轉(zhuǎn)ｃｒｙ１Ａｂ/ｃｒｙ１Ａｃ基因水稻ＴＴ５１－１中外源基因多重ＰＣＲ檢測(cè)方法

查中萍 萬丙良 殷得所 杜雪樹 李進(jìn)波 夏明元 戚華雄 李圓夢(mèng)

摘要：針對(duì)轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因抗蟲水稻（Oryza sativa L.）TT51-1及其回交后代中外源基因的檢測(cè)建立了一種三引物多重PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表明，三引物PCR體系可以準(zhǔn)確區(qū)分cry1Ab/cry1Ac基因純合、雜合和陰性三種基因型，純合體中只擴(kuò)增出一條298 bp片段，陰性材料中只擴(kuò)增出一條787 bp片段，雜合體中同時(shí)擴(kuò)增出298 bp片段和787 bp片段。該體系的建立為利用TT51-1進(jìn)行抗螟蟲水稻分子育種提供了一個(gè)簡(jiǎn)便有效的基因鑒定技術(shù)。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因水稻;多重PCR;cry1Ab/cry1Ac;TT51-1;華恢1號(hào)

中圖分類號(hào)：S511 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）24-0232-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.24.056 ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

A tri-primer multiplex PCR method for the detection of exogenous genes in the cry1Ab/cry1Ac transgenic rice TT51-1

ZHA Zhong-ping1，WAN Bing-liang1，YIN De-suo1，DU Xue-shu1，LI Jin-bo1，

XIA Ming-yuan1，QI Hua-xiong1，LI Yuan-meng2

（1.Food Crop Research Institute，Hubei Academy of Agricultural Science/Hubei Key Laboratory of Crop Germplasm and Genetic Improvement，Wuhan 430064，China;2.College of Agriculture，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China）

Abstract： A tri-primer multiplex PCR method was established for the detection of cry1Ab/cry1Ac gene in the cry1Ab/cry1Ac transgenic rice TT51-1 and its backcross progenies of Huahui No.1. According to the foreign gene sequence inserted in TT51-1 and the rice genome sequence on the left and right sides of the insertion site， three PCR primers P1， P2 and P3 were designed. The results showed that the three primers PCR system could accurately distinguish the homozygous， heterozygous and negative genotypes of cry1Ab/cry1Ac gene. Only one 298 bp fragment was amplified in homozygote and only one 787 bp fragment was amplified in negative materials. Both 298 bp and 787 bp fragments were amplified from the heterozygote. The establishment of this system provides a simple and effective gene identification technique for molecular breeding of borer-resistant rice using TT51-1.

Key words： transgenic rice; multiplex PCR; cry1Ab/cry1Ac; TT51-1; Huahui No.1

稻縱卷葉螟、二化螟和三化螟是水稻（Oryza sativa L.）的主要害蟲，其危害會(huì)造成葉片枯白、枯心苗、白穗，癟谷大量增加，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量。轉(zhuǎn)Bt毒蛋白基因水稻對(duì)稻縱卷葉螟、二化螟和三化螟具有良好的抗性，種植Bt水稻既可以有效避免稻縱卷葉螟、二化螟和三化螟對(duì)水稻的危害，又可以減少殺蟲劑的使用，減輕環(huán)境污染。水稻科學(xué)家們已經(jīng)培育出一系列Bt基因水稻[1-4]，這些Bt水稻為培育抗螟蟲水稻新品種提供了種質(zhì)資源。轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因抗蟲水稻華恢1號(hào)是華中農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的無標(biāo)記基因抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻品系，該品系已獲得國家轉(zhuǎn)基因水稻安全證書，同華恢1號(hào)的無標(biāo)記基因株系為TT51-1。國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)實(shí)施以來，現(xiàn)有數(shù)十個(gè)國家級(jí)及省級(jí)研究機(jī)構(gòu)和高等院校以TT51-1作為抗蟲水稻育種的基因供體親本，優(yōu)良常規(guī)水稻品種（品系）作受體親本進(jìn)行雜交（回交）選育，在選育過程中利用分子標(biāo)記對(duì)抗蟲基因進(jìn)行跟蹤，從而選育出抗螟蟲的優(yōu)良水稻新品種（品系）。目前所用的檢測(cè)cry1Ab/cry1Ac基因的分子標(biāo)記主要是根據(jù)導(dǎo)入的外源基因片段序列設(shè)計(jì)的特異顯性標(biāo)記，該標(biāo)記只能檢測(cè)目標(biāo)基因的有無，不能區(qū)分雜合基因型和純合基因型，需要在下一代對(duì)基因型進(jìn)行驗(yàn)證，因此顯性標(biāo)記檢測(cè)效率低、耗費(fèi)時(shí)力。多重PCR標(biāo)記可以有效鑒別雜合基因型和純合基因型，提高選擇效率，加快育種進(jìn)程[5-7]。

本研究根據(jù)TT51-1中插入的外源基因左側(cè)水稻基因組序列設(shè)計(jì)一個(gè)正向引物P1，根據(jù)插入位點(diǎn)右旁側(cè)水稻基因組序列設(shè)計(jì)一個(gè)反向引物P3，在插入的外源基因序列靠近左側(cè)水稻基因組處設(shè)計(jì)一個(gè)反向引物P2。利用三引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，在非轉(zhuǎn)基因水稻和純合轉(zhuǎn)基因水稻中分別擴(kuò)增出大小不同的一個(gè)片段，在轉(zhuǎn)基因雜合體中同時(shí)擴(kuò)增出兩個(gè)片段。因此該體系可以鑒定出轉(zhuǎn)基因純合、轉(zhuǎn)基因雜合和轉(zhuǎn)基因陰性三種基因型，為利用TT51-1進(jìn)行抗螟蟲水稻分子育種提供了一個(gè)簡(jiǎn)便有效的基因鑒定技術(shù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?水稻材料 ?轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因抗蟲水稻TT51-1（純合系）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家植物基因研究中心（武漢）提供。非轉(zhuǎn)基因水稻R650由湖北省糧食作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

以非轉(zhuǎn)基因水稻R650母本，TT51-1為父本進(jìn)行雜交，獲得cry1Ab/cry1Ac基因雜合的F1代，F(xiàn)1代與R650回交獲得BC2F1代，分子標(biāo)記檢測(cè)陽性單株繼續(xù)回交獲得BC3F1代，根據(jù)分子檢測(cè)和農(nóng)藝性狀考察結(jié)果，在BC3F1代中收獲陽性單株20株。種植20個(gè)BC3F1單株的種子獲得BC3F2群體，對(duì)該群體單株進(jìn)行三引物PCR檢測(cè)，選擇30個(gè)Bt陽性單株收種并種植該30個(gè)單株種子成30個(gè)BC3F3株系，通過三引物檢測(cè)獲得外源基因純合的株系。

1.1.2 ?試劑 ?DNA提取和PCR檢測(cè)試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?DNA提取 ?取1～2 cm長(zhǎng)的水稻幼嫩葉片置于2 mL圓底離心管中，加入2×CTAB 400 μL后在QIAGEN Tissue lyser樣品研磨儀中磨碎勻漿，置60 ℃水浴20 min，加入400 μL氯仿/異戊醇（24∶1）震蕩混勻10 min，10 000 r/min離心10 min，取200 μL上清置于另一加有400 μL 95%預(yù)冷乙醇溶液的1.5 mL離心管，靜置10 min，13 000 r/min離心10 min，棄上清后晾干，加入50 μL滅菌的超純水溶解。

1.2.2 ?三引物設(shè)計(jì) ?在轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因抗蟲水稻TT51-1中T-DNA靠近右側(cè)水稻基因組處設(shè)計(jì)一條正向引物P1，序列為5-ataataccgcgccacatagc-3。T-DNA序列左側(cè)水稻基因組序列中設(shè)計(jì)一條正向引物P3，序列為5-tcttccctagggcaaagtca-3;在T-DNA序列右側(cè)水稻基因組序列中設(shè)計(jì)一條反向引物P2，序列為5-aaaaacagagcctcgttgga-3。T-DNA的插入位點(diǎn)和引物位置見圖1a，T-DNA的側(cè)翼序列見圖1b。在非轉(zhuǎn)基因水稻中，P3+P2擴(kuò)增出一條787 bp的PCR產(chǎn)物;在轉(zhuǎn)基因純合體中，P1+P2擴(kuò)增出一條298 bp的PCR產(chǎn)物，由于T-DNA序列過長(zhǎng)，P3+P2沒有擴(kuò)增產(chǎn)物。在轉(zhuǎn)基因雜合體中同時(shí)擴(kuò)增出787 bp和298 bp的2條PCR產(chǎn)物。

1.2.3 ?三引物多重PCR檢測(cè)體系 ?PCR反應(yīng)體系為15 μL，包含10×PCR 緩沖液（含Mg2+）1.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.2 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL，DNA模板1 μL和適當(dāng)量的三引物P1、P2、P3。P1、P2和P3濃度為10 μmol/L，P1、P2、P3引物使用量分別為0.15、0.30、0.15 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性40 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?二引物及三引物PCR體系對(duì)水稻材料擴(kuò)增的特異性

以轉(zhuǎn)基因材料TT51-1、非轉(zhuǎn)基因水稻R650及TT51-1×R650的F1 DNA為模板，利用二引物P1+P2、P3+P2及三引物P1+P2+P3體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖2。用P1+P2二引物體系時(shí)，在轉(zhuǎn)基因材料TT51-1、TT51-1×R650的F1 DNA中擴(kuò)增出一條約298 bp的片段，在非轉(zhuǎn)基因材料R650中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物（圖2a）;用P3+P2二引物體系時(shí)，在轉(zhuǎn)基因材料TT51-1中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，在非轉(zhuǎn)基因材料R650、TT51-1×R650的F1 DNA中擴(kuò)增出一條約787 bp的片段（圖2b）;用P1+P2+P3體系進(jìn)行PCR時(shí)，在轉(zhuǎn)基因材料TT51-1中擴(kuò)增出一條約298 bp的片段，非轉(zhuǎn)基因材料R650中擴(kuò)增出一條約787 bp的片段，在TT51-1×R650的F1 DNA中能同時(shí)擴(kuò)增出298 bp和787 bp兩條片段。

2.2 ?三引物多重PCR擴(kuò)增體系在轉(zhuǎn)基因后代材料中的驗(yàn)證

利用二引物P1+P2、P3+P2及三重引物P1+P2+P3 PCR擴(kuò)增體系對(duì)TT51-1與非轉(zhuǎn)基因水稻R650回交后代BC3F2 8個(gè)不同單株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖3a、圖3b、圖3c。利用二引物PCR檢測(cè)時(shí)，在TT51-1中僅能擴(kuò)增出一條298 bp的陽性片段，在R650僅能擴(kuò)增出787 bp陰性片段;二引物PCR對(duì)回交后代BC3F2不同單株進(jìn)行檢測(cè)，所有株系只能顯示一條帶（圖3a、圖3b），僅能檢測(cè)轉(zhuǎn)基因后代外源基因的有無，不能區(qū)分轉(zhuǎn)基因是雜合還是純合;而利用三引物檢測(cè)，同二引物檢測(cè)結(jié)果一樣，在TT51-1中僅能擴(kuò)增出一條298 bp的片段，在R650僅能擴(kuò)增出787 bp陰性片段;轉(zhuǎn)基因純合單株能擴(kuò)增出一條陽性片段，轉(zhuǎn)基因陰性株系只能擴(kuò)增出一條陰性片段，而轉(zhuǎn)基因雜合株系能同時(shí)擴(kuò)增出298 bp和787 bp的片段（圖3c）。檢測(cè)結(jié)果表明，這些材料中該三因素PCR擴(kuò)增體系可以準(zhǔn)確地區(qū)分轉(zhuǎn)基因雜合體、轉(zhuǎn)基因陽性純合體和轉(zhuǎn)基因陰性純合材料。

收獲8株的BC3F2種子種植為BC3F3代株系，取20株進(jìn)行三引物PCR檢測(cè)（圖4）。結(jié)果表明， 來自BC3F2代轉(zhuǎn)基因純合和轉(zhuǎn)基因陰性單株的BC3F3家系目標(biāo)基因穩(wěn)定，為轉(zhuǎn)基因純合和轉(zhuǎn)基因陰性基因型（圖4a、圖4b），而來自BC3F2代轉(zhuǎn)基因雜合單株的BC3F3家系中目標(biāo)基因發(fā)生分離，出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因雜合、轉(zhuǎn)基因純合和轉(zhuǎn)基因陰性單株（圖4c）。結(jié)果表明，利用該三引物多重PCR擴(kuò)增體系可以準(zhǔn)確地鑒定出TT51-1及其衍生的后代材料中轉(zhuǎn)基因雜合、轉(zhuǎn)基因純合和轉(zhuǎn)基因陰性植株。

3 ?討論

建立了用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1及其回交后代材料中外源基因的三引物多重PCR檢測(cè)體系，該體系可以準(zhǔn)確簡(jiǎn)便地區(qū)分出轉(zhuǎn)基因雜合、轉(zhuǎn)基因純合和轉(zhuǎn)基因陰性3種基因型，為利用TT51-1進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種提供了一種簡(jiǎn)單有效地鑒別植株基因型的技術(shù)方法。

多重PCR技術(shù)利用一次PCR反應(yīng)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)DNA片段，相比傳統(tǒng)PCR省時(shí)省力。該技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)，主要是用于同時(shí)檢測(cè)多個(gè)外源基因成分的存在[8-10]，也有利用外源基因插入的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)共顯性引物標(biāo)記進(jìn)行多重PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的基因型[5-7]。但不同的外源基因，不同的轉(zhuǎn)化事件，其涉及的DNA序列不同，引物也就不同，PCR反應(yīng)條件也不相同。

本研究根據(jù)TT51-1中特異轉(zhuǎn)化事件，設(shè)計(jì)了3個(gè)特異引物，通過對(duì)轉(zhuǎn)基因供體、轉(zhuǎn)基因受體及回交后代不同單株的擴(kuò)增驗(yàn)證，證明該體系可簡(jiǎn)單有效地應(yīng)用于TT51-1及其衍生材料中外源基因型的檢測(cè)。

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