除草劑不同耐性水平煙草品種葉面微生物研究

朱曉明 時焦 張保全 吳晶晶 劉朝營 陳強 劉洋

摘 ?要：為探討玉米田除草劑不同耐性水平煙草品種葉面可培養(yǎng)微生物的數(shù)量、耐藥性及其與煙草耐藥性的關(guān)系，以對玉米田除草劑（莠去津和硝磺草酮）高度耐藥、中度耐藥和高度敏感煙草品種為試驗材料，采用稀釋平板涂布法測定真菌、細(xì)菌和放線菌數(shù)量;利用含毒介質(zhì)法篩選抗除草劑菌株，并對其16S rDNA序列進行測定與分析。結(jié)果顯示，3種不同耐藥性水平品種間葉面可培養(yǎng)真菌、細(xì)菌和放線菌總量存在顯著差異（p<0.05），群落結(jié)構(gòu)為細(xì)菌>放線菌>真菌。細(xì)菌和放線菌數(shù)量高度耐藥性品種>中度耐藥性品種>高度敏感性品種;真菌數(shù)量高度敏感性品種>中度耐藥性品種>高度耐藥性品種。從高耐藥性煙草品種葉面篩選出5株對2種除草劑具有抗性的菌株，其16S rDNA序列比對均屬芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌。耐藥性煙草品種葉面具有大量抗藥性菌株可能對煙草耐藥性起到了積極作用。

關(guān)鍵詞：煙草;葉面微生物;除草劑;耐藥性

中圖分類號：S435.72 ?????????文章編號：1007-5119（2019）06-0060-06 ?????DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.06.009

Study on Foliar Microbes of Tobacco Varieties with Different Tolerant Levels to Herbicides

ZHU Xiaoming¹， SHI Jiao^1*， ZHANG Baoquan²， WU Jingjing²， LIU Chaoying²， CHEN Qiang²， LIU Yang³

（1. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China; 2. China Tobacco Zhejiang Industrial Co.， Ltd， Hangzhou 310009， China; 3. Linqu Branch of Shandong Tobacco Corporation， Linqu， Shandong 262600， China）

Abstract：In order to investigate the quantity and herbicide tolerance of cultivatable microbes on leaves of tobacco varieties which have different tolerant levels to corn herbicides （atrazine and mesotrione）， 12 tobacco varieties with different tolerant levels to two corn herbicides were cultivated and used as experimental materials. The leaf samples from the main growing stages including seedling stage， fast-growing stage and maturity stage were collected. The second leaf from the top was used for all the treatments. The plate counting method was used to study the number of cultured fungi， bacteria and actinomycetes. The toxic medium method was used to screen resistant bacterial strains to two corn herbicides. The 16S rDNA of obtained resistant bacterial strains in this experiment were sequenced and analyzed. The experimental results showed that the total numbers of cultured microbes including fungi， bacteria and actinomycetes were significantly different among different tolerant levels of tobacco （p<0.05）. The microbial community composition on the leaves of tobacco varieties with different tolerant levels indicated that bacteria > actinomycetes > fungi. The numbers of bacteria and actinomycetes in the order from high to low was highly tolerant varieties， moderately tolerant varieties and highly sensitive varieties. The numbers of fungi from high to low： highly sensitive varieties > moderately tolerant varieties > highly tolerant varieties. Five bacterial strains highly resistant to the two corn herbicides were identified from the dominant bacteria strains isolated from highly tolerant varieties. The 16S rDNA sequences of the five highly resistant strains were compared and analyzed. The analysis results showed that the five strains all belong to?Bacillusbacteria. There were large numbers of resistant microbes on tobacco varieties highly tolerant to the two corn herbicides. Therefore it is possible that resistant microbes play an important role in tobacco tolerance to herbicides.

Keywords： tobacco; foliar microbes; herbicide; tolerance

研究表明，植物葉面微生物群落組成復(fù)雜，不僅存在能引起植物病害的微生物，還存在許多對植物有益的微生物，它們有的能促進植物生長，有的能增強植物抗性，還有的能降解環(huán)境中的污染物^[1-3]。近年來應(yīng)用微生物降解環(huán)境中農(nóng)藥的研究空前活躍^[4-6]，并在降解擬除蟲菊酯類、二苯醚類和有機磷類農(nóng)藥方面取得了較好的進展^[7-9]。目前，微生物防治作物藥害的研究主要集中在應(yīng)用微生物降解土壤中的殘留農(nóng)藥^[10-12]，以減輕其對后茬作物的藥害，而應(yīng)用微生物保護作物葉片免受外來農(nóng)藥的為害尚未見報道。北方旱作煙區(qū)，小麥?zhǔn)斋@后短時間集中播種夏玉米，夏玉米播種后普遍噴施除草劑，有些除草劑漂移會引起鄰作煙田發(fā)生藥害^[13]，這一問題已成為阻礙煙草生產(chǎn)的新問題^[14]。葉面微生物作為煙葉與外界環(huán)境的重要介導(dǎo)，可能在緩解煙草除草劑漂移藥害這一過程中發(fā)揮作用。

先前的研究發(fā)現(xiàn)莠去津和硝磺草酮是對煙草比較安全的2種玉米田常用除草劑^[13]，同時發(fā)現(xiàn)不同煙草種質(zhì)對玉米田除草劑的耐藥性不同^[15]，在此基礎(chǔ)上，本試驗選擇了12個對莠去津和硝磺草酮不同耐性水平的煙草品種作為供試材料，首先探明不同耐藥性水平煙草品種葉面微生物差異，同時對分離到的細(xì)菌優(yōu)勢菌株進行抗除草劑篩選，并對篩選出的抗除草劑菌株進行16S rDNA分析與鑒定，以期為應(yīng)用微生物緩解玉米田除草劑漂移對煙草的藥害提供理論支持和技術(shù)探索。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗設(shè)計

2018年2月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所的隔離溫室中，將3種耐性水平煙草品種^[15]（高度耐藥性品種：Beihart1000-1、Coker371-gold、Coker176、南江三號;中度耐藥性品種：紅花大金元、革新三號、小黃金1025、NC55;高度敏感性品種：中煙100、云煙87、云煙85、NC89）按照常規(guī)育苗方法育苗。所用煙草品種種子均由國家煙草種質(zhì)資源中期庫提供。育苗用具和土壤均嚴(yán)格消毒，煙苗于3～4片真葉期假植，待長至5～6片真葉時移栽至花盆中，并置于溫室中培養(yǎng)，每個品種種植40盆。

分別于煙草苗期（第7片真葉期）、旺長期（移栽后35 d）和成熟期（移栽后70 d）取煙葉樣品，每次每個品種取8株煙，苗期和旺長期取樣葉位為頂部向下數(shù)第2片新展開葉片，成熟期取樣葉位為頂部向下數(shù)第2片葉片，采集后煙葉裝紙袋中，并編號。取樣時佩戴手套以免污染，樣品及時帶回實驗室保存。為減少雨水和日照對微生物的影響，均選擇前2 d未下雨的上午取樣。

試驗用除草劑38%莠去津SC為江蘇綠利來股份有限公司生產(chǎn)，15%硝磺草酮SC為中山化工有限公司生產(chǎn)。

1.2 ?微生物數(shù)量測定

采用稀釋平板涂布法分離培養(yǎng)微生物：孟加拉紅培養(yǎng)基分離真菌，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基分離細(xì)菌，改良高氏一號培養(yǎng)基分離放線菌^[16]。

葉面微生物懸浮液的制備：將樣品表面的雜物用灼燒滅菌的鑷子去掉，避免用手接觸樣品表面。用直徑1.5 cm滅菌打孔器取葉圓片，每葉取5片，共取40片。將40片葉圓片放入滅菌三角瓶中，根據(jù)40片葉圓片的面積，加入無菌水，無菌水的體積（mL）為葉面積（cm²）的一半。將三角瓶置于200 r/min的振蕩器上振蕩30 min，然后用無菌水稀釋懸浮液，依次按10倍梯度將原液稀釋至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4倍。

葉面微生物接種與培養(yǎng)：吸取100 μL不同濃度的葉面微生物懸浮液接種到培養(yǎng)皿中，每種菌分別接種2個濃度的葉面微生物懸浮液，其中真菌為1×10^-1和1×10^-2，細(xì)菌為1×10^-2和1×10^-3，放線菌為1×10^-3和1×10^-4，每個濃度重復(fù)3次。接種后用無菌玻璃棒涂布均勻，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。真菌于28 ℃培養(yǎng)3～4 d計數(shù)，細(xì)菌于37 ℃培養(yǎng)2～3 d計數(shù)，放線菌于28 ℃培養(yǎng)5～7 d計數(shù)^[16]。用下列公式計算微生物數(shù)量。

微生物數(shù)量（cfu/cm²）^[17]=

1.3 ?抗除草劑細(xì)菌的篩選

采用含毒介質(zhì)法篩選抗除草劑細(xì)菌：首先用0.22 μm的細(xì)菌過濾器過濾除草劑，然后配制Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ?3個除草劑濃度的培養(yǎng)基，即在滅菌的250 mL LB培養(yǎng)基中分別加入1 mL （Ⅰ）、0.5 mL （Ⅱ）和0.25 mL （Ⅲ）滅菌的除草劑，混勻、制板備用，并以加入1 mL無菌水的LB培養(yǎng)基為對照，每種除草劑單獨使用。將待篩選菌株接種于裝有NB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，搖瓶容量250 mL，裝液量50 mL，于200 r/min、28 ℃下振蕩培養(yǎng)12 h，使用分光光度計測定各菌懸液OD值，并將各菌懸液OD值調(diào)至0.1，再按十倍稀釋法將濃度稀釋至10³cfu/mL，吸取各菌懸液100 μL分別接種到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ?3種LB平板上，采用平板涂布法涂勻。然后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并記錄菌株生長情況。根據(jù)各菌株在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ?3個除草劑濃度平板上細(xì)菌菌落總數(shù)與對照的比值i將參試細(xì)菌菌株劃分為高度敏感、中度抗藥和高度抗藥3種，i≤0.25的菌株為高度敏感，0.25<i≤0.75的菌株為中度抗藥，i>0.75的菌株為高度抗藥。

1.4 ?抗除草劑細(xì)菌的鑒定

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（全式金），提取篩選獲得的5株抗除草劑菌株的DNA，以提取的DNA為模板，利用PCR對16S rDNA序列進行擴增，PCR選用細(xì)菌通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反應(yīng)體系總體積50 μL，包括引物27F /1492R各1 μL，模板4 μL，25 μL dNTPs Mix，ddH₂O 19 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃?3 min;94 ℃?45 s，54 ℃?45 s，72 ℃?1.5 min，35個循環(huán);72 ℃?10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由上海派森諾生物科技有限公司測序。雙向測通拼接后，在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST相似序列檢索，選取相似性較高菌株的模式菌株為參比對象，采用MEGA 6.0軟件最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。用Bootstrap（自展值1000）進行檢驗。

1.5 ?統(tǒng)計分析

利用DPS 3.01統(tǒng)計分析軟件，采用Duncan新復(fù)極差法進行試驗數(shù)據(jù)的差異顯著性分析。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?不同耐藥性品種葉面可培養(yǎng)微生物數(shù)量

2.1.1 ?不同生育期葉面可培養(yǎng)真菌數(shù)量??表1數(shù)據(jù)表明，3種不同耐藥性水平煙草品種葉面可培養(yǎng)真菌總量存在顯著差異（p<0.05），高度敏感性品種總量最多為22.38 cfu/cm²，其次是中度耐藥性品種為16.88 cfu/cm²，高度耐藥性品種最少為8.88 cfu/cm²。高度耐藥性品種苗期和旺長期分別為5.19 cfu/cm²和2.38 cfu/cm²，均顯著低于中度耐藥性和高度敏感性品種，成熟期顯著低于中度耐藥性品種。3種耐藥性水平品種真菌數(shù)量從苗期到旺長期再到成熟期均呈遞減趨勢，其中，高度耐藥性品種降幅較小。

2.1.2 ?不同生育期葉面可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量??表2數(shù)據(jù)表明，不同耐藥性水平煙草品種葉面可培養(yǎng)細(xì)菌總量存在顯著差異（p<0.05），高度耐藥性品種總量最多為1137.50 cfu/cm²，其次是中度耐藥性品種為1132.50 cfu/cm²，高度敏感性品種最少為1126.08 cfu/cm²。高度耐藥性品種苗期為20.00 cfu/cm²，顯著低于中度耐藥性和高度敏感性品種;旺長期和成熟期均位于中度耐藥性和高度敏感性品種之間，分別為571.88和545.63 cfu/cm²。中度耐藥性品種苗期為21.88 cfu/cm²，顯著高于高度耐藥性和敏感性

品種;旺長期中度耐藥性品種是3個抗性水平品種中最高的為591.88 cfu/cm²。

高度、中度耐藥性品種細(xì)菌數(shù)量從苗期到旺長期再到成熟期呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，而高度敏感性品種呈現(xiàn)持續(xù)增加趨勢。在實際生產(chǎn)中，鄰作夏玉米田播種后出苗前噴施除草劑時，多數(shù)煙田正處在旺長期，本試驗中，高度、中度耐藥性品種的細(xì)菌數(shù)量在旺長期達到頂峰，且顯著高于高度敏感性品種，推測細(xì)菌數(shù)量可能與品種耐藥性存在一定關(guān)系。

2.1.3 ?不同生育期葉面可培養(yǎng)放線菌數(shù)量??表3數(shù)據(jù)表明，不同耐藥性品種葉面可培養(yǎng)放線菌數(shù)量存在顯著差異（p<0.05），高度耐藥性品種總量最多為18.38 cfu/cm²，其次是中度耐藥性品種為15.88 cfu/cm²，高度敏感性品種最少為8.69 cfu/cm²。高度耐藥性品種和中度耐藥性品種從苗期和旺長期放線菌數(shù)量大幅增加，旺長期達到峰值。成熟期3種耐藥性品種放線菌數(shù)量均呈下降趨勢，但高度耐藥性品種降幅較小，放線菌數(shù)量為7.56 cfu/cm²。推測放線菌數(shù)量可能與品種耐藥性存在一定關(guān)系。

2.2 ?抗除草劑細(xì)菌菌株篩選

參試的18株細(xì)菌菌株在含不同濃度莠去津和硝磺草酮培養(yǎng)基上的生長情況劃分為3種類型，即高度敏感、中度抗藥和高度抗藥。其中，4株（GYX1、GYX2、GYX3、GYX13）為高度敏感;9株（GYX4、GYX5、GYX8、GYX9、GYX10、GYX11、GYX12、GYX15、GYX18）為中度抗藥;5株（GYX6、GYX7、GYX14、GYX16、GYX17）高度抗藥，表現(xiàn)出對2種除草劑的抗性（表4）。

2.3 ?抗除草劑細(xì)菌菌株鑒定

系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果表明（圖1），菌株GYX6、GYX7、GYX14、GYX16、GYX17的16S rDNA序列與其對比的芽孢桿菌屬同源相似度在100%，這表明篩選出的5株抗除草劑細(xì)菌菌株都屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌。其中，GYX6與堅強芽孢桿菌（Bacillus firmus），GYX7與土地芽孢桿菌（Bacillus humi），GYX16與地下芽孢桿菌（Bacillus subterraneus）的16S rDNA序列同源性為100%，且聚為一簇。菌株GYX14和GYX17 16S rDNA序列同源相似度較高，尚不能區(qū)分兩者是否為同一個種，雖然16S rDNA序列廣泛應(yīng)用于細(xì)菌鑒定或構(gòu)建細(xì)菌的系統(tǒng)進化關(guān)系，但在親緣關(guān)系很近的分類類群間，會因序列間的相似度太高而難以區(qū)別^[18-19]。

3 ?討 ?論

除草劑不同耐性水平煙草品種不同生育期葉面可培養(yǎng)微生物數(shù)量呈現(xiàn)出不同的變化，這與NORMANDER等^[20]對大麥的研究結(jié)果，以及王海波等^[21]對抗感黑脛病菌煙草品種根際微生物的研究結(jié)果趨于一致。除草劑不同耐性水平煙草品種葉面三大微生物群落結(jié)構(gòu)為細(xì)菌>放線菌>真菌，這一結(jié)果與植煙土壤中不同時期和不同土層中細(xì)菌>放線菌>真菌的研究結(jié)果相似^[22]。很可能在微生態(tài)環(huán)境中三大微生物的群落結(jié)構(gòu)都趨于一致，有待進一步研究。

有些放線菌不僅可以抑制作物病害，而且可以促進作物生長與改善作物品質(zhì)^[23]。因為放線菌具有復(fù)雜的次級代謝系統(tǒng)，能產(chǎn)生諸多結(jié)構(gòu)新穎、生物活性顯著的代謝產(chǎn)物，通常放線菌數(shù)量增加會改善植物微生態(tài)環(huán)境^[24]。本研究發(fā)現(xiàn)在對莠去津和硝磺草酮2種玉米田除草劑表現(xiàn)出不同耐性水平的煙草品種中，高度和中度耐藥性煙草品種葉面可培養(yǎng)放線菌數(shù)量從苗期到旺長期激增，達到峰值，高度耐藥性品種成熟期放線菌數(shù)量也很高。生產(chǎn)中煙田處在旺長期和開花現(xiàn)蕾期時，恰逢鄰作夏玉米田噴施除草劑，因此旺長期放線菌數(shù)量達到峰值，可能存在對煙草品種的耐藥性水平起到了積極作用的菌株，這有待進一步研究。

另外，旺長期細(xì)菌數(shù)量顯著增多，成為葉面優(yōu)勢微生物。在細(xì)菌數(shù)量占據(jù)優(yōu)勢的旺長期，高度耐藥性品種細(xì)菌數(shù)量（571.88 cfu/cm²）和中度耐藥性品種細(xì)菌數(shù)量（591.88 cfu/cm²）均顯著高于高度敏感性品種（518.13 cfu/cm²）（p<0.05），由此推測高度耐藥性品種可能存在具有緩解藥害作用的優(yōu)勢細(xì)菌菌株，能夠減輕除草劑漂移引起的煙草藥害。因而進一步對高度耐藥性品種葉面分離得到的18株優(yōu)勢細(xì)菌菌株進行了抗除草劑篩選，結(jié)果得到5株細(xì)菌在含2種玉米田除草劑的LB培養(yǎng)基上能夠正常生長，對2種玉米田除草劑表現(xiàn)出較好的抗性，5株抗除草劑細(xì)菌菌株都屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌，說明芽孢桿菌屬細(xì)菌是抗除草劑煙草品種葉面優(yōu)勢菌種，與張鴿等^[25]對四個國家雪茄外包皮煙葉表面細(xì)菌分離的結(jié)果相似。這對未來探討利用抗除草劑細(xì)菌緩解除草劑漂移對鄰田作物造成的藥害，以及為煙草乃至作物非侵染性病害的預(yù)防奠定了基礎(chǔ)。

4 ?結(jié) ?論

對2種玉米田除草劑莠去津和硝磺草酮具有不同耐性水平煙草品種，不同生育期葉面可培養(yǎng)微生物數(shù)量存在顯著差異（p<0.05），群落結(jié)構(gòu)為細(xì)菌>放線菌>真菌。高度耐藥性煙草品種葉面分離到5株抗藥細(xì)菌菌株，均屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌，對2種玉米田除草劑表現(xiàn)出較高抗性。這些抗藥菌株可能對煙草品種的抗藥性起到了積極的作用。

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