn)，TGF-β1促進(jìn)前列腺素產(chǎn)生E2的分泌，不僅影響牙髓的炎癥反應(yīng)，同時(shí)參與牙髓細(xì)胞的修復(fù)過(guò)程，這同時(shí)也提示了炎癥反應(yīng)是牙髓修復(fù)的早期標(biāo)志。PRF釋放人類(lèi)骨形成蛋白（Human bone morphogenetic protein，hBMP），其中hBMP-2、hBMP-7可以明顯增加牙髓細(xì)胞堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，誘導(dǎo)牙本質(zhì)涎磷蛋白表達(dá)，形成管樣牙本質(zhì)[15]。而將具有生物活性的蛋白，即生長(zhǎng)因子應(yīng)用于直接蓋髓術(shù)是否對(duì)活髓保存的成功率有影響，Luiz等[16]對(duì)相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)作了系統(tǒng)性評(píng)價(jià)，得出結(jié)論：在動(dòng)物模型中，研究最多的蛋白是BMP-7、TGF-β1以及萃取可溶性牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白;生物活性分子或材料可以促進(jìn)第三期牙本質(zhì)的形成，同時(shí)初始炎癥反應(yīng)更輕。如今，將具有促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖分化的生長(zhǎng)因子運(yùn)用到蓋髓材料中，成為蓋髓材料研發(fā)的熱點(diǎn)。

3?PRF作為直接蓋髓術(shù)的機(jī)制、細(xì)胞學(xué)及臨床研究

3.1?機(jī)制研究

PRF通過(guò)PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路促進(jìn)牙髓細(xì)胞的增殖和蛋白合成[17]。另外，經(jīng)PRF處理過(guò)的DPSCs高表達(dá)成牙本質(zhì)基因和成骨基因，通過(guò)上調(diào)骨橋蛋白表達(dá)和促進(jìn)ALP活性促進(jìn)礦化。研究還發(fā)現(xiàn)PRF膜可以最少在1周內(nèi)，最長(zhǎng)可達(dá)28天，緩慢地、持續(xù)地釋放重要的生長(zhǎng)因子，意味著PRF可以自身結(jié)構(gòu)為支架釋放生長(zhǎng)因子[18]。PRF可以增強(qiáng)成牙本質(zhì)標(biāo)志物相關(guān)mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，如牙本質(zhì)涎磷蛋白、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1，此外，PRF通過(guò)誘導(dǎo)具有時(shí)間依賴(lài)性的抗壞血酸和β磷酸甘油來(lái)激活A(yù)LP活性，促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的形成[19]。不同濃度PRF浸出液對(duì)DPSCs的增殖、分化作用不同，楊盼盼等[20]在犬牙髓細(xì)胞的體外研究中發(fā)現(xiàn)，0.40濃度的PRF浸出液可促進(jìn)cDPCs的增殖、趨化作用，但需進(jìn)一步研究進(jìn)行驗(yàn)證。

3.2?PRF膜用于直接蓋髓術(shù)的細(xì)胞學(xué)研究

PRF膜用于直接蓋髓術(shù)有其細(xì)胞學(xué)及機(jī)制研究基礎(chǔ)作為理論依據(jù)。有研究表明，在一定濃度范圍內(nèi)，洗滌血小板與富血小板血漿都可以明顯促進(jìn)大鼠牙髓細(xì)胞增殖及礦化[21]。PRF可抑制人牙髓細(xì)胞炎癥反應(yīng)，刺激成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化。Kim等[22]將脂多糖加入人牙髓干細(xì)胞（hDPSCs）的培養(yǎng)基中，以模擬牙髓組織因外傷或齲病所致細(xì)菌感染的炎癥狀態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)PRF提取液可使hDPSCs中的IL-1β、IL-6和IL-8的表達(dá)下降，并抑制血管內(nèi)黏著分子-1和細(xì)胞內(nèi)黏著分子-1的表達(dá)，但牙本質(zhì)涎磷蛋白表達(dá)量增加、ALP增強(qiáng)。

3.3?PRF膜用于直接蓋髓術(shù)的動(dòng)物研究

在2011年，Orhan等[23]將富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）用于大鼠切牙直接蓋髓術(shù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，成牙本質(zhì)樣細(xì)胞的數(shù)目與修復(fù)性牙本質(zhì)的厚度均增加，認(rèn)為PRP可以誘導(dǎo)大鼠內(nèi)源性的修復(fù)性牙本質(zhì)形成，但這種蓋髓劑對(duì)于牙髓的損傷還要進(jìn)一步研究。Puspita等[24]發(fā)現(xiàn)PRP可以作為一種誘導(dǎo)巢蛋白表達(dá)的直接蓋髓劑，而巢蛋白是一種成牙本質(zhì)樣細(xì)胞特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)，為一種調(diào)節(jié)細(xì)絲蛋白，是成牙本質(zhì)細(xì)胞的功能與分化的標(biāo)志物，是與牙本質(zhì)基質(zhì)分泌能力有關(guān)的蛋白，即PRP用于直接蓋髓術(shù)能使牙髓組織的成牙本質(zhì)能力增強(qiáng)。而PRF作為第二代血小板凝聚物，其安全性?xún)?yōu)于第一代血小板凝聚物PRP，不像第一代的PRP，PRF的制備不需要加入牛凝血酶抗凝劑，因而更加簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)。

3.4?PRF膜用于直接蓋髓術(shù)的臨床研究

由于PRF膜的濕潤(rùn)、強(qiáng)度低的理化性質(zhì)，PRF膜直接覆蓋在露髓口上，表面濕度較大，其封閉性能較差，應(yīng)用于臨床直接蓋髓術(shù)仍具有一定局限性。因此尋求一種具有良好生物相容性及封閉性的材料，將其與PRF膜聯(lián)合應(yīng)用于直接蓋髓術(shù)成為復(fù)合蓋髓劑的新選擇。李響等人[25]以PRF/Dycal、Dycal及PRF分別作為蓋髓劑對(duì)家兔門(mén)齒進(jìn)行直接蓋髓術(shù)，發(fā)現(xiàn)各組中均未見(jiàn)完整修復(fù)性牙本質(zhì)橋形成，這與Moradi等[26]在2015年的研究結(jié)果相似，他認(rèn)為相較于PRP以及Propolis樹(shù)脂，MTA仍然是更佳的直接蓋髓劑。分析其原因認(rèn)為PRF組中直接用玻璃離子水門(mén)汀封洞，而玻璃離子對(duì)牙髓具有一定的刺激性，會(huì)引起牙髓壞死，而PRF/Dycal組氫氧化鈣對(duì)PRF膜有一定毒性，且PRF和Dycal邊緣封閉性差，因此需尋求一種與PRF膜具有更好生物相容性，同時(shí)具備良好的邊緣封閉的材料至關(guān)重要。李威等人[27]將PRP與MTA聯(lián)合作為直接蓋髓劑，認(rèn)為PRP與MTA復(fù)合蓋髓具有良好的牙髓修復(fù)效果。Woo等[28]研究發(fā)現(xiàn)，相較于單獨(dú)PRFe或MTA用于培養(yǎng)HDPCs，PRFe與MTA聯(lián)合培養(yǎng)可上調(diào)HDPCs牙本質(zhì)涎磷蛋白、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1的表達(dá)，提高ALP活性，且通過(guò)激動(dòng)BMP/Smad通路促進(jìn)人牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化以及礦化。Solomon等[29]在2015年在其病例報(bào)告中，將PRF膜聯(lián)合Biodentine材料應(yīng)用于5例17～20歲患者的5顆恒磨牙齲源性急性不可復(fù)性牙髓炎的冠髓切斷術(shù)以保存根髓，結(jié)果術(shù)后第3、6、9、12、18、22和24個(gè)月復(fù)診的臨床檢查以及影像學(xué)檢查都表明活髓保存成功。冠髓切斷術(shù)與直接蓋髓術(shù)都是活髓保存的重要方法，Solomon團(tuán)隊(duì)將PRF膜應(yīng)用于冠髓切斷術(shù)的成功病例，恰恰證明了PRF膜應(yīng)用于直接蓋髓術(shù)也應(yīng)具有較高的可行性。

4?總結(jié)

綜上所述，具有穩(wěn)定釋放生長(zhǎng)因子的生物材料是直接蓋髓劑的發(fā)展趨勢(shì)，PRF對(duì)牙髓損傷的修復(fù)作用尚面臨著不少難點(diǎn)問(wèn)題，比如PRF濃度的不同對(duì)于成牙本質(zhì)效果的影響還未得出準(zhǔn)確定論，但由于PRF具有來(lái)源豐富、取材方便、可由自體獲得，相較于人工合成或外源性提取的生長(zhǎng)因子具有更高的生物安全性、操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉等優(yōu)勢(shì)，所以其在直接蓋髓術(shù)的臨床應(yīng)用上具有廣泛前景。

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（收稿日期：2019-07-03?修回日期：2019-08-16）

（編輯：潘明志）