鎖核酸在肝癌的基因診斷與治療研究新進展

彭彬 鄧益斌

【摘要】鎖核酸（locked nucleic acid，LNA）是一種新穎的核苷酸衍生物，其作為一種反義治療藥物在分子生物學研究領域引起了廣泛關注，有希望成為治療各種疾病和腫瘤的新突破口。目前，LNA技術是分子生物學領域開展較為成熟的技術之一，因LNA具有極強的抗核酸酶能力、反義活性、水溶性好及體內無毒性等優(yōu)點而倍受人們關注，特別在與DNA、RNA雜交具有強大的親和力展現(xiàn)出令人鼓舞的前景。然而，LNA技術在肝癌的基因診斷與治療研究領域仍然處于探索階段，綜述國內外有關LNA技術在肝癌的基因診斷與治療領域的應用研究及其進展，總結LNA的結構、在肝癌的基因診斷與治療研究領域的應用現(xiàn)狀、存在的問題及前景，有望為進一步深入研究LNA技術在其他領域的應用提供參考。

【關鍵詞】鎖核酸;肝癌;基因診斷;基因治療

中圖分類號：R735.7?文獻標志碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.12.001

【Abstract】Locked nucleic acid（LNA） is a novel nucleotide derivative.As an antisense therapeutic drug，it has attracted wide attention in the field of molecular biology and expected to become a new breakthrough for the treatment of various diseases and tumors.At present，LNA technology is one of the more mature technologies in the field of molecular biology.Because of its strong antinuclease ability，antisense activity，good water solubility，and non-toxicity in vivo，LNA technology has attracted much attention.Especially in hybridization with DNA and RNA，it has shown promising prospects.However，LNA technology is still in the exploratory stage in the field of gene diagnosis and treatment of liver cancer.Through summarizing the domestic and foreign applied research and the progress of LNA technology in the field of gene diagnosis and treatment of liver cancer，the structure of LNA，its application status，existing problems and prospects in the field of gene diagnosis and therapeutic research for liver cancer，this paper may provide references for further in-depth study of LNA technology for other fields.

【Key words】locked nucleic acid;liver cancer;gene diagnosis;gene therapy

1994年，Rodriguez等在發(fā)酵副產物中發(fā)現(xiàn)鎖核酸（laked nucleic acid，LNA）。四年后，Kumar等[1]對LNA進行了第一次合成與雜交試驗，隨后，Wang等[2～3]進一步報道了LNA相關結構與性能的實驗。LNA的產生給生物學技術及基因的診斷與治療領域帶來了進一步的發(fā)展和突破，更有利于人們研究各種由于基因缺失或異常所引起的疾病，對研究先天性疾病或腫瘤也具有重要的意義，并且使某些現(xiàn)階段無法治愈的疾病在基因水平基礎上可在未來實現(xiàn)完全治愈的可能。因此，筆者對LNA的結構、安全性和在肝癌的基因診斷與治療進展進行綜述，以期為LNA技術應用研究提供參考。

1?鎖核酸結構

LNA是近幾年核酸研究領域的新熱點，又稱為橋核酸，是一種特殊的雙環(huán)狀核苷酸衍生物，結構中含有一個或多個2-O，4-C-亞甲基-β-D-呋喃核糖核酸單體，核糖中的2-O位和4-C位通過不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋，并連接成環(huán)形，這個環(huán)形橋鎖定了呋喃糖C3-內型的N構型，降低了核糖結構的柔韌性，并增加了磷酸鹽骨架局部結構的穩(wěn)定性。LNA穩(wěn)定性不僅體現(xiàn)在本身的結構上，在與其他物質相結合的時候，可以在一定程度上增加兩者復合物的穩(wěn)定性。Pabon等[4]報道，LNA與c-myc基因或共濟蛋白（Frataxin）序列相結合時，隨著LNA所取代的位置和數(shù)目出現(xiàn)不同的變化：當 LNA占兩者復合物的比例較低時，復合物的三鏈體結構不穩(wěn)定，而在三鏈形成的3末端的LNA含量升高，三鏈體形成速率和延伸可以得到提升，所形成的復合物的三鏈結構極其穩(wěn)定。此外，LNA取代的雙鏈嘧啶鏈中改變了雙螺旋結構，其通過主溝槽調節(jié)影響了復合體空間結構，有利于形成三角形結構，從而使復合物更加穩(wěn)定。

在20世紀90年代末，研究人員常用三唑鍵取代磷酸鍵的寡核苷酸以進行下一步實驗，但是這種寡核苷酸在體內的抗核酸酶能力尚不理想，LNA是近些年核酸研究領域的新熱點，與其他核苷酸類似物相比，LNA與DNA、RNA在結構上具有相同的磷酸鹽骨架，故對DNA、RNA具有很好的識別能力和親和力。因此，有人嘗試將兩個寡核苷酸組合在一起，以創(chuàng)造一個既穩(wěn)定又成熟的寡核苷酸。Kumar等[5]報道三唑鍵取代磷酸鍵的寡核苷酸與LNA組合在一起形成新寡核苷酸時，在與RNA、DNA結合的過程中，發(fā)現(xiàn)新寡核苷酸展現(xiàn)出更高的特異性和更強的親和力，并且明顯優(yōu)于僅含有三唑鍵取代磷酸鍵的寡核苷酸或LNA，這是因為三唑鍵取代磷酸鍵的寡核苷酸與LNA的組合可能改變了空間構象，使得此復合物與DNA、RNA的結合能夠降低DNA、RNA的陰離子，且更具有親和力和穩(wěn)定性。不僅如此，與單獨的三唑鍵取代磷酸鍵的寡核苷酸或LNA相對比，此復合物對核酸酶的酶解作用具有更強的抗性，并已證實此復合物對30種核酸外切酶也同樣具備很強的抗性，因此，此復合物在治療藥物中的適當比例可以大大提高藥物在體內穩(wěn)定性[6]。與此同時，Sharma等[7]合成并研究了三唑連接的、LNA修飾的二核苷酸特性，并將它們結合到反義寡核苷酸和雙鏈的siRNA中，他們發(fā)現(xiàn)此二核苷酸在寡核苷酸的3或5末端摻入時產生高結合親和力，具有高活性和核酸酶抗性，其中已知的螺旋結構更具有靈活性，并且令人驚訝的是，含有三唑二聚體修飾的siRNA是該系列中最活躍的siRNA。

值得一提的是，經過科研工作者多年的努力和分子生物學等技術的發(fā)展與進步，不斷有人報道基于LNA更好的寡核苷酸，如Morita等[8]提出，與LNA相比，在核糖的2-O和4-C之間具有乙烯橋的2-O，4-C-乙烯橋聯(lián)核酸（ENA）除了具備LNA一樣高的互補DNA、RNA結合力之外，還具有更高的核酸酶抗性，說明了這是一個具有良好前景的反義治療物，具有重大的研究價值。

2?LNA技術治療的安全性

在肝癌的基因治療過程中，人們最關心的是LNA技術是否會對肝臟帶來毒性損害。Guérard等[9]用小鼠淋巴瘤試驗和微核試驗評估了LNA在小鼠淋巴瘤細胞中誘導DNA損傷的潛力。所有的實驗都沒有證明被測試的LNA具有基因毒性效應。與此同時，在標準基因毒性體內與體外試驗中測試的數(shù)據(jù)也均為陰性。Dieckmann等[10]利用體外方法轉染小鼠成纖維細胞來預測LNA修飾的不同Tm值寡核苷酸的肝毒性。研究結果表明，LNA修飾的不同Tm值寡核苷酸所引起的肝毒性在小鼠成纖維細胞中也明顯不同，這結果可能對人體也具有同樣的作用。此外還發(fā)現(xiàn)，LNA修飾的寡核苷酸的Tm值維持在55℃的閾值水平以下時，肝毒性大大降低。

3?LNA在肝癌的基因診斷

肝癌分為原發(fā)性肝癌和繼發(fā)性肝癌兩大類，原發(fā)性肝癌是指起源于肝臟的上皮組織或間葉組織的惡性腫瘤，我國主要以原發(fā)性肝癌為主，對我國居民生命健康危害極大;繼發(fā)性肝癌是指其他器官起源的惡性腫瘤轉移或侵犯至肝臟所引發(fā)的癌癥，一般以胃、膽道、胰腺、結直腸、卵巢、子宮、肺、乳腺等器官惡性腫瘤的肝轉移多見。目前，全球每年肝癌發(fā)病人數(shù)在100萬以上，居世界第六位，死亡率居世界第二位，其中我國肝癌發(fā)病率為42.5%，新發(fā)病例和死亡病例中有一半以上發(fā)生在中國[11]。截止2015年，我國肝癌發(fā)病466 000余人，位列我國所有惡性腫瘤的第4位，死亡率為20.4/10 萬，占我國全部惡性腫瘤死亡的18.8%，位列所有惡性腫瘤的第3位[12]。在中國所有癌癥中，肝癌的存活率最低，5年相對存活率僅為10.1%[13]。與其他惡性腫瘤相同，肝癌的發(fā)生由多基因參與的、復雜的病理生理過程，而非編碼RNA（Non-coding RNA）在肝癌的發(fā)展、轉移等方面起著至關重要的作用，可作為肝癌診斷標志[14]?；蛟\斷技術，又稱分子診斷技術，是指以雙鏈DNA以及單鏈RNA為診斷材料，通過檢測體內基因的存在、丟失或表達異常，對疾病做出診斷的生物學方法。鎖核酸基因診斷技術能在許多疾病做出早期診斷，在肝癌的基因診斷中也具有重要的價值。Gougelet等[15]在體內實驗和肝癌患者中發(fā)現(xiàn)，miR-34a與β-catenin蛋白有相關性，即隨著β-連環(huán)蛋白過度活化，miR-34a的顯著表達，通過LNA抑制miR-34a后發(fā)現(xiàn)肝細胞的原代培養(yǎng)物增殖活性顯著下降，因此，miR-34a在具有β-連環(huán)蛋白基因突變的肝臟腫瘤中起到關鍵致癌作用，可作為早期的診斷指標。

大多數(shù)原發(fā)性肝癌與慢性乙型肝炎病毒感染有關，通過LNA基因診斷技術檢測乙肝病毒患者體內的基因差異表達，可在早期阻斷乙肝病毒的感染，進而避免發(fā)展為肝癌。Wang等[16]通過使用LNA探針修飾的microRNA芯片以檢測慢性乙型肝炎的miR-122表達，通過與健康患者對比，miR-122在慢性乙型肝炎患者的血清中含量顯著增高，由此可知，血清miR-122水平可能是慢性乙型肝炎患者早期診斷和恢復預后的潛在生物標志物。

4?LNA在肝癌的基因治療

基因治療技術，就是指通過基因轉移和調控等手段，將正?；蜣D入出現(xiàn)基因缺陷的患者體內，進而取代致病的異?；颍蛘咄ㄟ^基因編輯、調控、抑制等手段，針對異常的基因進行關閉，從而達到治療因基因缺陷、丟失等引起的先天性遺傳病、腫瘤、癌癥的目的。LNA在基因治療上具有更顯而易見的特點[17]：（1）LNA單體結合到寡核苷酸鏈中可提高解鏈溫度，每引入一個LNA單體，即可使解鏈溫度提高3℃，其與DNA、RNA互補成為雙鏈時提供很強的熱穩(wěn)定性;（2）抗酶解能力強，LNA具有特殊的結構而具有抗3脫氧核苷酸酶降解的能力，保護LNA結合物不受到降解;（3）LNA與DNA、RNA的結合可以對目的基因進行調控或者抑制，同時又可以被Rnase H識別從而對mRNA進行降解;（4）LNA在與DNA、RNA結合時，具有出色的錯配辨別力;（5）LNA本身水溶性較好，可以自由出入細胞，易被機體吸收;（6）LNA單體半衰期長，如引入一個LNA單體到寡核苷酸中，此寡核苷酸在體內的半衰期至少可提高10倍。因此，通過LNA技術結合分子生物學等方法治療基因異常所產生的問題，具有很好的應用前景。

4.1?LNA技術在肝癌治療的體外研究

體外研究實驗是指在體外使用從其通常的生物學環(huán)境中分離的生物體組分進行研究，例如微生物、細胞或生物分子。近年來，LNA在肝癌治療的體外研究報道較少，主要集中在mircoRNA研究和mRNA反義寡核苷酸上。

4.1.1?mircoRNA

LNA技術在mircoRNA檢測和功能性研究中，比其他寡核酸修飾的探針更具有優(yōu)勢。在設計并合成mircoRNA探針時，隨著LNA單體含量的增高，探針越穩(wěn)定，再添加30%左右即可達到最佳效果。一般來說，DNA探針在與mircoRNA結合時，其雙股構型會于A-type與B-type之間交替轉換，導致不穩(wěn)定;但LNA修飾的寡核苷酸探針能與mircoRNA配對結合后以更高的親和力形成穩(wěn)定的雙股結構，Tm值也因為LNA的加入而提高，使探針能夠有效且穩(wěn)定地對mircoRNA進行檢測和功能性分析。Najafi等[18]通過使用經過LNATM修飾的探針以抑制microRNA-23b在HepG2細胞內的表達，在與未經處理的細胞為參考對照，microRNA-23b的抑制在24小時后降低了HepG2細胞的侵襲行為，在72小時后作用更為明顯。

4.1.2?mRNA反義寡核苷酸

mRNA反義寡核苷酸主要的技術原理是與mRNA某一區(qū)段互補的核酸片斷，可以通過堿基互補原則結合于靶基因/mRNA上，從而封閉基因的表達。Javanbakht等[19]報道使用一種LNA修飾的寡核苷酸可以在較長的時間內有效降低HepG2.2.15細胞HBsAg和HBeAg的表達，平均有效濃度為1.19～1.66 mm。為了增強此寡核苷酸對肝細胞表達靶點的活性，通過連接到一個N-乙酰半乳糖胺簇以實現(xiàn)對肝細胞的優(yōu)先傳遞，該簇通過肝細胞特異性去唾液酸糖蛋白受體來引導攝取。值得注意的是，以較高劑量的N-乙酰半乳糖胺簇結合的寡核苷酸可導致HBsAg快速、持久地降低到低于定量檢測限。肖樹榮等[20]設計并合成能特異性封閉增殖相關基因 （C-myc） mRNA 第二外顯子翻譯起始區(qū)的反義寡核苷酸、硫代寡核苷酸和LNA，分別以陽離子半乳糖配體介導轉染 HepG2 細胞，在轉染第5天后，LNA組 C-myc mRNA相對表達量為0.335， 明顯低于對照組的1.014，C-myc 蛋白相對表達量為0.448 ，也明顯低于對照組的1.00，細胞凋亡比例為32%，顯著高于對照組，因此，針對 C-myc 第二外顯子翻譯起始區(qū)的LNA能有效抑制肝癌細胞增殖和促進細胞凋亡。

4.2?LNA在肝癌病毒治療的體內研究

Delgado等[21]研究了LNA對β-連環(huán)蛋白抑制的影響。結果表明，與對照組相比，在每48小時用LNA對小鼠腫瘤模型的β-連環(huán)蛋白進行10次治療后，觀察到肝細胞癌被完全治愈。在β-連環(huán)蛋白抑制后，其活性顯著降低，細胞增殖和細胞死亡增加明顯。說明LNA可以通過抑制肝細胞癌中β-連環(huán)蛋白以達到治療目的。Xiao等[22]觀察LNA在轉基因小鼠體內的抗病毒作用。結果發(fā)現(xiàn)，在治療后第3、5、7天，HBV DNA顯著抑制，并且在抗基因LNA組中，HBV S基因的相對mRNA表達為0.33，HBsAg陽性肝細胞的百分比為31%，與對照組中的這兩個指標對比差異有統(tǒng)計學意義。鄧益斌等[23]針對前C、C基因翻譯起始位點分別設計合成反義LNA 序列，通過帶正電荷的陽離子脂質體與帶負電荷的LNA 序列的靜電作用形成綴合物，并利用脂質體的親脂性將LNA 序列送入肝細胞，識別并結合到乙肝病毒前 C、C基因的mRNA 單鏈上，形成 LNA/mRNA 雜交雙鏈分子，以阻斷 mRNA 的翻譯，發(fā)揮抗病毒作用。研究結果表明，反義LNA給藥后，無論是單靶區(qū)組還是雙靶區(qū)組，乙肝病毒 DNA復制、乙肝病毒 C 基因mRNA 表達、乙肝病毒表面抗原及核心抗原合成等指標均明顯下降，且封閉雙基因位點對病毒復制的影響更為明顯。給藥后5天，雙靶區(qū)前C/C組的乙肝病毒DNA 復制和乙肝病毒表面抗原合成的平均下降率分別為53.72%和71.57%;乙肝病毒C基因 mRNA 的表達與乙肝病毒核心抗原合成均明顯下降。

5?不足與展望

隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展以及研究人員對LNA研究的不斷深入，LNA技術已廣泛應用于miRNA研究、SNP基因分型、mRNA反義寡核苷酸、等位基因特異性PCR、RNA干擾、DNAzymes、熒光偏振探針、分子信標、微陣列基因表達譜分析、基因修復與外顯子跳躍、拼接變異檢測、比較基因組雜交等領域，同時，LNA已經成功用于克服研究非常短的序列的困難，已經極大地改進，在許多情況下能夠特異性和靈敏地檢測非編碼核糖核酸及其他小核糖核酸分子，并且LNA寡核苷酸區(qū)分高度相似序列的獨特能力已在許多針對較長核糖核酸序列（如核糖核酸）的應用中得到進一步開發(fā)。此外，LNA已成功用于低豐度核酸和染色體脫氧核糖核酸的檢測，在諸多疾病中如胃癌、肺癌、乳腺癌等均有相關報道，但是目前針對肝癌的報道尚少，主要原因有以下幾點：（1）肝癌是一個多基因共同缺陷或異常引起的疾病，單基因缺陷或異常引發(fā)的肝癌很少，因此，LNA抑制單基因位點以治療肝癌的可行性尚需大量實驗證明。（2）LNA修飾的寡核苷酸在體內產生的肝毒性仍需降低以避免其他問題產生。（3）從倫理學角度來看，LNA基因治療應用到人體身上仍需長時間摸索。隨著基因編輯等新興技術的崛起，LNA技術研究的不斷成熟，相信會有更多更好的研究成果展現(xiàn)出來，從而為攻克肝癌做出貢獻。

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（收稿日期：2019-07-08?修回日期：2019-08-08）

（編輯：梁明佩）