曹繼芬 霍超 戶艷霞 王新中 徐發(fā)華 趙志堅
摘 ?要:為明確大理州煙草疫霉的群體結構和抗藥性水平,采用對峙培養(yǎng)法和含藥平板法研究了2013—2014年大理州煙區(qū)煙草疫霉的交配型和對甲霜靈敏感性。結果表明,測定的大理州煙區(qū)的150個煙草疫霉菌株全部為A2交配型,未發(fā)現(xiàn)A1或A0交配型;263個煙草疫霉菌株對甲霜靈的EC50值分布于1.0829~33.6227 mg/L,平均EC50為8.7599±0.0358 mg/L。大理州煙草疫霉菌株對甲霜靈的敏感性差異顯著,敏感、中抗和抗性菌株在群體中的比例分別為14.83%、52.85%和32.32%。大理州煙草疫霉在其侵染循環(huán)中主要進行無性繁殖,病原菌對甲霜靈的抗藥性水平較高,中抗和抗性菌株分布廣泛,亟需加快其他新型高效安全替代制劑的篩選和應用。
關鍵詞:煙草黑脛病;煙草疫霉;交配型;甲霜靈敏感性
中圖分類號:S435.72 ?????????文章編號:1007-5119(2019)06-0049-06 ?????DOI:10.13496/j.issn.1007-5119.2019.06.007
Mating Type and Metalaxyl Sensitivity ofPhytophthora nicotianae on Tobacco Black Shank Disease in Dali, Yunnan
CAO Jifen1, HUO Chao1, HU Yanxia2, WANG Xinzhong2, XU Fahua2, ZHAO Zhijian1*
(1. Industrial Crops Research Institute,Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming?650205, China; 2. Dali Branch of Yunnan Tobacco Company, Dali, Yunnan 671000, China)
Abstract:In order to investigate population structure and metalaxyl resistance level ofPhytophthora nicotianaeon tobacco black shank disease, the methods of confrontation culture and fungicide-amended plate were used to determine mating type and sensitivity to metalaxyl ofP. nicotianaeisolates collected from 2013 to 2014 in Dali, Yunnan Province. The results showed that all 150 isolates ofP. nicotianaefrom 12 counties were A2 mating type and A1 or A0 mating type was not identified. The EC50values of a total of 263 isolates to metalaxyl distributed between 1.0829 and 33.6227 mg/L, with an average EC50value of 8.7599±0.0358 mg/L. The ratio of sensitive, moderate resistant and resistant population was 14.83%, 52.85% and 32.32%, respectively, which means that sensitivity to metalaxyl ofP. nicotianaeisolates collected from Dali had significant differences. Our results suggest that the population structure of?P. nicotianaewas mainly maintained through asexual propagation in its life cycle in Dali. The pathogen had a high resistance level to metalaxyl and both moderate and resistant isolates were widely distributed. It is urgent to screen and make use of new high-efficiency and safe alternatives for black shank disease management.
Keywords:tobacco black shank disease;Phytophthora nicotianae; mating type; metalaxyl sensitivity
煙草疫霉(Phytophthora nicotianae)被認為是最具破壞性的土傳植物病原卵菌之一,目前已報道超過90科255屬的植物是其寄主。由于寄主和生態(tài)位的多樣性,煙草疫霉在全球引起的經濟損失通常難以估計[1]。由煙草疫霉引發(fā)的黑脛?。˙lack shank disease)是煙草生產中最主要的病害,在我國各煙區(qū)不僅分布廣泛,而且普遍發(fā)病率高[2]。系統(tǒng)了解煙草疫霉的群體特征及其動態(tài)規(guī)律,可以有效地服務于各煙區(qū)黑脛病的科學防控。云南省大理州是我國規(guī)模最大的特色優(yōu)質烤煙品種紅花大金元種植基地。由于紅花大金元是感病品種,且煙苗移栽后當?shù)責熮r常采用漫灌的方式進行灌溉,高溫高濕條件下非常適宜于煙草黑脛病的傳播和流行。大理州煙苗移栽后5~7 d即有黑脛病發(fā)生,田間調查發(fā)病率為8.0%~21.5%,嚴重煙田病株率在30.2%~80.0%,甚至絕產,經濟損失十分嚴重[3-4]。因此,監(jiān)測病原菌特征,科學地開展黑脛病防控對煙葉綠色生產、提質增效有重要意義。
有性生殖過程被認為是增強病原菌遺傳多樣性和致病性的主要原因。煙草疫霉是異宗配合的卵菌,需要A1和A2兩種相反交配型共存才能進行有性生殖產生卵孢子。A1和A2交配型的相對比例可以揭示煙草疫霉在自然田間條件下發(fā)生的有性重組水平以及卵孢子產生的潛力。已報道的煙草疫霉存在A1、A2和A0三種交配型,不同交配型在自然界中的相對頻率通常具有偏向性[5]。盡管種植抗病品種是防控黑脛病最經濟有效的措施[6],但由于產業(yè)需求和高品質抗病品種匱乏等原因,目前生產上對煙草黑脛病的防控仍然以化學防治為主。甲霜靈是苯酰胺類殺菌劑,特異性地抑制病原菌mRNA合成,廣泛地應用于霜霉病、疫霉病等各種卵菌病害的防治。由于其作用位點單一,病原菌易產生抗藥性,從而導致防治效果明顯下降[7]。近年來對我國一些煙區(qū)的監(jiān)測結果顯示,煙草疫霉在山東、貴州、四川、河南和重慶等省市對甲霜靈等殺菌劑已經存在不同程度的抗藥性[8-9]。
大理州煙區(qū)從上世紀90年代初開始使用甲霜靈進行煙草黑脛病防治,但目前對當?shù)責煵菀呙沟募姿`抗藥性風險以及有性生殖在煙草疫霉群體遺傳結構中的作用尚不清楚。本研究監(jiān)測了大理州煙草疫霉的交配型組成以及甲霜靈抗藥性水平,研究結果有助于正確地了解當?shù)責煵菀呙褂行陨吃诓≡z傳多樣性和致病性分化中的作用以及抗藥性程度和分布,可為大理州煙草黑脛病防治化學殺菌劑的選擇和綠色防控提供科學依據(jù)。
1 ?材料與方法
1.1 ?試驗材料
1.1.1 ?供試菌株??2013—2014年從云南省大理州12個縣(市)的紅花大金元種植區(qū)采集典型黑脛病病株,用加有抗生素的黑麥A培養(yǎng)基分離純化獲得煙草疫霉菌株263個。
1.1.2 ?參考菌株??煙草疫霉已知A1交配型菌株991和A2交配型菌株38606分別由南京農業(yè)大學卵菌與真菌分子生物學實驗室和荷蘭瓦赫寧根大學植物病理實驗室提供。
1.1.3 ?供試甲霜靈??供試96%甲霜靈原藥由北京明德立達農業(yè)科技有限公司提供。
1.1.4 ?儀器設備??培養(yǎng)箱為LRH-250F生化培養(yǎng)箱,超凈工作臺為ZHJH-C1112B型超凈工作臺。
1.2 ?試驗方法
1.2.1 ?交配型測定??交配型測定在10% V8培養(yǎng)基上進行。選取分離自大理州12個市縣紅花大金元不同種植煙區(qū)的150個供試菌株在V8平板上25 ℃黑暗培養(yǎng)7~10 d,用手術刀切取5 mm×20 mm菌絲條,待測菌株分別與A1和A2交配型參考菌株間隔20 mm進行對峙培養(yǎng),25 ℃黑暗培養(yǎng)2周后,切取有對峙邊界的菌塊,顯微觀察是否有卵孢子形成。僅與A2交配型菌株配對產生卵孢子的定義為A1交配型,僅與A1交配型菌株配對產生卵孢子的為A2交配型,與A1和A2交配型菌株配對均不產生卵孢子的為A0交配型。
1.2.2 ?煙草疫霉對甲霜靈敏感基線的確定??96%甲霜靈原藥用二甲基亞砜(DMSO,sigma)溶解配制成濃度為10 mg/mL的貯液,然后分別配制含甲霜靈0.0、1.0、2.0、3.0、5.0、10、15、20、30、50 mg/L系列濃度梯度的V8平板。選取分離自云南不同煙區(qū)的10個煙草疫霉菌株在V8平板上25 ℃黑暗培養(yǎng)7~10 d后用于后續(xù)的試驗。用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣切取菌塊,菌絲面向下分別接到含不同濃度甲霜靈的V8平板上,每個處理重復3次,25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d后用“十字交叉法”測量各處理菌落生長直徑,根據(jù)菌落直徑計算抑制率(%) =100×[(對照菌落直徑-5)-(處理菌落直徑-5)]/(對照菌落直徑-5)。毒力回歸曲線方程和EC50值計算參照戶艷霞等[4]方法進行。
1.2.3 ?煙草疫霉對甲霜靈的敏感性測定??根據(jù)煙草疫霉對甲霜靈的敏感基線值,選取0.0、3.0、5.0、
10.0及20.0 mg/L等5個濃度梯度,采用含藥平板法對259個大理州煙草疫霉菌株甲霜靈的EC50值進行測定,明確大理州煙草疫霉對甲霜靈的抗藥性水平。
2 ?結 ?果
2.1 ?大理州煙草疫霉的交配型組成
從2013—2014年大理州12個市縣烤煙產區(qū)分離的煙草疫霉菌株中隨機挑選了150個菌株進行交配型測定。結果顯示,測定的150個菌株全部為A2交配型菌株,沒有檢測到A1交配型或者A0交配型,表明大理州煙草疫霉主要進行無性繁殖,有性生殖產生卵孢子在大理州煙草疫霉致病性和遺傳多樣性分化中的作用非常有限。
2.2 ?煙草疫霉對甲霜靈的敏感基線
挑取的10個云南煙草疫霉對甲霜靈的EC50值
范圍在1.9483~17.3122 mg/L,最不敏感菌株Pn1380與最敏感菌株Pn119對甲霜靈敏感性相差約8.9倍(表2),平均EC50值為7.5183±0.0372 mg/L,表明云南煙草疫霉菌株對甲霜靈已有明顯的抗性差異,甲霜靈對云南的煙草疫霉仍有一定的抑制作用,但已有抗藥性菌株的產生,存在抗藥性風險。根據(jù)測定的甲霜靈敏感性結果,將測定菌株的EC50平均值7.5183 mg/L作為云南煙草疫霉菌株對甲霜靈的敏感基線。
2.3 ?大理州煙草疫霉對甲霜靈的敏感性
2013—2014年大理州不同煙區(qū)263個煙草疫霉菌株對甲霜靈的EC50值分布于1.0829~33.6227 mg/L,最不敏感菌株是最敏感菌株的31.04倍,平均EC50為8.7599±0.0358 mg/L,供試的263個煙草疫霉菌株對甲霜靈的EC50值分布如圖1所示。將EC50<4.0 mg/L的菌株劃歸為敏感菌株,4.0 mg/L≤EC50<10.0 mg/L之間的為中度抗性菌株,EC50≥10.0 mg/L為抗性菌株。大理州不同紅花大金元產區(qū)的煙草疫霉菌株對甲霜靈的敏感性有顯著差異,敏感菌株39個占14.85%,中度抗性菌株139個占52.85%,抗性菌株85個占32.32%。其中大理、劍川、彌渡、祥云和云龍有敏感菌株分布,而抗性菌株主要分布在甲霜靈使用較多的大理、劍川、彌渡和洱源,中抗菌株為優(yōu)勢群體,在大理州各紅花大金元產區(qū)均有分布。研究結果表明,由于長期使用甲霜靈錳鋅防控煙草黑脛病,大理州各煙區(qū)煙草疫霉對甲霜靈的敏感性已經顯著下降,中抗和抗性菌株廣泛分布,甚至出現(xiàn)了高抗菌株,防控效果明顯降低。
3 ?討 ?論
異宗配合的疫霉菌通過親和性的A1和A2兩種交配型進行有性生殖,產生具有多層厚壁的卵孢子,可幫助病原菌在不適宜環(huán)境長期存活、順利越冬,增大病原菌的初侵染源。而且有性生殖的過程,將產生具有更多遺傳變異的重組后代,導致新的致病小種、強毒力或抗藥性后代群體的產生,從而提高病原菌對寄主的致病性和寄生適合度,對抗病育種和病害防控造成嚴重的威脅[5]。異宗配合疫霉菌A1和A2交配型分布對于確定田間病原菌群體的遺傳變異和進化至關重要。國內外對不同寄主來源的煙草疫霉交配型研究發(fā)現(xiàn),已知煙草疫霉存在A1、A2和A0三種交配型。多年前HO等[10]、王革等[11]曾報道煙草疫霉交配型在我國的分布規(guī)律總體呈均等趨勢,華東和西南地區(qū)以A2交配型為主,華北和華南以A1交配型為主。馬國勝等[12]報道安徽省煙草疫霉以A2交配型占絕對優(yōu)勢,且在全省各煙區(qū)都有分布;其次為A0交配型,主要分布在安徽省固鎮(zhèn)、鳳陽等江淮老煙區(qū);沒有檢測到A1交配型。孫常偉[13]對重慶市煙草疫霉的研究結果與安徽省一致,A2交配型為主,其次為A0交配型,未檢測到其他交配型。彭麗娟等[14]報道貴州省煙草疫霉只存在A2交配型。CUI等[15]報道了2013—2014年從河南省獲得的32株煙草疫霉中31株為A2交配型,1株為A0,沒有檢測到A1交配型菌株。PARKUNAN等[16]報道了2006—2008年從美國弗吉尼亞州分離獲得的217株煙草疫霉中A2交配型菌株占94%,A1交配型占4%。該結果表明有性生殖不太可能是弗吉尼亞州煙草疫霉增強遺傳多樣性的主要機制。本研究測定的云南省大理州150個煙草疫霉菌株均是A2交配型,沒有發(fā)現(xiàn)A1或A0交配型,表明大理州煙草疫霉主要進行無性繁殖,通過寄主殘體或厚垣孢子成為初侵染源,有性生殖產生卵孢子在大理州煙草疫霉致病性和遺傳多樣性分化中的作用非常有限,大理州煙草疫霉的遺傳多樣性可能較低。本文交配型的研究結果也進一步證實,自然條件的煙草疫霉生活史中,卵孢子在引起黑脛病的作用方面可能并不如以前認為的那樣重要,并且有性生殖產生新毒力后代出現(xiàn)的威脅可能被高估。最近,基于煙草疫霉基因組分析的微衛(wèi)星(SSR)標記被成功開發(fā)用于群體遺傳學分析[17],我們將對大理州煙草疫霉的遺傳多樣性進行研究,以便進一步為前述的無性繁殖推測提供遺傳學證據(jù)。
甲霜靈是1977年由瑞士Ciba-Geigy公司推出的苯酰胺類殺菌劑,使卵菌引起的植物病害的化學防治水平得到劃時代的提高。但是甲霜靈對病原菌的作用主要是抑制病原菌mRNA的合成,作用位點單一,長期使用很容易使病原菌發(fā)生突變,產生抗藥性[7]。美國早在1985年SHEW[18]報道了種植煙草的田間連續(xù)幾年施用甲霜靈,煙草疫霉群體對甲霜靈的敏感性下降,平均EC50值逐年增大。1991年FERRIN等[19]也報道從迎春花上分離到2株對甲霜靈產生自然抗性的煙草疫霉菌株,其EC50值分別高達742.4和717.4 mg/L。PARKUNAN等[16]報道2006—2007年美國弗吉尼亞州98%的煙草疫霉對5 mg/L的精甲霜靈敏感,2%的菌株中度敏感。王革等[20]最早檢測了95株云南煙草疫霉菌株對甲霜靈的敏感性,其EC50值平均僅為0.0325 mg/L;袁宗勝等[8]報道山東、安徽等地分離的21個煙草疫霉菌株對甲霜靈的EC50值平均為0.2132 mg/L。李梅云等[21]檢測了云南省煙草疫霉菌株對甲霜靈的抗藥性,34個菌株的EC50值平均也僅為0.0148 mg/L。許學明等[22]測定了來自云南、貴州、山東的38個煙草疫霉菌株EC50值平均為0.2991±0.0843 mg/L。最近報道顯示,廣西煙草疫霉菌株對甲霜靈仍然敏感,EC50值在0.0691~1.0243 mg/L;而貴州省則檢測到甲霜靈抗性菌株,EC50值分布范圍為0.4192~20.4861 mg/L,平均EC50值為3.3789 mg/L,最低抗藥性水平與最高抗藥性水平相差48.87倍[23-24]??梢钥闯觯S著甲霜靈使用年限增長,我國各煙區(qū)煙草疫霉菌株對甲霜靈的抗藥性水平不斷增高。本研究測定了2013—2014年大理州不同煙區(qū)263個煙草疫霉菌株對甲霜靈的敏感性,其EC50值分布于1.0829~33.6227 mg/L,最不敏感菌株是最敏感菌株的31.04倍,平均EC50為8.7599±0.0358 mg/L,顯著高于國內其他煙區(qū),比王革等[20]最早檢測的煙草疫霉抗藥性水平增長了269.53倍。這說明在長期使用甲霜靈錳鋅進行黑脛病防治的選擇壓力下,大理州各煙區(qū)煙草疫霉敏感性群體比例明顯下降,中抗和抗性菌株在群體中的比例增高,且抗性菌株在大理州的分布亦有逐漸擴大的趨勢,甲霜靈失效的風險較大。在今后煙草黑脛病的防控中應采用不同殺菌劑合理輪換施用,以避免長期單一地使用苯酰胺類殺菌劑對煙草疫霉造成的選擇壓力,烤煙生產中應加快其他新型高效安全替代殺菌劑的篩選和應用。
本研究首次從交配型、甲霜靈敏感性方面對大理州煙草疫霉的群體結構進行了分析,結果表明無性繁殖是大理州煙草疫霉維持群體遺傳多樣性和致病性的主要形式。大理州煙草疫霉已經對甲霜靈有較高水平的抗性,中抗和抗性菌株分布廣泛。這些結果可為大理州和其他同類煙區(qū)煙草黑脛病的科學防控和抗病新品種培育提供理論指導。
4 ?結 ?論
大理州煙草疫霉群體結構單一,僅存在A2交配型,沒有檢測到A1和A0交配型,無性繁殖是該區(qū)域煙草疫霉維持群體遺傳多樣性和致病性的主要方式,有性生殖在大理州煙草疫霉新毒力類型和遺傳分化中的作用非常有限;大理州煙草疫霉對甲霜靈的EC50值分布于1.0829~33.6227 mg/L,平均為8.7599±0.0358 mg/L,以中抗菌株為優(yōu)勢群體,分布廣泛;大理州煙草疫霉對甲霜靈已產生明顯的抗藥性,亟需開展抗藥性治理和篩選新型高效安全的替代殺菌劑或生物制劑用于黑脛病的綠色防控。
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